症模型成立。玫瑰茄挥发油III可W显著 抑审化^-〇、1^8、比-1、比-6和0^-2的分泌。<0.05)，并呈现梯度依赖性（图6~10)。
[0095] 实施例15玫瑰茄挥发油HI对LI^诱导的RAW264.7细胞相关蛋白水平的影响
[0096] 常规培养细胞，取对生长数期的RAW264.7细胞，按100万/孔细胞数接种于6孔板， 解育2地后，吸弃上清，按如下分组要求给药，每组设3个复孔。Control组，脂多糖化PS，终浓 度为化g/mL)组，LPS(终浓度为化g/mL)+地塞米松(DXM，终浓度为50iig/mL)组，LPS(终浓度 为化g/mL)+HFY-III(实施例7制备得到的玫瑰茄挥发油III，终浓度为50、100和200iig/mL) 组，对照组添加同体积的培养基。其中，LPS+HFY-III组HFY-III预先刺激化后，再加脂多糖 (LPS+地塞米松组同样处理），置于37°C，5%C02培养箱，继续培养化。作用化后，吸弃细胞上 清，并且用预冷的PBS清洗两次，收集细胞至1.5mL离屯、管中，加入80化的PIPA裂解液(含憐 酸酶抑制剂（PhosST0P，Roche)和蛋白酶抑制剂（complete ULTRA ,EDTA- free，EAS化ack，Roche))，用ImL的注射器吸取裂解液反复吹打细胞至充分混匀，于冰上放 置30min，每隔IOmin于满旋振荡器上振荡30s。W1200化pm离屯、15min，将上清转移至新的 1.5mLEP管，置于冰上待测定蛋白浓度。采用BCA法检测蛋白浓度（按照BCA Protein Assay Kit说明书进行）：先将浓度为2mg/mL的BSA溶液予超纯去离子水稀释为系列质量浓度(Oiig/ mL、2^ig/血、125iig/mL、250yg/血、500yg/mL、1000iig/mL)的标准品溶液，再根据需要配置一 定量的工作液(BCA Solution:4% (体积分数)Cupric Sulfate = 200:4)。取一块无底物的 96孔板，每孔分别加入已稀释好的系列标准品溶液25化，W及需要检测的蛋白溶液25化(已 稀释5倍），每组均设置复孔。同时加入20化L/孔工作液，轻轻震荡混匀，置于37°C解育30min 后，取出，于多标记微孔板检测仪570nm处检测OD值。根据标准品蛋白溶液所测OD值绘制标 准曲线，计算出待测蛋白溶液浓度。根据BCA法测得的蛋白浓度，计算出40yg总蛋白所需蛋 白体积，同时加扣L 5 X SDS-PAGE上样缓冲液，再补充相应体积的超纯去离子水至总体积为 2扣L，混匀，充分离屯、，使液体聚集在底部，100°C加热变性lOmin，离屯、，置于冰上备用。选择 12 % (体积分数)分离胶和5 % (体积分数)浓缩胶，将已变性好的蛋白样品依次加入各泳道， 样品两侧的泳道分别加入化L Marker。电泳槽中加入足够量的TGS缓冲液，电泳条件为： 100V，约150min，直至漠酪蓝指示剂跑至距胶下缘约0.5cm时，停止电泳。然后在冰浴中W IOOV的电压转膜IOOmin。用含5 % (质量分数)脱脂奶粉的TBST封闭，缓慢摇荡化。一抗抗体 分别为：GAPDH(14c 10) Rabbi t mAb、P-JNK、NF-KB、和P-E服 1 /2 (均购自 CST公司），二抗抗体 为山羊抗兔（HRP标记），购自聚研生物科技有限公司。按照说明书推荐的稀释比例（1: 1000)，配制一抗，室溫下轻摇解育4h或4°C静置过夜。一抗解育结束后，更换二抗，HRP标记 的二抗按相应比例稀释（1:2000)，室溫轻摇化。二抗结束后，加入发光液(购自BioFuture公 司)并利用凝胶成像仪蛋白条带显影。
[0097] 正常组RAW264.7巨隧细胞内憐酸化的JNK、ERKl/2和P65蛋白表达较低，当化g/mL 的LPS作用细胞化，细胞内憐酸化的E服1/2蛋白表达显著上调(P<0.01)，从而激活MAPK和 NF-KB信号通路（图11~13)。玫瑰茄挥发油III可W显著下调P65和憐酸化的JNK、E服1/2蛋 白表达(图11~13)。
[009引实施例16对玫瑰茄挥发油HI的组成成分进行分析
