近红外荧光靶向纳米探针的制备和纳米探针的应用的制作方法

本发明涉及pH敏感荧光成像纳米材料，具体地说是一种功能化的pH敏感近红外(700-1100nm)荧光成像纳米探针的制备及应用。

背景技术：

在靶向纳米探针技术中，基于近红外荧光材料材料为基础的活体成像技术是当今国际生物体检测领域的研究前沿和重要发展方向之一。其中，具备肿瘤响应功能化的纳米探针材料是活体成像技术研究中的一个新研究热点，其应用焦点目前主要集中在组织的靶向识别、靶向响应、药物的靶向投递、功能性材料的控释和缓释等。现已报道的纳米探针活体成像技术及存在的问题包括如下几个方面：

(1)近红外荧光探针活体成像技术(文献1Satoru Onoea,Takashi Temmaa,Yoichi Shimizu,Masahiro Ono and Hideo Saji,Cancer Medicine3(4):775-786(2014).文献2Xumeng Wu,Xuanrong Sun,ZhiqianGuo,Jianbin Tang,YouqingShen,Tony D.James,He Tian and Weihong Zhu,JACS 136:3579-3588(2014).)。以吲哚菁绿(ICG),CY7等为代表的近红外染料，毒性低，可直接应用于活体成像，如体内血管造影，注射式皮肤造影等，检测迅速。应用于纳米载体装载，能实现肿瘤组织的靶向荧光成像。但是纳米载体装载会造成荧光物质局部浓度过高，造成一定程度的荧光淬灭。

(2)近红外光光热纳米探针的光热治疗技术(文献3Yanlan Liu,Kelong Ai,Jianhua Liu,Mo Deng,Yangyang Heand Lehui Lu,Advanced Materials25:1353-1359(2013).文献4Jing Bai,Yuwei Liu and Xiue Jiang, Biomaterals35：5805-5813(2014).)。近红外光光热治疗技术基于能量转换方式可以分为两类：一类是以金纳米粒和石墨烯为代表的纳米材料，通过等离子体共振实现近红外光转化为热能，对局部升温进行光热治疗。另一类是以ICG、IR825为代表的近红外荧光染料，通过能带跃迁将近红外光转化为热能，实现局部加热的光热治疗。目前近红外光光热治疗技术主要难点在于如何实现光热材料肿瘤等病变组织的靶向富集，以及提高光热材料的光热转化效率。目前近红外荧光在体诊疗纳米探针，在肿瘤环境靶向成像性能和靶向治疗性能方面仍然存在不足，有待进一步构建新型的纳米探针。

技术实现要素：

为了解决上述问题，本发明的目的是构建一种功能化的pH敏感近红外荧光诊疗纳米探针，探针以设计构建的pH敏感近红外荧光染料DX-CY7作为近红外荧光发光中心兼具光热治疗功能和pH敏感能力，以聚阳离子的高分子材料聚赖氨酸(PLL)与pH敏感近红外静电自组装形成的纳米粒载体，构建一种新型近红外荧光光热肿瘤pH靶向纳米探针。此探针具备近红外荧光成像能力，pH响应的荧光增强能力，肿瘤靶向能力，光热治疗能力，具有对肿瘤组织诊断和治疗的性能。

为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：

设计合成一系列新型PH敏感近红外荧光染料DX-CY7，结构如式：

其中n1范围1-10，n2范围1-20。

所述的设计合成的新型pH响应聚阴离子近红外荧光染料DX-CY7，其结构中n1在1到10之间，n2在1到20之间，采用苯并吲哚基团增强光热性能，聚天冬氨酸链部分提供pH敏感的电荷变化。

