β (TCR α β )，抗 CD123 (9F5)，抗 CD34 (8G12)和抗 CD38 (HIT2)购自 BD Biosciences。 生物素化的抗Fe购自Jackson ImmunoResearch Laboratories。生物素化的西安昔 单抗（Erbitux)购自COH药房且先前已描述过[20]。生物素化的抗⑶2,抗⑶3,抗 CD7,抗 CD10,抗 CDllb,抗 CD19,抗 CD33 和抗 CD235A 购自 eBioscience。数据采集在 FACSCalibur, LSRII (BD Biosciences)或 MACSQuant Analyzer (Miltenyi Biotec)上进行 并使用 FCS Express 版本 3 (De Novo Software)分析。
[0119] 用CD123转染293T细胞·使用聚合酶链式反应和引物（CD123-F:5'-ATAAGGCCTG CCGCCACCATGGTCCTCCTTTGGCTCACG-3 ' 和 CD 123-R 5 '-ATAGCTAGCTCAAGTTTTCTGCACGACCTGTA CTTC-3'），从 CD123-pMD18-T(Sino Biological Inc.)扩增 CD123cDNA。使用 StuI 和 NheI 限制位点将 PCR 产物克隆到 pMGPac 中。使用 Lipofectamine 2000 (Life Technologies) 按照制造商的用法说明转染293T细胞。转染后24小时，通过流式细胞术确认⑶123的表 达。
[0120] 慢病毒载体的生成.为了生成本研究中使用的CAR构建体，合成密码子优 化的DNA序列（GENEART)并使用NheI和RsrII位点克隆到CDl9RCAR-T2AEGFRt_ epHIV7 [20]中代替⑶19RCAR，所述DNA序列编码VH和VL链、经修饰的IgG4铰链和经修 饰的CD28跨膜域（RLLH - RGGH[22])。慢病毒通过使用CalPhosTM哺乳动物细胞转染 试剂盒（Clontech)用慢病毒载体和包装载体pCMV-Rev2、pCHGP-2和pCMV-G转染293T 细胞产生。这些26292和32716CAR构建体在本文中也称为26292CAR(S228P+L235E) 或 26292CAR(S228P+L235E+N297Q)(图 11 和 13)和 32716CAR(S228P+L235E)或 32716CAR(S228P+L235E+N297Q)(图10和12)。在转染后24、48和72小时收获慢病毒上清 液并通过超滤浓缩。
[0121] 转导健康供体和AML患者PBMC.去识别的（deidentified)PBMC按照机构审查委 员会批准的方案获自知情同意健康供体和患者。对于健康供体，T细胞使用0KT3 (30ng/ml) 在每周3次用25U/ml IL-2和0· 5ng/ml IL-15补充的CM(本文中称为T细胞培养基）中 活化。活化后72小时，将T细胞用慢病毒以MOI = 3旋转接种（spinoculate)，其通过以 800g在32°C离心30分钟。在慢病毒转导后12-14天通过流式细胞术分析CAR表达。如先 前描述的[20]，富集表达EGFRt的T细胞。通过快速扩增方法[23]在T细胞培养基中扩增 T细胞。
[0122] 对于来自AML患者的T细胞的遗传修饰，使用Dynabeads? Human T-Expander ⑶3/⑶28 (Life Technologies)以3:1的珠：⑶3+细胞比在T细胞培养基中刺激融化的外 周血或血浆分离置换产物（apheresis product)。珠刺激后72小时，将细胞以MOI = 3用 慢病毒旋转接种。初始刺激后9-14天使用DynaMag?_50磁体（Life Technologies)除去 珠，并在T细胞培养基中维持T细胞。在杀伤测定法中使用之前，未对表达CAR的AML患者 来源的T细胞系进行免疫磁性选择。
