专利名称：一种功能性稀土配合物长寿命荧光染料及其合成方法和应用的制作方法
技术领域：
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本发明涉及一种功能性稀土配合物长寿命荧光染料，还涉及该荧光染料的合成方法和 应用。
背景技术：
稀土配合物染料是近二十几年发展起来并受到重视的一类长寿命荧光化合物。它的荧 光具有非常特殊的三价稀土离子配合物的光谱特性，例如线状谱线和大的斯托克斯位移，
这在基于荧光的生物探测中，为获得低探测下限和高灵敏度具有重要的意义。特别是长的 荧光寿命(毫秒到微秒的范围)，利用时间分辨检测技术可以消除背景荧光(微秒量级以 下)对探测信号的影响。
生物标记是生物传感研究中的关键技术，荧光标记易受生物体系内源荧光背景干扰、 灵敏度相对较低、信号易受环境影响。长寿命荧光可利用时间分辨的方法消除样品中荧光 背景的干扰。经过修饰上特定的活性基团的染料在分析化学、生命科学、环境科学以及其 他领域具有极大的应用价值。目前人们己经对稀土离子的荧光进行了深入的研究，广泛探 讨了其荧光机理、荧光特点和影响因素。近年来，国内外学者把稀土配合物的荧光应用到 生物化学的研究领域，将稀土离子荧光检测高灵敏度性和生物抗原抗体反应的高特异性、 分子生物学核酸探针高度专一性有机地结合起来创造了新的超微量检测生物活性物质的 分析技术。但是在母体染料上引入活性官能团进而用于生物标记以及生物分析检测等领域 仍然是一个难点
发明内容
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本发明的目的之一是提供一种母体染料上具有功能性基团的稀土配合物长寿命荧光 染料；目的之二是提供该稀土配合物长寿命荧光染料的合成方法；目的之三是提供该稀土 配合物长寿命荧光染料的应用。
本发明的目的之一可通过如下技术措施来实现
所述的稀土配合物具有以下式I所示的结构式其中M=Eu或Tb
式I 。<formula>formula see original document page 4</formula>
式I所示的结构式中具有功能性反应基团；所述的功能性反应基团为氨基。 本发明的目的之二可通过如下技术措施来实现
以噻吩甲酰三氟丙酮、5-氨基-l，10-邻菲喂啉为配体制备长寿命荧光稀土配合物，将稀 土氯化物的乙醇溶液和三氟乙酰丙酮的乙醇溶液加入混合，控制温度为55°C-65°C，用调 节pH值5.5-6.5，反应30-50min;将5-氨基-l,10-邻菲啰啉的乙醇溶液滴加至反应体系中， 控制反应温度在55-65'C继续反应4-6h，搅拌冷却，静置过夜，有白色的固体析出，抽滤; 先用乙醇水溶液洗涤，再用蒸馏水洗涤，干燥，以甲醇-氯仿混合溶液重结晶两次，得产品。 所述的5-氨基-l，10-邻菲啰啉由下述方式制得以1,10-邻菲喂啉为原料通过硝化反应制 得5-硝基-l,10-邻菲啰啉；再通过还原反应制得5-氨基-l,10-邻菲P罗啉。
所述的硝化反应是以浓硫酸和浓硝酸混合酸为硝化剂，反应时间为2.5-3.5小时;所 述的还原反应是以含钯质量分数为5%的钯炭为催化剂，反应时间为4. 5-5. 5小时；
以稀土氧化物为原料制取稀土氯化物，氧化铕用浓盐酸溶解或氧化铽用高氯酸溶解。
本发明具体的合成方法主要按如下步骤进行
a、 以1，10-邻菲啰啉为原料通过硝化反应制取5-硝基-l,10-邻菲口罗啉，硝化反应是以浓硫酸 和浓硝酸混合酸为硝化剂，反应时间为3小时
b、 以5-硝基-l，10-邻菲啰啉为原料通过还原反应制取5-氨基-l,10-邻菲喂啉，还原反应是 以5%钯炭为催化剂，反应时间为5小时；
c、 以稀土氧化物为原料制取稀土氯化物，稀土氧化物可以为氧化铕用浓盐酸溶解或氧化 铽用高氯酸溶解；
