°C继续培养过夜，然后各取10 μ L深孔培养 物到含有50mmol/L磷酸钠缓冲液（ρΗ7. 5)的新的96孔板，-80°C反复冻融使细菌裂解，加 入5mmol/L苄胺，30°C温浴30分钟，随后加入400 μ L二硝基苯肼（lmmol/L，溶于3M HC1)， 再加入2. 4mLl. 25M NaOH，反应5min，在450nm波长下检测吸光值，挑取吸光度最高的孔所 对应的深孔培养物，提取质粒并测序，用NCBI的ORF Finder分析其开放读码框（0RF)，得到 序列SEQ ID NO: 1，其编码的多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:2。
[0081] 实施例3单胺氧化酶重组菌的构建和表达
[0082] 采用引物PF (核苷酸序列为SEQ ID N0:3)和PR (核苷酸序列为SEQ ID NO: 4) PCR 扩增单胺氧化酶全长基因（结果见图1)，PCR产物用Ndel/Xhol酶切后连接到pET28,并 转化到E. coli BL21(DE3)，在含有卡那霉素（50 μ g/mL)的LB平板培养，挑选阳性菌落到 100mL液体LB培养基进行培养，过夜培养物转入新鲜的1L LB培养液培养到0D_至0. 6~ 0. 8,加入IPTG200 μ Μ诱导蛋白表达，降温至30°C继续培养24小时。5000rpm离心收集菌 体，用0. 2M pH7. 0的磷酸钠缓冲液洗一次，lg菌体重悬于上述5mL磷酸盐缓冲液，超声波破 碎后，SDS-PAGE检验表达水平。
[0083] 实施例4 :单胺氧化酶的高密度发酵
[0084] 将实施例2获得的重组大肠杆菌接种于装有200mL LB培养基的1L摇瓶中，于 37°C，180~220rpm培养10~16h。将上述培养好的种子按10% (v/v)的比例接种于3L 上罐发酵培养基（M9培养基，含葡萄糖4g/L，磷酸氢二钠12. 8g/L，磷酸二氢钾3g/L，氯化 铵lg/L，硫酸钠0· 5g/L，氯化钙0· 0152g/L，六水氯化镁0· 41g/L)中，在25~-35°C，300~ 800rpm，空气流量2~6L/min的条件下培养。培养6~10h后，以5~20mL/h的速率流加 含60 %甘油的补料培养基，持续至发酵结束。流加补料培养基数小时至0D_达到20~40 时，添加0. 1~lmm〇l/L IPTG开始诱导。诱导5~15h后，放罐，5000rpm离心收集菌体，均 质后得到粗酶液，聚丙烯酰胺凝胶电泳检测（结果见图2)。
[0085] 实施例5单胺氧化酶的生物催化
[0086] 在50mL磷酸盐缓冲液（100mmol/L，ρΗ7· 5)中加入终浓度为100mmol/L的前手性 化合物（见表1)，加入100mL 7K，加入终浓度为1 l〇mm〇l/L的MR (见表1)，氧气保护下密封 搅拌30分钟，加入根据实施例4制备的单胺氧化酶的粗酶液至蛋白质终浓度为10g/L，加入 终浓度为〇. lg/L过氧化氢酶，控制pH值，30~50°C反应，薄层层析监测反应进程，底物剩 余低于5%时视为反应结束。反应结束后用10mL的30%次氯酸钠淬灭反应，调pH至10~ 11，用叔丁基甲醚萃取，旋干得粗产物。结果见表1。
[0087] 表1单胺氧化酶催化氧化-取代反应的结果
[0088]
【主权项】
1. 一种分离的单胺氧化酶，其是如下（a)、（b)或（c)的蛋白质： (a) 由SEQ ID N0:2所示氨基酸序列组成的蛋白质； (b) 在（a)的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸残基衍生的具有 单胺氧化酶活性的蛋白质； (c) 与（a)的氨基酸序列具有至少95%同一性且具有单胺氧化酶活性的蛋白质。2. 编码权利要求1所述的单胺氧化酶的分离的核酸。3. 根据权利要求2所述的核酸，其是由SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列组成的。4. 包含权利要求2或3所述的核酸的重组表达载体。5. 根据权利要求4所述的重组表达载体，其选自质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体。6. 根据权利要求5所述的重组表达载体，其是pET28a。7. 包含权利要求4-6任一项所述的重组表达载体的重组表达转化体。8. 根据权利要求7所述的重组表达转化体，其是大肠杆菌（E.coli)。9. 根据权利要求8所述的重组表达转化体，其是E. coli BL21(DE3)或E. coli DH5a。10. -种重组单胺氧化酶的制备方法，包括培养权利要求7-9任一项所述的重组表达 转化体，以及从培养物中获得重组单胺氧化酶。