[0123] CFSE增殖测定法.将T细胞用0.5μM羧基萤光素琥珀酰亚胺酯（CFSE;Molecular Probes)按制造商用法说明标记。将经标记的T细胞与或不与刺激细胞（E:T比为2:1)在 补充有lOU/ml IL-2的CM中共培养。在72-96小时后，收获细胞并用生物素化西妥昔单抗 以及碘化丙啶或DAPI染色以从分析排除死细胞。通过流式细胞术分析样品以通过CFSE稀 释评估活EGFRt阳性细胞的增殖。
[0124] 络释放测定和细胞因子分泌测定.将革E细胞用51Cr (PerkinElmer)标记1小时， 清洗5次，并与效应细胞一起以多种效应器对靶物（E:T)比以5X103细胞/孔一式三份等分 取样。在4小时共培养后，收获上清液并使用gamma计数器或Topcount (PerkinElmer)测 量放射性。如先前描述的[24]，计算百分比特异性裂解。如先前描述的[25]，在以10:1E:T 比共培养24小时之后测量细胞因子产生。
[0125] ⑶107a脱粒和胞内细胞因子产生.将T细胞以2:1的E:T与靶细胞在37°C在存 在GolgiStop?(BD Biosciences)和抗⑶107a克隆H4A3或同种型匹配的对照抗体的情况下 共培养6小时。在完成6小时温育时，收获细胞，清洗并用抗CD3、CD4、CD8和生物素化西妥 昔单抗染色，接着使用缀合有PE的链霉亲合素蛋白次级染色。然后，固定细胞和按照制造 商用法说明渗透化（Cytofix/Cytoperm? BD Biosciences)并用抗 IFN__(BD Biosciences 克隆B27)和抗TNF-a (BD Biosciences克隆MAbll)染色。数据采集使用MACSQuant分析 仪（Miltenyi Biotec)进行并使用 FCS Express 版本 3 (De Novo Software)完成分析。
[0126] 集落形成细胞测定法.使用免疫磁性柱分离（Miltenyi Biotech)从脐带血（CB) 单核细胞或原代AML样品选择⑶34+细胞。将IO3个⑶34+CB细胞与25X10 3效应细胞共培 养4小时，接着铺板于双份孔中的半固体甲基纤维素祖细胞培养基中[26]。14至18天后， 计算集落形成单位粒细胞-巨细胞（CFU-GM)和红系爆发形成单位（burst-forming unit erythroid，BFUE)集落。对于AML样品，将5X103CD34+AML细胞与125X103效应细胞共培养 4小时，接着铺板于双份孔中的半固体甲基纤维素祖细胞培养基中。
[0127] 统计学分析.使用Graphpad Pri sm ν5· 04实施统计学分析。使用非配对 Student's t检验来鉴定治疗组之间的显著差异。
[0128] 结果
[0129] 表汰⑶123CAR的T细朐的牛成
[0130] 为了重导向T细胞特异性，开发编码⑶123CAR的慢病毒载体。每种CAR包含密码 子优化的序列，其分别编码两种CD123特异性scFv之一，26292和32716 [18]。将scFv符 合阅读框地融合至人IgG4Fc区、⑶28共刺激域和⑶3 ζ信号传导域。就在CAR序列下游是 T2A核糖体跳跃（skip)序列和截短的人EGFR(EGFRt)转导标志物（图1A)。将来自健康供 体的用0KT3刺激的PBMC用慢病毒转导并通过免疫磁性选择分离表达CAR的T细胞，其使 用生物素化的Erbitux抗体接着是用抗生物素磁珠的次级染色。在一个RHM循环后，通过 流式细胞术分析分离的细胞的CAR表面表达和T细胞表型。在来自3名健康供体的生成的 T细胞系中Fc和EGFRt表达两者均大于90%，且最终T细胞产物由⑶4和⑶8阳性T细胞 的混合物组成（图1B、1C)。
[0131] CD123CAR T细朐特异件靶向表汰CD123的肿瘤细朐系