以DX-CY7为近红外染料为发光中心和光热治疗基团，与分子量5-70KDa的PLL静电自组装形成纳米结构，制备功能化的pH敏感近红外荧光诊疗纳米探针。

具体为：利用ε-PLL的氨基与近红外染料DX-CY7自组装形成纳米结构探针，使探针具备近红外荧光、光热治疗、肿瘤靶向和pH敏感的性能，其结合方式如下图7所示：

DX-CY7和PLL在pH7.4条件下可以静电自组装形成纳米粒，在肿瘤pH4.5环境下释放DX-CY7增强荧光信号。

本发明具有如下优点：

(1)具备荧光信号肿瘤环境检测增强的能力。DX-CY7-PLL纳米探针在肿瘤pH4.5环境下释放DX-CY7增强荧光信号。

(2)延长荧光信号在血液内停留时间。DX-CY7-PLL纳米探针比单独使用近红外荧光染料血液保留时间延长，从而可以延长观测的窗口时间，充分实时获取成像信息，延长体内的有效时间。

(3)增加探针对肿瘤组织的富集的靶向识别。DX-CY7-PLL纳米探针通过

附图说明

图1是DX-CY7质谱结果；

图2是DX-CY7-PLL纳米探针的高分辨透射电子显微镜照片；

图3是DX-CY7-PLL纳米探针的尺寸分布结果；

图4是DX-CY7-PLL纳米探针的光热性能评价；

图5是DX-CY7-PLL纳米探针的pH敏感性体外评价；

图6是DX-CY7-PLL纳米探针的pH敏感性体内评价；

图7是纳米结构形成示意图。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

DX-CY7-PLL制备方法：

(1))DX-CY7的合成

以n1＝2，n2＝3为例，环己酮与三氯氧磷反应生成1a，投料物质量比1:3。1，1，2三甲基苯并吲哚，碘丙酸合成产物1b，投料物质量比1:1。1a和1b无氧高温生成1c，投料物质量比1:2。。1c与固相合成侧链保护露出氨基端的Asp-Asp-Asp-Asp短肽反应，去保护后得到DX-CY7，投料物质量比1:2。

(2)DX-CY7-PLL纳米探针制备

将PLL溶于PBS(PH＝7.4)，浓度2mg/ml，制备PLL溶液。将DX-CY7溶于PBS(PH＝7.4)，浓度1mg/ml，制备DX-CY7溶液。将1ml PLL加入到0.1ml DX-CY7溶液中，涡旋20s，静电自组装制备DX-CY7-PLL纳米探针。

实施例2

DX-CY7-PLL纳米探针的性质表征：

(1)DX-CY7-PLL纳米探针的形态及大小尺寸

图2是DX-CY7-PLL纳米探针的高分辨透射电子显微镜照片，照片显示DX-CY7-PLL纳米探针呈球形，粒径分布均匀，直径平均5.92nm，如图3统计结果。

(3)DX-CY7-PLL纳米探针的光热性能评价

图4是DX-CY7-PLL纳米探针的光热性能结果。评价方法为：1mg/ml的DX-CY7-PLL纳米探针PBS(PH＝7.4)水溶液3ml，在808nm激光(2W/cm²)的照射下1min时的光热成像，表明探针可以快速将激光能量转化成可以用于治疗的热量。

实施例3

DX-CY7-PLL纳米探针的pH敏感性能评价：

图5为DX-CY7-PLL纳米探针靶体外pH敏感性能评价结果。评价方法：1mg/ml的DX-CY7-PLL纳米探针PBS(PH＝7.4)水溶液和pH 4.5的水溶液，进行荧光成像，条件为735nm激发，780nm-950nm采集，曝光时间200ms。结果表明探针具备体外的pH敏感性能。

图6为DX-CY7-PLL纳米探针靶体内pH敏感性能评价结果。评价方法：200μl、1mg/ml的DX-CY7-PLL纳米探针PBS(PH＝7.4)水溶液，皮下注射到昆明鼠腹部，在条件为735nm激发，780nm-950nm采集，曝光时间500ms条件下成像。在相同位置再注入pH的4.5缓冲溶液200ul，在相同条件下成像，表 明表明探针具备体内的pH敏感性能。