化，将其添加到90化的由 分析缓冲液B配制成的20μΜ巧光基质(MOCAc -Pro -Leu -Gly -Leu-A2pr(D吨）一Ala - Arg-N此、肤研究所#3163-v)中，在37°C下反应5小时。然后，用巧光强度计（实验室系统， Fluoroskan Ascent)在激发波长为320nm、测定波长为405nm的条件下进行测定，求出酶活 性。
[0201] 由被验物质存在和不存在状态下的酶活性求出阻碍率，算出50%抑制浓度(IC50)。
[0202] MMP-9阻碍实验
[0203] 将90化（11雌）的人MMP-9(Ca化iochem#444231)与 10化的lOmM ΑΡΜΑ混合，通过在 37°C下反应2小时来活化。将10化该酶液用分析缓冲液A稀释至90化，将其添加到90化的由 分析缓冲液B配制成的20μΜ巧光基质（D叩一Pro-畑a-Gly-Cys(Me)-His-Ala-Lys (Nma)-NH2)中，在37°C下反应4小时。然后，用巧光强度计（实验室系统，Fluoroskan Ascent)在激发波长为355nm、测定波长为460nm的条件下进行测定，求出酶活性。
[0204] 由被验物质存在和不存在状态下的酶活性求出阻碍率，算出50%抑制浓度(IC50)。
[0205] MMP-13阻碍实验
[0206] 将90yL(130ng)的人MMP-13(Ca化iochem#444287)与 10化的lOmM ΑΡΜΑ混合，通过 在37°C下反应1小时来活化。将10化该酶液用分析缓冲液A稀释至90化，将其添加到90化的 由分析缓冲液B配制成的20μΜ巧光基质（D吨一Pro -化a-Gly -切s(Me)-His-Ala -Lys (Nma)-NH2)中，在37°C下反应4小时。然后，用巧光强度计（实验室系统，Fluoroskan Ascent)在激发波长为355nm、测定波长为460nm的条件测定，求出酶活性。
[0207]由被验物质存在和不存在状态下的酶活性求出阻碍率，算出50%抑制浓度(IC50)。 [020引 MMP-14阻碍实验
[0209] 将90化（1.9叫）的由分析缓冲液A配制成的人MMP-14(Ca化iochem#475935)添加 到90化的由分析缓冲液B配制成的20μΜ巧光基质（D吨一Pro-化a-Gly-切8(16)-化3 - Ala-Lys(Nma)-NH2)中，在37°C下反应5小时。然后，用巧光强度计（实验室系统， Fluoroskan Ascent)在激发波长为355nm、测定波长为460nm的条件测定，求出酶活性。
[0210] 由被验物质存在和不存在状态下的酶棘性求出阻碍率，算出50%抑审峨度(IC50)。 MMP-17阻碍实验
[0212] 将90化(5.8叫）的由分析缓冲液A配制成的人MMP-17(Ca化iochem#475940)添加 到90化的由分析缓冲液B配制成的20μΜ巧光基质（M0CAc-Pr〇-Leu-Gly-Leu-A2pr (化p)-Ala-Arg-N此、肤研究所#3163-v)中，在室溫下反应5小时。然后，用巧光强度计 (实验室系统，Fluoroskan Ascent)在激发波长为32化m、测定波长为405nm的条件测定，求 出酶活性。
[0213] 由被验物质存在和不存在状态下的酶棘性求出阻碍率，算出50%抑审峨度(IC50)。
[0214] 由本试验得到的本发明的（+ ) -5-(3,4-二氣苯基）一5 - [(3-甲基一2-氧化 晚一1 (2H)-基）甲基]咪挫烧一2，4-二酬对MMPs的50 %阻碍浓度示于表1。
[0別引[表1]
[0216] 表1
[0217]
脚引试验例3
[0219] 由小鼠 TPA(12-0-十四烧酷佛波醇一13-乙酸醋）单次涂抹而诱发的耳廓浮肿 抑制实验（WTNF-a相关的皮肤炎症模型进行的体内药效试验）
