别针对 HPV35、HPV39、HPV52、 HPV53、HPV56、HPV66、HPV59、HPV68、HPV82、HPV51、HPV26、HPV 73、HPV40、HPV42、HPV43、 HPV44型的特异性探针）的5'端优选使用FAM英光基团标记；
[0031] 如SEQ ID NO. 49-72、75所示的探针（HPV特异性探针）的3'端优选使用B册1浑 灭基团进行标记。
[0032] 所述核酸扩增试剂还可包括；HPV反应液A、化tstart Taq酶和UNG酶；
[0033] 其中，HPV反应液A是通过盐缓冲液将MgClz和dNTPs溶解而形成的，其中，MgClz在 HPV反应液A中的终浓度为130mM~200mM，dNTPs在HPV反应液A中的终浓度为0. 15mM~ 0. 5mM,盐缓冲液是含20mM~40mM抑8. 8Tris-肥1、50~55mM KC1的水溶液。
[0034] 其中，化tstart Taq酶的浓度优选为3~7U/test (3~7U/次检测）；UNG酶的浓 度优选为0. 1~0.抓/test (0. 1~0. 5U/次检测）。
[0035] 所述试剂盒还可包括：核酸提取试剂、HPV型别的阳性对照品和阴性对照品；其 中，所述核酸提取试剂包括；磁珠悬浮液；
[0036] HPV型别的阳性对照品中，优选地，其是由HPV多型别化PV6、11、16、42、18、52、58、 31、33、45或53型别）临床样本配制的浓度为5X ΙΟ4拷贝数/ml的阳性对照品，监控样本 测试过程的准确性。
[0037] 阴性对照品中，其是由HPV病毒阴性的脱落宫颈细胞保存液配制为阴性对照品， 监控样本测试过程的准确性。
[0038] 所述磁珠悬液，可采用商业化产品，如可包括；chemagen公司的顺磁性氧化娃纳 米磁珠的悬浮液（磁珠为购自chemagen公司的M-PVA011型号的磁珠，该磁珠可通过纳米 技术对超顺磁性纳米颗粒的表面进行改良和表面修饰后，制备成超顺磁性氧化娃纳米磁 珠）。
[0039] 所述核酸提取试剂还可包括W下组分：
[0040] 1)裂解液，其是含异硫氯酸脈和TritonX-100的溶液，或者该裂解液是含异硫氯 酸脈和Tween-20的溶液；其中，裂解液中的异硫氯酸脈的浓度为2M~6M，TritonX-100或 Tween-20的体积浓度为1 %~2% ;
[0041] 2)结合液，其是含高氯酸盐、醋酸盐和有机溶剂的水溶液；其中，高氯酸盐 包括；高氯酸钢；醋酸盐包括；醋酸钢；有机溶剂包括；己醇；高氯酸盐的浓度优选为 17g/100血~30g/100血，醋酸盐的浓度优选为lg/100血~lOg/100血，有机溶剂的体积浓 度优选为40 %~60%。
[0042] 优选地，结合液的配制方法为：取200g-300g高氯酸钢、20g-40g醋酸钢溶解于少 量纯化水中，然后加入400-600mL无水己醇，并用纯化水定容至1L即可。
[0043] 3)洗液A，其是含高氯酸钢、醋酸盐和己醇的水溶液，其中，高氯酸钢的浓度优选 为lOg/100血~30g/100血，醋酸盐（包括：醋酸钢）的浓度优选为4g/100血~15g/100血， 己醇的体积浓度优选为35%~50%。
[0044] 优选地，洗液A的配制方法为：取200g-300g高氯酸钢、40g-60g醋酸钢、溶解于少 量纯化水中，然后加入350na-500ml无水己醇，并用纯化水定容至1L即可。
[0045] 4)洗液B，其为体积浓度40%~80%的己醇；
[0046] W洗脱液，其为10~20mM P册.0的Tris-肥1。
[0047] 6)蛋白酶 K。
[0048] 7) RNA 的聚合酶 A 任oly A)。
[004引表1引物序列
[0050]
[0051]
[0054] 另外，本发明还公开了上述试剂盒的使用方法，即利用上述试剂盒检测人乳头瘤 病毒的方法，包括步骤：
[00巧]1)样本的核酸提取
[0056] 利用上述的核酸提取试剂，并按照常规的磁珠法，对保存于细胞保存液中的宫颈 脱落细胞样本进行核酸提取，得到PCR模板；
[0057] 。试剂配制
[0058] HPV 英光反应液 B1 ;HPV16、18、52、58、1C 的引物对（SEQ ID NO. 1-2、3-4、19-20、 27-28、73-74所示的引物对）和其型别对应的探针（SEQ ID NO. 49、50、58、62、75所示的探 针），各对引物浓度为80-140皿〇1/1，探针浓度为20-50皿〇1/1;
