、检验方法
[0129] 1、HPV核酸的提取
[0130] 本试剂盒采用常规的磁珠法对HPV核酸进行提取。
[0131] 本实例用EZbeads核酸提取仪为例进行说明。
[0132] 1.1实验前准备
[0133] A.将核酸提取试剂、对照品取出，平衡至室温并縱润震荡混匀。
[0134] B.配制蛋白酶K/化ly A混合液：
[013引 蛋白酶K 5μ L
[0136]
[0137] C.在样本制备用96孔深孔反应盘中预分装下列试剂：
[0138] 表 5
[0139]
[0140] 1. 2待测样本核酸提取过程~~'
'
[0141] Α、使用细胞保存液充分洗脱宫颈刷上的宫颈脱落细胞，并在管壁上挤干。将细 胞保存液混匀后，取待测样本W及试剂盒中的阴性对照，阳性对照各200 μ L分别加入到 1.5ml离必管中，并每管中加入lOuL蛋白酶Κ/化ly A混合液，然后每管中加入200μΙ裂 解液，混合均匀后，将离必管放入金属浴保温55°C lOmin。
[0142] B、将保温完成的样本混合液离必后，分别加入到预分装试剂的反应盘A2~肥或 A8~册孔中。每块反应盘可处理16个样本。每台仪器可同时放入2个反应盘处理32个 样本。
[0143] C、将金属条对准反应盘的A6~册及A12~H12列底部，并将反应盘及金属条固 定于EZbead System-32核酸提取仪上，进行核酸提取（提取程序见表6)。
[0144] 表6提取程序
[0145]
[0146] D、待程序结束后，取下反应盘，吸取洗脱液进行PCR扩增反应。如果提取的样本当 天不进行扩增，则要放-18°C W下保存）。
[0147] 2、核酸扩增
[014引 2. 1HPV反应混合液配制：
[0149] 根据待测样本的数量，按照下列比例配制HPV反应混合液。
[0150] 表7 HPV反应管B1混合液
[0151]
[0152] 表8 HPV反应管B2混合液
[0153]
[0154] 表9 HPV反应管B3混合液
[0155]
[0156] 注；配制HPV反应混合液时，请计算阴阳性对照的数量。
[0157] 配制的HPV反应混合液需振荡混匀，离必20砂去除气泡后再分装到PCR扩增用反 应管中。
[0158] 2. 2HPV 扩增参数：
[0159] A、在PCR扩增用反应管中分装20 μ 1 HPV反应混合液（PCR扩增用反应管推荐使 用 Axygen 0. 2ml 平盖八联管，Cat No ;管 PCR-0208-C、盖 PCR-2CP-RT-C);
[0160] B、取制备好的样品40μ 1到加入上述PCR扩增反应管中，盖上盖子，轻微震荡混 匀，离必20砂去除气泡；
[0161] C、将PCR扩增用反应管放到PCR英光仪上进行扩增；
[0162] D、循环条件设置：
[0163] St巧 1 ;37°C 2min 1 个循环
[0164] Step 2 :94°C lOmin 1 个循环
[0165] Step 3 ; (94°C 10s ;55°C 10s ;65°C 35s)45 个循环
[0166] E、仪器检测通道选择；英光信层设定为FAM、ROX、肥X、CY5、TAMRA英光素，英光信 号采集设定在Step 3的65 °C ;
[0167] 样品信息设定：根据PCR英光热循环W软件要求在PCR扩增开始前或结束后进行 样品信息设定。
[0168] Η、结果判定
[0169] 3.1结果分析条件设定：
[0170] I、阔值（t虹eshold)设定；阔值设定原则W超过阴性对照曲线的最高点为基准。 不同仪器阔值表达方式不同，参考仪器软件设定。
[0171] II、基线化aseline)设定；基线设定原则W本次实验所有样本指数扩增前英光信 号稳定的区域。起始点循环数一般从3~5个循环开始，终止点循环数一般选在最早出现 指数扩增前1~2个循环（如第15个循环）。对于能自动给出实验结果基线的仪器，W仪 器软件给出的基线为基准。
[0172] 3. 2质控标准：
[017引 阴性对照品；内标（肥讶Ct值小于40，祀标（FAM、ROX、CY5、TAMRA) Ct值应大于45。
[0174] 阳性对照品；内标（肥讶Ct值小于40，祀标（FAM、R0X、CY5、TAMRA) Ct值应小于40。
[0175] 3. 3检验结果的解释
[0176] 根据设置的基线和阔值，仪器自动显示检测Ct值。根据Ct值即可进行结果判断， 按照下表报告检测结果。