[0220] 分别在BALB/c小鼠的左耳内外两侧各涂抹TPA的54μπιο 1 /L丙酬溶液1 ΟμΙ (1. OSnmol ΤΡΑ/耳廓），诱发耳廓浮肿。非诱发组用丙酬来替代ΤΡΑ的54皿ol/L丙酬溶液同 样地涂抹。被验物质是用含有10体积％DMS0的丙酬(经皮给药介质)配制成被验物质的Iw/ V%溶液，ΤΡΑ涂抹前1小时分别在小鼠左耳内外两侧各涂抹10化。对照组是用经皮给药介质 代替被验物质的溶液同样地涂抹。依那西普组是在ΤΡΑ涂抹前日和涂抹前1.5小时静脉给药 5mg/mL的依那西普溶液0.2mL(lmg/只）。人IgG化IgG)组（依那西普的对照组）是静脉给药 5mg/mL的hIgG溶液0.2mL( Img/只）dTPA涂抹前日和涂抹后6小时，乙酸麻醉下测定耳廓厚 度，将耳廓厚度的增加量作为指标来评价被验物质的耳廓浮肿抑制作用。
[0221] 被验物质的耳廓浮肿抑制率（％ )用被验物质给药组耳廓厚度的增加量的平均值 (A)、非诱发组耳廓厚度的增加量的平均值(B)和对照组耳廓厚度的增加量的平均值(C)，通 过下式算出。
[0222] 被验物质的耳廓浮肿抑制率（％ ) = (C-AV(C-B) X 100
[0223] A:被验物质给药组的耳廓厚度的增加量的平均值
[0224] B:非诱发组耳廓厚度的增加量的平均值
[0225] C:对照组耳廓厚度的增加量的平均值
[0226] 依那西普的耳廓浮肿抑制率（％ )用非诱发组耳廓厚度的增加量的平均值(B)、依 那西普组耳廓厚度的增加量的平均值(D)和hIgG组耳廓厚度的增加量的平均值巧），通过下 式算出。
[0227] 依那西普耳廓浮肿抑制率（％ )=化一D)AE-B) X 100 [02%] D:依那西普组耳廓厚度的增加量的平均值
[0229] E:hIgG组耳廓厚度的增加量的平均值
[0230] 另外，将各被验物质的耳廓浮肿抑制率（％)与作为阳性对照的同一试验中的依那 西普的耳廓浮肿抑制率（％ )进行比较，通过下式分别算出依那西普比。
[0231 ]依那西普比=被验物质的耳廓浮肿抑制率（％ )/依那西普的耳廓浮肿抑制率（％ )
[0232] 由本试验得到的本发明的（+ ) -5 - (3，4一二氣苯基）一5 - [ (3 -甲基一2 -氧化 晚一U2H)-基）甲基]咪挫烧一2,4-二酬的耳廓浮肿抑制率（％ )为62%，其依那西普比为 3.4。
[0233] 本发明的化合物通过经皮给药显示出比已经上市的介由TNF-a的疾病用药剂依 那西普的静脉给药更优异的效果。
[OZ34] 试验例4
[0235] 无毛小鼠经皮给药PK试验 隣]静脉给药方法
[0237]通过尾静脉向二乙酸麻醉下的无毛小鼠（摄食）单次静脉给药被验物质（0.1~ 0.5mg/5mL/kg)。
[0淵]经皮给药方法
[0239] 使用油性笔在二乙酸麻醉下的无毛小鼠（摄食）的背部皮肤上标记出给药部位 4cm2(2cmX2cm)。在给药部位涂抹被验物质50化/动物（Iw/v%聚乙二醇400溶液）。用双面 胶将约2cmX2cm的纱布(BEMC0T(注册商标））固定在约4cmX4cm的聚乙締片上，将纱布面覆 盖在被验物质涂抹面上。在其上贴附粘附性伸缩細带化lastopore、约10cm)，固定并保护被 验物质涂抹面。然后返回笼中单独饲养。给药后24小时确认正常进行封闭涂抹。
[0240] 采血方法
[0241] 用剌刀切开无麻醉状态下的小鼠的尾静脉，用微量吸管从尾静脉采血。静脉给药 的采血时间点为给药后5分钟、15分钟、30分钟、1小时、3小时和6小时，各从2只小鼠采血。经 皮给药的采血时间点为给药后30分钟、1小时、3小时、6小时和24小时，各从2只小鼠采血。各 时间点的采血量分别为约30~50化。将血液移入添加了 2化肝素钢（1000单位/mL)的试管 中，离屯、分离(4°C、19200 X g、10分钟），获得血浆。血浆在设定溫度一30°C的冷冻室内冷冻 保存。
[02创血浆中被验物质浓度的测定方法