d、 以噻吩甲酰三氟丙酮、5-氨基-l,10-邻菲啰啉为配体制备长寿命荧光稀土配合物。将稀 土氯化物的乙醇溶液和三氟乙酰丙酮的乙醇溶液加入三口烧瓶中，控制温度为6(TC,用氢 氧化钠溶液调节pH值6.0左右，反应40min。将5-氨基-l,10-邻菲啰啉的乙醇溶液滴加至反应体系中。控制反应温度在55-60'C继续反应5h，搅拌冷却。静置过夜，有白色的固体 析出，抽滤；先用24ml乙醇-水(1: 1)溶液洗漆，再用蒸馏水洗涤，于50'C下干燥，以 甲醇-氯仿混合溶液重结晶两次，得产品。
本发明的目的之三可通过如下技术措施来实现
具有式I所示结构式的稀土配合物作为长寿命荧光染料应用于生物分析领域中作为 生物标记。
本发明分别采用不同的反应原料，如氧化铕、氧化铽为反应物，可以合成出下列染料-
本发明合成的荧光染料具有独特的长寿命荧光和大的斯托克斯位移，并且化学稳定性 和光稳定性好。该类染料是一种理想的光功能材料。所合成的这类稀土配合物长寿命荧光 染料中都含有氨基，可以以氨基作为活性官能团与寡核苷酸片断或生物大分子如免疫球蛋 白IgG等共价联接构建长寿命荧光探针，这在基于荧光的生物探测中，为获得低探测下限 和高灵敏度具有重要的意义。
本发明主要合成了一种新的功能性稀土配合物的长寿命荧光染料，这类化合物中都含 有活性官能团氨基，该活性官能团的引入可以使其比较容易的跟别的化合物反应，进而更 广泛的用于生物标记和生物分析之中。
图1为Eu(TTA)3phen纳米颗粒的长寿命发光发射光谱；
<formula>formula see original document page 5</formula>
图2为Tb(TTA)3phen纳米颗粒的长寿命发光发射光谱; 图3为三明治结构的检测模型杂交示意图； 图4玻片上检测长寿命发光光谱。
具体实施例方式
以下实施例旨在说明本发明而不是对本发明的进一步限定。
实施例1:
以噻吩甲酰三氟丙酮、5-氨基-l，10-邻菲啰啉为配体的稀土铕配合物的制备，其步骤为: a、以1,10-邻菲啰啉为原料制取5-硝基-l，10-邻菲啰啉，通过以下反应合成
<formula>formula see original document page 6</formula>
在三口烧瓶中加入5.00g 1,10-邻菲啰啉，并往三口烧瓶中加入7.5ml浓硫酸，使二者 混合均匀，继续搅拌，油浴加热，分别移取15ml浓硫酸和15ml浓硝酸的混合物于恒压滴 液漏斗中，在加热搅拌的情况下缓慢滴加该混合物，温度不超过170'C，反应3h，冷却至 室温，将反应液倒入已经准备好的冰水中，用10%的氢氧化钠溶液调节pH至6.0左右， 即有黄色物质析出；抽滤，并用水洗，放置在干燥箱中干燥，再经乙醇重结晶，干燥得黄 色产物5-硝基-l，10-邻菲喂啉。
b、以5-硝基-l,10-邻菲啰啉为原料制取5-氨基-l，10-邻菲啰啉，通过以下反应合成
<formula>formula see original document page 6</formula>
在三口瓶中依次加入1.50g 5-硝基-l，10-邻菲啰啉和300mg 5%钯炭催化剂，加入乙醇 搅拌，水浴加热。当温度达到55。C-70。C时，加入已经配好的水合肼的乙醇溶液，回流反 应5h;趁热过滤，再用乙醇洗涤数次，滤液旋转蒸发除去大部分的乙醇，冷却，即析出淡 黄色固体，抽滤，干燥，再用乙醇重结晶，得黄色针状产物5-氨基-l,10-邻菲啰啉。
c、以氧化铕为原料制取氯化铕，通过以下反应合成
Eu203 + HC1 - EuCl3.6H20
称取175.96mg氧化铕于0.5ml浓盐酸中，加热溶解，除去多余的浓盐酸，加乙醇稀 释得透明溶液。
d、以噻吩甲酰三氟丙酮、5-氨基-l,10-邻菲卩罗啉、氯化铕为原料制取稀土铕配合物， 通过以下反应合成<formula>formula see original document page 7</formula>
