ring Harbor Laboratory Press，分子生物学中的通用方案（Current Protocols in Molecular Biology)。具体来说，杂交可以按照如下步骤进行，将一个载有 被转录的待测DNA或RNA分子的膜与一个标记探针在杂交缓冲液中进行杂交。杂交缓冲 液的组成为〇· lwt% SDS、5wt%硫酸右旋糖苷、一盒1:20的稀释抑制剂以及2~8XSSC。 20 X SSC为3M氯化钠和0. 3M柠檬酸组成的溶液。杂交温度为50~70°C。在培养几个小 时或过夜后，用清洗缓冲液清洗膜。清洗温度为室温，更优选为杂交温度。清洗缓冲液的组 成为6XSSC+0. lwt% SDS溶液，更优选为5XSSC+0. lwt% SDS。当用这种清洗缓冲液清洗 完膜后，就可以通过在DNA或RNA分子内被杂交的探针上的标记来识别DNA或RNA分子。
[0051] 本发明的第三个方面提供了一种包含本发明所述的编码单胺氧化酶的核苷酸序 列的重组表达载体。其可通过本领域常规方法将本发明所述的编码单胺氧化酶或其突变体 的核酸序列连接于各种表达载体上构建而成。所述的表达载体可为本领域常规的各种载 体，如市售的质粒、粘粒、嗤菌体或病毒载体等，优选质粒pET28a。较佳的，可通过下述方法 制得本发明的重组表达载体：将通过PCR扩增所得的核酸产物与表达载体pET28a分别用限 制性内切酶Nde I和Xho I双酶切，形成互补的粘性末端，经T4DNA连接酶连接，形成含有 本发明的单胺氧化酶基因的重组表达质粒pET28a-BYK-MA0N或含有其突变基因的重组表 达质粒。
[0052] 本发明的第四个方面提供了一种包含本发明所述的重组表达载体的重组表达转 化体。可通过将本发明的重组表达载体转化至宿主细胞中制得。所述的宿主细胞可为本 领域常规的宿主细胞，只要能满足重组表达载体可稳定地自行复制，且所携带的本发明 的单胺氧化酶基因可被有效表达即可。本发明优选大肠杆菌（E.coli)，更优选E.coli BL21 (DE3)或E. co 1 i DH5 α。将前述重组表达质粒pET28a-BYK-MA0N或其突变体转化 至E.coli BL21(DE3)中，即可获得本发明优选的基因工程菌株，即E.coli BL21(DE3)/ pET28a-BYK-MA0N或其突变体。转化方法可选择本领域常规方法，如电转法，热击法等，较佳 地选择热击法进行转化即可，热击条件较佳的是：42°C，热击90秒。
[0053] 本发明的第五方面提供一种重组单胺氧化酶的制备方法，包括培养本发明所述的 重组表达转化体，以及从培养物中获得重组单胺氧化酶。
[0054] 其中，所述的重组表达转化体同前述介绍，可通过将本发明的重组表达载体转化 至宿主细胞得到。培养重组表达转化体中所用的培养基可以是本领域常规的任何可使转 化体生长并产生本发明的单胺氧化酶的培养基，对于大肠杆菌菌株，优选LB培养基（蛋白 胨10g/L，酵母膏5g/L，NaC110g/L，pH7. 0)。培养方法和培养条件没有特殊的限制，可以根 据宿主类型和培养方法等因素的不同按本领域普通知识进行适当的选择，只要能使转化体 生长并产生本发明的单胺氧化酶即可。其他培养转化体具体操作均可按本领域常规操作进 行。对于大肠杆菌菌株，摇瓶培养发酵生产酶较佳地选用下述方法：将本发明涉及的重组大 肠杆菌（优选E. coli BL21 (DE3)/pET28a-BYK-MA0N或其突变体）接种至含卡那霉素的LB 培养基中培养，当培养液的光密度〇D_达到0. 5~0. 7 (更佳地为0. 6)时，加入终浓度为 0. 05~1. Ommol/L (更佳地是0. 2mmol/L)的异丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG)进行 诱导，诱导温度10~37°C (更佳地是25°C )，即可高效表达本发明所述重组单胺氧化酶。
[0055] 本发明中催化前手性化合物进行氧化-加成反应形成手性加成产物的催化剂，可 以是上述产生的重组单胺氧化酶的转化体的培养物，也可以是通过将该培养物离心分离后 得到的转化体细胞或者用其加工的制品。这里"加工的制品"是指由转化体细胞得到的提 取物、或通过对提取物中的单胺氧化酶进行分离和/或纯化得到的分离产品，或者通过固 定化转化体细胞或提取物或转化体的分离产品而得到的固定化制品。
[0056] 本发明的第六个方面提供了一种本发明所述的单胺氧化酶或重组单胺氧化酶在 催化前手性化合物进行氧化-加成反应形成手性加成产物中的应用。
[0057] 上述应用中，所述的氧化-加成反应的各条件可按本领域此类反应的常规条件进 行选择，优选如下：
[0058] 所述的前手性化合物为氮杂双环化合物，即式I所示的化合物：
[0059]