[0059] HPV 英光反应液 B2 ;HPV31、33、45、35、39、51、53、56、59、66、68、73、82、26、 1C 的引物对（沈Q ID NO. 9-10、11-12、17-18、13-14、15-16、35-36、21-22、23-24、29-30、 25-26、31-32、39-40、33-34、37-38、73-74所示的引物对）和其型别对应的探针（569 10 NO. 53、54、57、55、56、66、59、60、63、61、64、68、65、67、75 所示的探针），各对引物浓度为 80-140nmol/L，探针浓度为 20-50nmol/L ;
[0060] HPV 英光反应液 B3 ;HPV6、11、40、42、43、44、内标（1C)的引物对（SEQ ID NO. 5-6、 7-8、41-42、43-44、45-46、47-48、73-74所示的引物对）和其型别对应的探针（569 10 NO. 51、52、69、70、71、72、75所示的探针），各对引物浓度为80-140nmol/l，探针浓度为 20-50nmol/L ；
[0061] 然后，在分别含有3~5μ1英光反应液B1、B2、B3的每管中，加入14~16μ1 HPV 反应液 A、Hotstart Taq 酶 3 ~7U/test(3 ~7U/次检测）和 UNG 酶 0. 1 ~0.抓/test(0. 1 ~ 0. 5U/次检测）（如1 μ 1 Hotstart Taq酶和0. 15 μ 1 UNG酶），形成混合液；
[006引 UNG酶，在开始PCR扩增反应的第一次变性步骤之前，进行37~5(TC保温1~10 分钟。
[0063] 3) PCR 扩增
[0064] 将步骤1)得到的PCR模板加入到步骤。中的混合液中，进行PCR扩增反应，并且 阳性对照品与阴性对照品与样本同时进行PCR扩增反应；
[0065] 其中，PCR扩增方法包括：
[0066] 1、37 ~5(TC 保温 2 ~5min，1 个循环；
[0067] 11、94 ~95°C下 1 ~lOmins, 1 个循环；
[0068] 111、94~95°C下10~60s的变性步骤，50~65°C下10~60s的退火步骤，65~ 72°C下30~90s的延伸步骤，反复进行40~50个循环；
[006引 优选地，PCR扩增方法为；37°C保温2min ;94°C热变性lOmin ;94°C 10砂，55°C 10 砂，65 °C 35砂交替循环45次；
[0070] 4)在65~72°C下，将步骤3)得到的PCR扩增反应产物进行英光检测，并根据革己 标扩增曲线的Ct值及内标（1C)扩增曲线的Ct值的变化确定HPV的型别感染情况。
[0071] 再者，本发明还公开了上述试剂盒的应用，即所述试剂盒在检测低危型和高危型 人乳头瘤病毒中的应用W及所述试剂盒在对人乳头瘤病毒进行分型中的应用；
[0072] 其中，低危型人乳头瘤病毒包括；HPV6型、HPV11型、HPV40型、HPV42型、HPV43型、 HPV44 型；
[0073] 高危型人乳头瘤病毒包括；HPV16型、HPV18型、HPV52型、HPV58型、HPV31型、 HPV33 型、HPV45 型、HPV26 型、HPV35 型、HPV39 型、HPV51 型、HPV53 型、HPV56 型、HPV59 型、 HPV66 型、HPV68 型、HPV73 型、HPV82 型；
[0074] 所述试剂盒在对人乳头瘤病毒进行分型中的应用中，包括：对HPV6型和HPV11型 进行分型，W及对HPV16型、HPV18型、HPV52型、HPV58型、HPV31型、HPV33型和HPV45型 进行分型。
[0075] 本发明的试剂盒中，采用磁珠提取法用于HPV核酸提取，该法运用纳米技术对超 顺磁性纳米颗粒的表面进行改良和表面修饰后，制备成超顺磁性氧化娃纳米磁珠。该磁珠 能在微观界面上与核酸分子特异性地识别和高效结合。利用氧化娃纳米微球的超顺磁性， 在化aotropic盐（盐酸脈、异硫氯酸脈等）的作用下，使血液、动物组织、食品、病原微生物 等样本中的细胞裂解，然后向裂解液中加入磁珠，当溶液的PH值小于6. 5时，磁珠选择性的 与提取的DNA/RNA结合，此时将吸附有DNA/RNA的磁珠置于磁场中，通过缓冲液去除没有被 吸附的杂质（蛋白等），然后将磁珠置于PH值8. 5的缓冲液中，纯化的DNA/RNA即可进入缓 冲液中，然后用于作为后续PCR扩增的模板。磁珠法提取核酸既可W保证较高的核酸提取 效率，同时有利于HPV核酸检测过程自动化的实行。
[0076] 另外，本发明采用化qman定量PCR原理，W人类看家基因目-globin作为低危型 人乳头瘤病毒检测和高危型人乳头瘤病毒检测的内标，并设计针对HPV各型别序列的特异 性引物，扩增HPV型别的特异性核酸序列，并在上下游引物之间设计，针对HPV型别特异性 序列的化qman探针。针对HPV序列的探针