[0132] 为了确认⑶123CAR T细胞的特异性，检查经遗传修饰的T细胞裂解瞬时转染以表 达CD123的293T细胞的能力（293T-CD123 ;图2A)。生成的两种CD123CAR T细胞均有效裂 解293T-⑶123,而非瞬时转染以表达⑶19的293T细胞，表明对⑶123的特异性识别（图 2B)。接着，研究CD123特异性T细胞对于内源表达CD123的肿瘤细胞系的体外细胞裂解能 力。通过流式细胞术确认⑶123在细胞系LCL和KGla上的表达（图2C)。两种⑶123特 异性T细胞系均有效地裂解LCL和KGla靶系，而非⑶123-K562细胞系（图2C)。配对的 ⑶19特异性T细胞有效裂解⑶19+LCL靶物，而非⑶19-KGla或K562靶物（图2D)。模拟 转导的亲本细胞仅裂解阳性对照LCL-0KT3细胞系（图2D)。
[0133] ⑶123CAR T细朐在与⑶123阳件靶细朐共培养时活化多种效应器功能
[0134] 为了检查CD123特异性T细胞的效应器功能，在与多种肿瘤细胞系共培养后测量 IFN- γ和TNF- α的分泌。表达任一⑶123CAR的T细胞产物在与⑶123+靶细胞共培养时 产生IFN- γ和TNF- α两者，而配对的⑶19特异性T细胞仅在与⑶19+LCL或LCL-0KT3细 胞系共培养时分泌这些细胞因子（图3Α)。另外，两种CD123特异性T细胞系在与⑶123+ 细胞系LCL、LCL-0KT3或KGla而非与CD123-K562细胞系共培养时增殖（图3Β)。相比之 下，配对的表达⑶19CAR的T细胞仅在与LCL或LCL-0KT3共培养时增殖（图3Β)。
[0135] CD123CAR T细朐在与原代AML样品共培养时激活多种效应器功能
[0136] ⑶123在原代AML样品上的过表达得到充分证明[27-29]，且在本研究中确认（图 14)。多面性（multifaceted) T细胞应答对于对感染和疫苗的强有力免疫应答是关键的且 还可能在CAR重导向T细胞的抗肿瘤活性中起作用[30]。为了研究⑶123CAR T细胞激活 针对原代AML样品的多种效应器途径的能力，将工程化的T细胞与3种不同的AML患者样 品（179、373和605)共培养6小时并使用多色流式细胞术（设门策略显示于图15)评估 ⑶107a的上调和IFN-γ和TNF-α的产生。⑶l〇7a的细胞表面动员（mobilization)在 ⑶123特异性T细胞的⑶4和⑶8区室两者中观察到，而配对的⑶19R T细胞没有可感知的 针对原代AML样品的脱粒（图4A，条形图）。另外，⑶107a+⑶123CAR T细胞的子群体也产 生IFN- γ、TNF- α或这两种细胞因子（图4A，饼状图）。这种多功能应答对于⑶4和⑶8 群体两者观察到（图4Α和4Β)。另外，检查了 CAR工程化的T细胞应答与原代AML样品共 培养而增殖的能力。两种⑶123特异性T细胞系均能在与AML 813或pre B-ALL 802样品 共培养后增殖（图4C)。在CD4和CD8群体两者中均观察到增殖（图16)。配对的CD19特 异性T细胞在与⑶19+pre B-ALL 802共培养而非与AML 813共培养时增殖。
[0137] 表汰CD123CAR的T细朐体外靶向原代AML细朐
[0138] CD123特异件T细朐在体外不消除脐带血细朐的集落形成
[0139] 鉴于⑶123在常见的髓性祖细胞（CMP)上表达[31]，研究了工程化的T细胞对富 集⑶34的正常脐带血（CB)样品的集落形成能力的作用。在与表达⑶123-CAR的T细胞以 25:1的E:T共培养4小时后，CB样品的髓性和红系集落形成相比于配对的⑶19R CAR T细 胞没有显著降低（图6A&B)。接着，在体外检查了 CD123特异性T细胞抑制原代克隆形成性 (clonogenic)AML细胞的生长的能力。两种⑶123CAR T细胞系相比于配对的⑶19R T细胞 均显著降低了白血病集落的形成（图6C)。显著地，CD123特异性T细胞对白血病集落形成 比正常髓性集落形成具有更大的影响（图6D，分别为69 %降低相对于31 %降低）。
[0140] 来自AML患者的T细朐可经遗传修饰以表汰CD123CAR和特异件靶向自体同源的 肿瘤细朐