[0099] (1)采用气相色谱-质谱分别对实施例7~9制备得到的玫瑰茄挥发油III (HFY-III)的组成成分进行分析。气质条件:色谱柱为HP-5MS( 30m X 0.25mm X 0.25皿)石英毛细管 柱;进样量为1.化L，分流比5:1，高纯氮气作为载气，流速为ImL/min，进样口溫度为250°C， 初始柱溫(TC,保持2min，W5°C/min升溫至250°C，保持5min的升溫程序;质谱条件为电离方 式EI，电子能量70eV，离子源溫度250°C，传输线溫度280°C和质量扫描范围m/z33-500amu。
[0100] (2)分别称取实施例7~9制备得到的玫瑰茄挥发油Iiuhfy-III )2mg，溶于2mL C出Cl2溶液中，按气相色谱-质谱检测条件，进行玫瑰茄挥发油分析。
[0101 ] 结果分析如表1，实施例8和9结果同实施例7。
[0102]表1玫瑰茄挥发油HI的GC-MS鉴定结果
[01031
[0104]上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种玫瑰茄挥发油的制备方法，其特征在于包含如下步骤： (1) 将玫瑰前(Hib i scus sabdariffa)粉碎过筛，得到玫瑰前粗粉;将玫瑰前粗粉与水 充分混匀，然后浸泡，得到浸提液； (2) 将步骤（1)制得的浸提液置于水蒸气蒸馏装置中，采用水蒸气蒸馏法提取挥发油； 停止加热后冷却，使冷凝管中的挥发油全部冷凝下来，减少挥发;采用有机溶剂收集挥发 油，除水除去有机溶剂，得到玫瑰茄挥发油。2. 根据权利要求1所述的玫瑰茄挥发油的制备方法，其特征在于： 步骤(1)中所述的水与玫瑰茄粗粉的质量比为10:1~30:1。3. 根据权利要求1所述的玫瑰茄挥发油的制备方法，其特征在于： 步骤（1)中所述的浸泡时间为20min~lh。4. 根据权利要求1所述的玫瑰茄挥发油的制备方法，其特征在于： 步骤(2)中所述的提取的条件为煮沸后100°C提取5~8h。5. 根据权利要求1所述的玫瑰茄挥发油的制备方法，其特征在于： 步骤(2)中所述的冷却的时间为20~40min。6. 根据权利要求1所述的玫瑰茄挥发油的制备方法，其特征在于： 步骤(2)中所述的有机溶剂为乙醚或石油醚。7. -种玫瑰茄挥发油，其特征在于:通过权利要求1~6任一项所述的制备方法制备得 到。8. -种玫瑰茄挥发油II，其特征在于:通过将权利要求7所述的玫瑰茄挥发油进一步微 波处理得到； 所述的微波处理的微波功率为500~800W; 所述的微波处理的时间为30 s~150 s。9. 一种玫瑰茄挥发油III，其特征在于:通过将权利要求7所述的玫瑰茄挥发油I进一步 超声处理得到； 所述的超声处理的频率为80~100ΚΗz，功率为200~500W; 所述的超声处理的时间为2~5min。10. 权利要求7所述的玫瑰茄挥发油、权利要求8所述的玫瑰茄挥发油II或权利要求9所 述的玫瑰茄挥发油III在制备抗炎药物中的应用。
【专利摘要】本发明属于中药领域，具体涉及一种玫瑰茄挥发油及制备方法与在制备抗炎药物中的应用。本发明通过水蒸气蒸馏法从玫瑰茄提取到玫瑰茄挥发油。此外本发明通过微波及超声处理分别得到玫瑰茄挥发油II和玫瑰茄挥发油III。这三种挥发油在体外能显著抑制LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞NO的释放，而且挥发油III能显著抑制LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞TNF-α、iNOS、IL-1、IL-6和COX-2mRNA的表达。玫瑰茄挥发油III能够下调NF-κB和磷酸化的JNK、ERK1/2蛋白表达，可以应用于制备抗炎药物。
【IPC分类】C11B9/02, A61K36/185, A61P29/00
【公开号】CN105695102
【申请号】CN201610156249
【发明人】姜建国, 张恬恬, 张文莉
【申请人】华南理工大学
【公开日】2016年6月22日
【申请日】2016年3月18日