[0243] 将按照所述方法得到的冷冻保存的血浆在室溫下解冻，用甲醇去除蛋白后，测定 被验物质的血浆中浓度。血浆中浓度的测定使用CTC分析公司（CTC Anal八iCS)制HTC PAL 高通量LC注入系统、赛默飞科技公司制Accela和TSQ如ant皿叫tra。
[0244] 经皮吸收率的计算方法
[0245] 通过由上述方法获得的血浆中的被验物质浓度，算出AUC(血浆中浓度曲线下面 积），用下式算出经皮吸收率。
[0246] 经皮吸收率（％ ) = ((Div X AUCpc)/(Dpc X AUCiv)) X 100
[0247] Div:静脉给药时被验物质的给药量
[0248] 化C:经皮给药时被验物质的给药量
[0249] AUCiv:静脉给药后被验物质的血浆中浓度曲线下面积
[0250] AUCpc:经皮给药后被验物质的血浆中浓度曲线下面积
[0251 ]通过上述试验，确认本发明的化合物具有经皮给药的经皮吸收性。因此，可W确认 本发明的化合物也具有良好的皮肤透过性。
[0巧。试验例5
[0洗]对日本药典崩解试验液第2液的溶解性试验
[0254] 校准曲线用试样溶液的配制
[0255] 正确称量10.0 mg的被验物质，加入1 OmL甲醇后，稀释10倍，配制10化g/mL的溶液。
[0就]溶解度测定用试样溶液的制备
[0257]在离屯、管中量取5. Omg的被验物质，加入5. OmL日本药典崩解试验液第2液，施加超 声波3分钟后振荡2小时。使用滤膜(0.2μπι)对该溶液进行过滤后，正确量取滤液5(K)yL，加入 50化L乙腊并充分揽拌，得到试样溶液。
[0測]日本药典崩解试验液第2液(P册.8)的配制方法
[0巧9] 向250mL的0.2mol/L憐酸二氨钟水溶液中加入118mL的0.2mol/L氨氧化钢水溶液 和水并调整至lOOOmL。
[0260] 对日本药典崩解试验液第2液溶解度的测定方法
[0261] 利用高效液相色谱对校准曲线用试样溶液和溶解度测定用试样溶液进行各2次测 量，分别计算平均面积。
[026。对日本药典崩解试验液第2液溶解度的计算方法
[0263] 基于通过上述方法得到的各平均面积，利用下式计算溶解度。
[0264] 对日本药典崩解试验液第2液的溶解度(μg/mL) = ((PX2)/S)X100
[0265] S:校准曲线用试样溶液的平均面积
[0266] P:溶解度测定用试样溶液的平均面积
[0267] 由本试验所得到的本发明的（ + )-5 - (3,4 -二氣苯基）一5 - [(3 -甲基一2 -氧 化晚一1(2H)-基）甲基]咪挫烧一2,4-二酬W及对照化合物（± )-5-(3,4-二氣苯 基）一5- [(3-甲基一2-氧化晚一U2H)-基）甲基]咪挫烧一2,4-二酬对日本药典崩解 试样液第2液的溶解度(yg/mU示于表2。
[0%引[表2]
[0269] 表2
[0270]
[0271] 通过上述试验，确认本发明化合物与其外消旋体相比，对日本药典崩解试验液第2 液具有高得多的溶解度。因此，本发明化合物在配制制剂时显然具有优异的性质。 脚。试验例6 陶]对有机溶剂的溶解性试验
[0274] 在室溫条件下，在0.5mL的聚丙締制试管中准备预先称量的适量( + )-5-(3,4-二氣苯基）一5-[(3-甲基一2-氧化晚一1(2H)-基）甲基]咪挫烧一2,4-二酬W及 (±)-5-(3,4-二氣苯基）一5-[(3-甲基一2-氧化晚一l(2H)-基）甲基]咪挫烧一2， 4-二酬，分别加入各种重量(例如相对于被验化合物的10倍量、20倍量、100倍量等)的溶剂 (丙二醇(PG)或下二醇(BG))，使用旋满混合器进行揽拌。在设定为37°C的台式超声波清洗 机中进行10分钟的超声波处理。在设定为80°C的恒溫槽中溫热1小时后，在室溫下静置24小 时。通过目视对试验液进行观察，按照下述判定基准对其状态进行评价。
[0趴]对溶剂的溶解