[0141] 已知AML患者来源的T细胞较差地再极化肌动蛋白和与自体同源胚细胞形成缺陷 性免疫突触[32]。另外，据我们所知，源自AML患者的表达CAR的T细胞还有待描述。因此， 确定来自AML患者的T细胞是否能经遗传修饰以表达⑶123CAR。将冷藏保存的PBMC(AML 605和AML 722)或血浆分离置换产物（AML 559)用⑶3/⑶28珠刺激，并慢病毒转导以表达 CD123CAR或CD19R对照CAR。所有3种患者样品来源的T细胞均表达26292CAR(40-65 % 转导效率）、32716CAR(46-70%转导效率）和CD19R CAR。为了评估CD123特异性T细胞 杀伤原代AML细胞的能力，将配对的⑶19R CAR或⑶123CAR表达性T细胞与富集⑶34的 原代AML患者样品在4小时51Cr释放测定法中共培养。与配对的⑶19R T细胞相比，两种 CD123CAR T细胞系均有力地裂解所有测试的原代AML患者样品（图5A)。另外，尽管在表 达CD123CAR的T细胞的细胞裂解能力之间没有注意到统计学差异，但两种CD123特异性T 细胞相比于配对的CD19R-CAR T细胞展现显著增强的细胞毒性（图5B)。
[0142] 23-37%转导效率。AML患者来源的CAR T细胞的表型的代表性例子显示于图7A。 接着，在4小时51Cr释放测定法中检查AML患者来源的CAR T细胞对于自体同源的富集 CD34的靶细胞的细胞裂解潜力。所有自体同源的富集CD34的细胞均表达CD123,尽管以不 同的百分比和强度（图7B)。源自AML 605和722的T细胞有效地裂解自体同源胚细胞而 源自AML 559的T细胞展现出低水平的自体同源胚细胞裂解，可能是由于AML 559胚细胞 上⑶123的较低且异质性的表达（图7C)。
[0143] 论述
[0144] 本文中描述的实施方案包括使用来自重组免疫毒素（RIT)的scFv生成两种新的 ⑶123靶向性CAR，26292和32716,其结合不同的表位且对于⑶123具有相似的结合亲和力 [18]。当由T细胞的群体表达时，这些⑶123靶向性CAR重导向针对表达⑶123的细胞的T 细胞特异性。使用标准的4小时铬51 (51Cr)释放测定法，工程化为表达CD123CAR的健康的 供体T细胞有效裂解⑶123+细胞系和原代AML患者样品。另外，两种⑶123CAR T细胞在 与⑶123+细胞系和原代AML患者样品共培养后均激活多种效应器功能。此外，靶向⑶123 的T细胞相比于⑶19CAR T细胞未显著降低来自脐带血（CB)的集落形成单位粒细胞-巨 噬细胞（CFU-GM)或红系爆发形成单位（BFU-E)集落的数目。显著地，虽然⑶19特异性T 细胞对于原代AML样品的白血病集落形成具有极小影响，但CD123靶向性T细胞在体外显 著降低白血病集落形成。还显示AML患者来源的T细胞能表达⑶123CAR和体外裂解自体 同源胚细胞。
[0145] 表达两种⑶123特异性CAR的任一种的T细胞能特异性裂解表达⑶123的细胞系 和原代AML患者样品，并以抗原特异性方式体外激活多种效应器功能，显示两种表位均为 治疗的潜在靶物。在CDl23CAR工程化的T细胞系之间就与CD 123+细胞共培养时的靶细胞 杀伤、细胞因子分泌或增殖而言没有观察到主要差异。对此一个可能的解释是⑶123-CAR 中使用的CD123特异性scFv的结合亲和力在纳摩级范围且相差不到3倍，如此在任一 scFv 赋予的靶抗原结合中没有提供显著优势[18]。
[0146] AML细胞上多种细胞表面抗原的表达已经得到充分证明[4, 27, 34]。经由表达 CAR的T细胞靶向其中一些抗原可能不可行。例如，AML有关的抗原??Μ-3在耗尽性T细 胞（exhausted T cell)的子集上表达[35, 36]且使用CAR工程化的T细胞靶向??Μ-3可 导致该经遗传修饰的细胞的自溶。另外，⑶47遍在表达[37]且如此不太可能由CAR工程 化的T细胞靶向。CD33分化抗原主要在髓样细胞上表达，而且靶向CD33的免疫治疗物如 Gemtuzumab ozogamicin、CD33/CD3双特异性T细胞衔接抗体、和CD33CAR目前在在临床和 预临床背景中使用[17, 38, 39]。与??Μ-3相似，⑶33在T细胞的子集上表达，使得其称为 基于CAR的治疗的非理想靶物[40]