11. 一种催化前手性化合物进行氧化-加成反应形成手性加成产物的催化剂，其选自 权利要求7-9任一项所述的重组表达转化体的培养物，或通过将该培养物离心分离后得到 的转化体细胞或者用其加工的制品；优选地，所述加工的制品是由转化体细胞得到的提取 物、或通过对提取物中的单胺氧化酶进行分离和/或纯化得到的分离产品，或者通过固定 化转化体细胞或提取物或转化体的分离产品而得到的固定化制品。12. 权利要求1所述的单胺氧化酶、权利要求10所述的方法制备的重组单胺氧化酶或 权利要求11所述的催化剂在催化前手性化合物进行氧化-加成反应形成手性加成产物中 的应用。13. 根据权利要求12所述的应用，其特征在于所述前手性化合物为式I所示的化合 物：其中，R1和R2独立地选自H、C1~C5烷基；A为亚甲基；，η选自0~5的整数。14. 根据权利要求13所述的应用，其特征在于所述前手性化合物在单胺氧化酶作用下 与氧化剂发生氧化反应，然后与MR发生加成反应生成式II所示的化合物： 其中，R1和R2独立地选自H、Cl~C5烷基；A为亚甲基；，η选自0~5的整数； R 选自-CN，-SCN，-S03Na，-S03H ; Μ选自碱金属、碱土金属、Η。15. 根据权利要求14所述的应用，其特征在于所述的应用包括下述步骤：在权利要求1 所述的单胺氧化酶、权利要求10所述的方法制备的重组单胺氧化酶或权利要求11所述的 催化剂，以及过氧化氢酶的催化下，所述的前手性化合物和MR在ρΗ5. 0~8. 0的水溶液中 与氧化剂进行不对称氧化-加成反应，形成光学手性纯的取代产物。16. 根据权利要求15所述的应用，其特征在于：所述的单胺氧化酶为0. 1~10g/L ;MR 的用量为10~400mmol/L ;过氧化氢酶的用量为0. 01~0. lg/L ;所述的水溶液为pH范围 在5. 0~8. 0的缓冲液，所述缓冲液的浓度为0. 05-0. lmol/L ;所述的消除-加成反应在振 荡或搅拌条件下进行；所述的氧化-加成反应的反应温度为20~50°C。17. 根据权利要求12-16任一项所述的应用，其特征在于：所述的前手性化合物在反应 液中的浓度为10~200mmol/L。18. -种合成（1S，2R，5R)-6, 6-二甲基-3-氮杂双环[3. 1. 0]己-2-腈的方法，包括使 用权利要求1所述的单胺氧化酶、权利要求10所述的方法制备的重组单胺氧化酶或权利要 求11所述的催化剂催化6, 6-二甲基-3-氮杂双环[3. 1. 0]己烷进行氧化-取代反应。19. 根据权利要求18所述的方法，其中，反应液中含有10~200mmol/L6,6-二甲 基-3-氮杂双环[3. 1. 0]己烷、0. 1~10g/L单胺氧化酶、10~400mmol/LMCN，反应在氧化 剂存在下进行，反应温度为20~50°C。20. -种合成（lS，2aR，5aR)_八氢环戊[c]吡咯-1-腈的方法，包括使用权利要求1所 述的单胺氧化酶、权利要求10所述的方法制备的重组单胺氧化酶或权利要求11所述的催 化剂催化八氢环戊[c]吡咯进行氧化-取代反应。21. 根据权利要求20所述的方法，其中，反应液中含有10~200mmol/L5, 5-二甲基-八 氢环戊[c]吡咯、0. 1~10g/L单胺氧化酶、10~400mmol/LMCN，反应在氧化剂存在下进行， 反应温度为20~50°C。
【专利摘要】本发明提供了一种催化活性高、对映选择性强、底物耐受性好的单胺氧化酶，以及使用该酶进行酶催化合成(1S,2S,5R)-6,6-二甲基-2-取代-3-氮杂双环[3.1.0]己烷或(1S,3aR,6aS)-1-取代-八氢环戊[c]吡咯，进而进一步合成(1S,2S,5R)-6,6-二甲基-3-氮杂双环[3.1.0]己烷-2-腈及其水解产物(1S,2S,5R)-6,6-二甲基-3-氮杂双环[3.1.0]己烷-2-甲酸甲酯，或进一步合成(1S,3aR,6aS)-八氢环戊[c]吡咯-1-腈的酶-化学合成方法。还提供了编码该单胺氧化酶的基因，含有该基因的重组表达载体、重组表达转化体及其高效制备方法。本发明的单胺氧化酶可以分别接受3并5和5并5等两种大小不同的氮杂环戊胺体系，生成相应亚胺；亚胺产物可接受氰化物的加成，因此可以在酶催化体系中加入氰化物，加成产物直接在盐酸-醇溶液中醇解得到氨基酸甲酯的盐酸盐，从而实现一锅法投料，简化了反应工艺，更加适合工业化生产的进行。
【IPC分类】C12N15/53, C12N9/06, C12P17/10, C12N1/21, C12N15/70
【公开号】CN105441401
【申请号】CN201410441595
【发明人】罗煜, 丁时澄, 瞿旭东, 钱龙
【申请人】南京博优康远生物医药科技有限公司
【公开日】2016年3月30日
【申请日】2014年9月1日