[0060] 其中，R1和R2独立地选自H、C1~C5烷基；A为亚甲基；，η选自0~5的整数。
[0061] 所述的前手性化合物氮杂双环化合物在单胺氧化酶作用下与氧化剂发生氧化反 应，然后与MR发生加成反应生成（1S，2S，5R)-氮杂-双环化合物，即式II所示的化合物： [0062] 12345 其中， 2 R1和R2独立地选自H、C1~C5烷基；A为亚甲基；，η选自0~5的整数； 3 R 选自-CN，-SCN、-S03Na，-S03H ; 4 Μ选自碱金属、碱土金属、Η。 5 本发明所述的消除-加成反应的各条件可按本领域此类反应的常规条件进行选 择，较佳的，所述的应用包括下述步骤：在本发明所述的单胺氧化酶和过氧化氢酶的催化 下，所述的前手性氮杂双环化合物和MR在ρΗ5. 0~8. 0的水溶液中，与氧化剂进行不对称 氧化-加成反应，形成光学手性纯的取代产物。
[0068] 其中，所述的前手性氮杂双环化合物在反应液中的较佳浓度为10~200mmol/L。 本发明的单胺氧化酶用量为催化有效量，较佳地为〇. 1~l〇g/L。过氧化氢酶的用量为催化 有效量，较佳为〇. 01~〇. lg/L。所述的水溶液可为本领域常规缓冲液,只要其pH范围在 5. 0~8. 0即可，优选磷酸盐缓冲液，如磷酸氢二钠缓冲液；磷酸盐缓冲液的浓度较佳地为 0. 05~0. lmol/L，所述的浓度是指缓冲溶液中共轭酸碱的总浓度。所述的消除-加成反应 较佳地是在振荡或搅拌条件下进行。所述的氧化-加成反应的温度较佳地为20~50°C， 更佳地为30~40°C。所述的氧化-加成反应的时间较佳地以底物剩余浓度低于5%为准。 氧化-加成反应结束后，可按本领域常规方法从反应液中提取（1S，2S，5R)-氮杂-双环化 合物。
[0069] 本发明中，使用粗酶液做催化剂，较佳地应添加辅酶。如果用静息细胞做催化剂则 不需要加辅酶，只需利用细胞内所含有的辅酶即可。
[0070] 在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实 例。
[0071] 本发明所用试剂和原料均市售可得。
[0072] 本发明的积极进步效果在于：本发明所述的单胺氧化酶可以分别接受3并5和5 并5等两种大小不同的氮杂环戊胺体系，生成相应亚胺；亚胺产物可接受氰化物的加成，因 此可以在酶催化体系中加入氰化物，加成产物直接在盐酸-醇溶液中醇解得到氨基酸甲酯 的盐酸盐，从而实现一锅法投料，简化了反应工艺，更加适合工业化生产的进行。
【附图说明】
[0073] 图1单胺氧化酶基因 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图。Μ为DNA分子量标准，泳道1 为PCR扩增的单胺氧化酶基因。
[0074] 图2单胺氧化酶粗酶液的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。Μ为分子量标准，泳道1为全菌 蛋白裂解液。
【具体实施方式】
[0075] 下面通过实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未 注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0076] 实施例1单胺氧化酶的酶活力测定
[0077] 5mmol/L苄胺溶于50mmol/L磷酸盐缓冲液得到底物溶液，取lmL加入10 μ L酶 液，30°C反应 20min，加入 400μ L 二硝基苯肼（lmmol/L，溶于 3Μ HC1)，再加入 2. 4mLl. 25Μ NaOH，反应5min，在450nm波长下检测吸光值。
[0078] 光学纯度：Agilentl260 系列 HPLC，手性柱为 ChiralpakAD_H(4. 6X250mm, Diacel Chemical Ind. Ltd. )，25°C进行分析，流动相为90%正庚烷，10%乙醇，0. 1%三氟乙酸，流 速为lmL/min，检测波长为220nm。S-构型产物保留时间为7. 4min，R-构型产物保留时间 为 8.9min〇
[0079] 实施例2筛选单胺氧化酶
[0080] 从武汉大学的校园采集土壤样品DNA (Chroma Spin TE-1000, Clontech Laboratories, Inc. USA)，用Sau3AI部分酶切，电泳收集1~4kb的片段，回收并连接到 PUC19的BamHI位点，得到质粒文库；将文库转化到E. coli DHlOb，涂布到含有100 μ g/mL 氨苄青霉素的LB平板，挑选阳性克隆到加有500 μ L LB (100 μ g/mL氨苄青霉素）的96深孔 板，37°C培养4小时后加 lmmol/L IPTG诱导，30