以15ml乙醇溶解666.54mg噻吩甲酰三氟丙酮。将氯化铕的乙醇溶液和噻吩甲酰三氟 丙酮的乙醇溶液徐徐加入到三口瓶中，水浴加热，磁力搅拌，控制温度为60。C,用氢氧化 钠溶液调节pH值6.0左右，反应40min。以10ml乙醇溶解195.2mg 5-氨基-l，10-邻菲啰啉， 滴加至反应体系中。控制反应温度在55-60'C继续反应5h，搅拌冷却。静置过夜，有白色 的固体析出，抽滤。先用24ml乙醇-水(1: 1)溶液洗涤，再用蒸馏水洗涤，于50'C下干 燥，以甲醇-氯仿混合溶液重结晶两次，得白色产物以噻吩甲酰三氟丙酮、5-氨基-1,10-邻菲喂啉为配体的稀土铕配合物。在激发波长为412nm、激发和发射狭缝分别为2.5nm、 延迟时间为O.lms和门时间为l.Oms时，扫描一定量配合物固体的发射光谱，如图1所示， 该配合物在611nm处出现了发射峰，表现出了长寿命的荧光。红外光谱检测该配合物数据 自由配体TTA中1637cm"的v(c^o)特征峰,在配合物中蓝移到了 1626 cm'1;自由配体phen 位于1587cm—1处v(c = n)的特征峰，在配合物中蓝移到了 1550 cm'1 。元素分析
EuC36H24N3F9S3:测量值Eu， 15.13; C， 42.58; H， 2.31; N， 4.19;计算值Eu， 14.99; C， 42.62; H， 2.37; N， 4.14;
实施例2:
以噻吩甲酰三氟丙酮、5-氨基-l,10-邻菲啰啉为配体的稀土铽配合物的制备，其步骤为:
a、 以1，10-邻菲啰啉为原料制取5-硝基-l,10-邻菲口罗啉，同实施例l。
b、 以5-硝基-l，10-邻菲啰啉为原料制取5-氨基-l,10-邻菲喂啉，同实施例l。
c、 以氧化铽为原料制取氯化铽，通过以下反应合成 Tb407 + HC104 ~~ Tb(C104)3. 6H20
称取123.27mg氧化铽于高氯酸中，加热溶解，除去多余的高氯酸，加乙醇稀释得透 明溶液。
d、 以噻吩甲酰三氟丙酮、5-氨基-l，10-邻菲啰啉、氯化铽为原料制取稀土铽配合物， 通过以下反应合成
<formula>formula see original document page 8</formula>
以15ml乙醇溶解440.60mg噻吩甲酰三氟丙酮。将氯化铽的乙醇溶液和噻吩甲酰三氟 丙酮的乙醇溶液徐徐加入到三口瓶中，水浴加热，磁力搅拌，控制温度为60'C,用氢氧化 钠溶液调节pH值6.0左右，反应40min。以10ml乙醇溶解130.15mg 5-氨基-l，10-邻菲啰 啉，滴加至反应体系中。控制反应温度在55-6(TC继续反应5h，搅拌冷却。静置过夜，有
55 60。C 乙醇中反应3h
深绿色固体析出，抽滤。先用24ml乙醇-水(1: 1)溶液洗涤，再用蒸馏水洗涤，于5(TC 下干燥，以甲醇-氯仿混合溶液重结晶两次，干燥得深绿色固体。在激发波长为344nm、激 发和发射狭缝分别为5.0nm、延迟时间为O.lms和门时间为l.Oms时，扫描一定量配合物 固体的发射光谱，如图2所示，该配合物在612nm处出现了发射峰，表现出了长寿命的荧 光。红外光谱检测该配合物数据自由配体TTA中1637 cm"的v(c-o)特征峰，在配合物 中红移到了 1639cm";自由配体phen位于1587cm"处v(c-N)的特征峰，在配合物中蓝移 到了 1550 cm-1。元素分析TbC36H24N2F9S3:测量值Tb， 15.27; C， 42.64; H， 2.29; N， 4.24;计算值Tb， 15.57; C, 42.32; H， 2.35; N， 4.11; 实施例3:
以实施例1中制取的稀土铕配合物标记检测金色葡萄球菌的DNA3,采用专利(谭蔚 弘、王克敏、龚萍、何晓晓，硅壳纳米颗粒检测SARS病毒基因组片断的方法，中国专利，
公开日2005年3月23日，公开号CN 1597987A)报道的三明治模型的检测方法，如图3 所示。具体步骤