[0177] 表 10 [017 引
[0179] 本试剂盒的定性检测下限可为1. 0X 1〇3拷贝数/ml,低于定性检测下限的结果仅 供参考，高于定性检测上线的结果要想准确定量，可梯度稀释后进行测定，测定结果乘W稀 释倍数校正后报告结果。另外，本试剂盒可对16、18、6、11、31、33、45、52、58等进行准确分 型。
[0180] 实施例1使用上述试剂盒检测临床样本中的HPV感染情况
[0181] 用上述试剂盒对100例阳性临床样本进行检测，所有样本均采用金标准测序法进 行验证，检测结果和分析结果见下表。
[0182] 使用上述试剂盒检测临床样本中HPV感染情况。
[018引 表11
[0184]
[0185]
[0186]
77 I巧府件I册V 59
[0187]
[018引上述试剂盒检测结果与测序结果对比见下表：
[0189] 表 12
[0190]
[0191] 注：上述试剂盒未检测到的该临床样本型别为试剂盒检测范围之外的HPV型别。
[0192] 上述试剂盒对100例阳性临床样本进行检测，对于检测范围之内的HPV型别 (HPV16、18、52、58、31、33、45、6、11、35、39、51、53、56、59、66、68、73、82、26、40、42、43、44)具 有较好的检测能力，对于试剂盒检测范围之外的其他型别，本试剂盒的检测结果为阴性，阴 性符合率100%，特异性较高。
[0193] 实施例2使用上述试剂盒检测临床混合感染样本中的HPV感染情况。
[0194] 对收集的50例混合感染样本分别进行检测，检测结果如下：
[0195] 表 13
[0196]
[0197]
[019 引
[0199] 50例混合感染样本中，上述试剂盒的检测结果与取样单位给定的结果相同，检测 范围内的HPV基因型可W准确检出，个别稀有样本在本次收集样本中未包含。
[0200] 综上所述，本实施例中的试剂盒的性能指标如下：
[020。 1)灵敏度：本试剂盒能稳定检出的HPV的最低检出限为；1. 0X 103copies/ml。图 1-5给出了上述试剂盒对HPV各型别最低检测限化0D)的检测。
[0202] 2)基因型检测；本品可用于 26、31、33、35、39、52、53、56、58、59、66、68、73、82、16、 18、6、11、40、42、43、44型别 HPV感染的检测，并可对 16、18、6、11、31、33、45、52、58进行准确 分型。
[020引如精密性；对精密性参考品测定结果应符合Ct值的变异系数（CV，％ )《15%。
[0204] 4)准确性；本试剂盒检测HPV病原体的准确性大98 % W上。
[0205] 5)特异性；本试剂盒检测HPV病原体的准确性大99% W上。
[0206] 6)干扰试验；试剂盒检测不受样本中全血、抗病毒药物、阴道分泌物的影响。
[0207] 7)交叉反应；试剂盒对奈瑟淋球菌、沙眼衣原体、解脈衣原体、巨细胞病毒、邸病 毒、单纯疮疹病毒I型、单纯疮疹病毒II型、HIV-1型病毒、阴道毛滴虫、白色念珠菌、金黄 色葡萄球菌、梅毒螺旋体等均无特异性扩增。
[020引第二实施方式
[0209] 本实施方式中，提供一种人乳头瘤病毒（HPV)的核酸检测试剂盒，其仅含有第一 实施方式的引物对和探针（但各对引物浓度为100或140nmol/l，探针浓度为30或50nmol/ L)，或者仅含有第一实施方式的核酸扩增试剂。
[0210] 第Η实施方式
[0211] 本实施方式中，提供一种HPV的核酸检测试剂盒，其含有：第一实施方式的核酸扩 增试剂、核酸提取试剂、HPV型别的阳性对照品和阴性对照品；
[0212] 但核酸扩增试剂、核酸提取试剂中的组分浓度变更成如下形式：
[0引引 1)核酸扩增试剂中的HPV反应液A
[0214] MgClz在HPV反应液A中的终浓度为130mM或200mM，dNTPs在HPV反应液A中的 终浓度为0. 15mM或0. 3mM,盐缓冲液是含30mM或40mM P册.8Tris-肥l、55mM KC1的水溶 液；
[0215] 2)核酸提取试剂
[0216] 裂解液是含异硫氯酸脈和TritonX-100的溶液，或者该裂解液是含异硫氯酸脈 和Tween-20的溶液；其中，裂解液中的异硫氯酸脈的浓度为2M或6M，TritonX-100或 Tween-20的体积浓度为1 %或2% ;
[0217] 结合液中的高氯酸盐的浓度为17g/100血或30g/100血、醋酸盐的浓