a、玻片的醛基化及修饰有氨基的探针DNAi在玻片表面上的固定，具体步骤(1) 正方形玻片(直径13mm)浸入铬酸洗液中浸泡过夜，蒸馏水洗，浸入25%的氨水中过夜， 二次蒸馏水水洗，浸入含2%氨基硅烷试剂的95%乙醇溶液中，用冰醋酸调节pH至4.5， 室温作用30min，分别用乙醇和二次蒸馏水超声清洗，室温晾干。然后用2.5%戊二醛的 O.lmol/LPBS (pH=7.2)溶液与氨基玻片作用2h，分别用PBS溶液和二次蒸馏水冲洗，晾 干，得到表明修饰有醛基的玻片。(2)将探针DNAi用二次蒸馏水稀释到15umol/L，滴加 到醛基化玻片表面，室温静置过夜，然后用0.2%的SDS洗2次，水洗两次，室温晾干备 用。
b、稀土铕配合物联接上修饰有氨基的DNA2，具体步骤称取100mg稀土铕配合物 分散到6mL 2.5%的戊二醛溶液中，室温下剧烈震荡3h。离心并用二次蒸馏水洗，得到的 醛基连接的稀土铕配合物重新悬于6mLpH-7.2的PBS溶液中备用。将探针DNA2用二次 蒸馏水稀释成15umol/L。将一定量的DNA2样品加入到纳米颗粒悬浮的PBS溶液中，37 t)下于震荡培养箱中反应3h,反应完成后，离心，洗涤。然后将标记好DNA2的稀土铕配 合物重新分散于PBS缓冲液中。
c、杂交及杂交信号检测，具体步骤首先将目标探针DNA3用二次蒸馏水稀释到15umol/L。 将上述DNA!修饰的玻片放入杂交盒中，在玻片周围滴加10uL3xSSC来维持湿度。将DNA2
和DNA3样品滴加到玻片上，盖上盖玻片，赶走气泡。盖上杂交盒，将其放入震荡培养箱 中恒温箱(38.3°C)中杂交24h，清洗，真空6(TC干燥。带有长寿命荧光配合物标记的识 别DNA2，目标DNA3和捕获DNA,探针形成杂交体，在激光激发下产生一个长寿命荧光 信号，实验结果如下图所示，实验中检测出了玻片上的荧光信号。从图4可以看出，我们 在玻片上检测到了稀土铕配合物的长寿命荧光，激发和发射狭缝分别为8.0nm，延迟时间 为O.lms，门时间为1.0 ms。
权利要求
1.一种功能性稀土配合物长寿命荧光染料，其特征在于，所述的长寿命荧光染料具有式I所示的结构式其中M＝Eu或Tb式I。
2、 合成权利要求1的一种功能性稀土配合物长寿命荧光染料的方法，其特征在于，以噻 吩甲酰三氟丙酮、5-氨基-l,10-邻菲喂啉为配体制备长寿命荧光稀土配合物，将稀土氯化物 的乙醇溶液和三氟乙酰丙酮的乙醇溶液加入混合，控制温度为55'C-65°C，调节pH值 5.5-6.5，反应30-50min;将5-氨基-l,10-邻菲啰啉的乙醇溶液滴加至反应体系中，控制反应 温度在55-65。C继续反应4-6h，搅拌冷却，静置过夜，有白色的固体析出，抽滤；先用乙 醇水溶液洗涤，再用蒸馏水洗涤，干燥，以甲醇-氯仿混合溶液重结晶两次得产品。
3、 根据权利要求2所述的一种功能性稀土配合物长寿命荧光染料的合成方法，其特征在 于，所述的5-氨基-l,10-邻菲喂啉由下述方式制得以1,10-邻菲喂啉为原料通过硝化反应 制得5-硝基-1,10-邻菲喂啉；再通过还原反应制得5-氨基-l，10-邻菲P罗啉。
4、 根据权利要求3所述的一种功能性稀土配合物长寿命荧光染料的合成方法，其特征在 于，所述的硝化反应是以浓硫酸和浓硝酸混合酸为硝化剂，反应时间为2.5-3.5小时;所 述的还原反应是以含钯质量分数为5%的钯炭为催化剂，反应时间为4. 5-5. 5小时；
5、 根据权利要求2所述的一种功能性稀土配合物长寿命荧光染料的合成方法，其特征在 于，以稀土氧化物为原料制取稀土氯化物，氧化铕用浓盐酸溶解或氧化铽用高氯酸溶解。
6、 权利要求1的一种功能性稀土配合物长寿命荧光染料的应用，其特征在于，具有式I 所示结构式的稀土配合物作为长寿命荧光染料应用于生物分析领域中作为生物标记。
全文摘要
本发明提供了一种功能性稀土配合物长寿命荧光染料及其合成方法和应用，该合成方法以噻吩甲酰三氟丙酮、5-氨基-1，10-邻菲啰啉为配体制备长寿命荧光稀土配合物。本发明化合物合成方法简便，具有长的荧光寿命和活性基团氨基，具有极大的应用价值。
文档编号C09K11/06GK101368005SQ20081014328
公开日2009年2月18日 申请日期2008年9月25日 优先权日2008年9月25日
发明者曾光明, 李慧霞, 牛承岗, 秦品珠, 敏 阮 申请人:湖南大学