一种线粒体靶向荧光碳点及其制备方法和应用与流程

本发明公开了一种线粒体靶向荧光碳点及其制备方法和应用，属于生物纳米材料技术领域。

背景技术：

无论是在哺乳动物正常细胞或者是病变细胞中，线粒体都以其独特的作用而深刻影响着细胞的生命活动，如ATP的产生与细胞供能、细胞内部的钙离子信号和自由基的产生、细胞凋亡的调控以及维持细胞内部环境的稳态等。由于线粒体对细胞新陈代谢有着重要的意义，线粒体的功能异常与糖尿病、肿瘤、帕金森氏症和阿尔兹海默病等疾病的发生发展密切相关。因此对线粒体的数量、形貌等的观察和研究对于探知细胞的状态和生命活动至关重要。此外，由于线粒体对活性氧和热的敏感性，线粒体也成为了癌症光动力学治疗和光热治疗的重要靶标。

另一方面，荧光染色法是实现线粒体成像的最主要方法，因此开发出相应的线粒体荧光探针是目前的研究热点。现在商品化的线粒体荧光探针主要包括罗丹明123、具有线粒靶向性质的绿色荧光蛋白(mito-GFP)和MitoTracker系列染料。这些染料因为其高度特异的线粒体靶向特性以及可产生较强荧光信号而饱受青睐，但是它们也存在着许多缺点如合成复杂、价格昂贵、水溶性较差且光稳定性差等，从而在一定程度上限制了它们的应用。

与此同时，定位于线粒体的靶向癌症治疗是目前治疗癌症的新思路。这是因为针对线粒体的药物能够有效破坏对于细胞生命活动极其重要的线粒体从而提高药物杀死癌细胞的效率。发展线粒体靶向药物，最常用的方法是利用线粒体靶向配体如三苯基膦(TPP)对药物进行共价修饰，从而赋予药物线粒体靶向的能力。但是，由于该配体毒性较大，且其本身不具备荧光性质，因此在修饰的过程通常还须引入其他的荧光分子才能实现对药物的荧光示踪，但引入的其他分子会降低修饰后药物的线粒体靶向性。这些缺点也成为了该配体用于实现药物线粒体靶向输运的瓶颈。综合所述，开发出一种同时具备荧光探针和药物载体双重功能的线粒体靶向分子或纳米颗粒的重要性不言而喻。

技术实现要素：

发明目的：针对上述技术问题，本发明提供了一种荧光碳点，以及利用多胺基化合物和多羧基化合物，并借助水热合成法，制备该荧光碳点的方法；以及所述荧光碳点在线粒体成像和线粒体靶向载药性能方面的应用。

技术方案：本发明提供了一种线粒体靶向荧光碳点，其主要是由以下重量份比例的原料制成：

壳聚糖1–20份、乙二胺1–10份和和巯基丁二酸1–10份。

优选，所述的线粒体靶向荧光碳点主要是由以下重量份比例的原料制成：

壳聚糖1份、乙二胺1–10份和和巯基丁二酸1–10份。

优选，所述的线粒体靶向荧光碳点主要是由以下重量份比例的原料制成：

壳聚糖20份、乙二胺1–10份和和巯基丁二酸1–10份。

优选，所述壳聚糖分子量在10kDa-1000kDa。

本发明还提供了所述线粒体靶向荧光碳点制备方法，包括以下步骤：将壳聚糖、乙二胺和和巯基丁二酸制成混合液，然后水热条件下反应一定时间，降温，过滤或离心即得所述靶向荧光碳点的溶液。

优选，包括以下步骤：

(1)称取壳聚糖、乙二胺和和巯基丁二酸，其中壳聚糖在稀盐酸溶液中加热溶解，而后将乙二胺与巯基丁二酸加入至壳聚糖溶液中混匀，并将混合液加入到水热反应釜中；

(2)在水热反应釜中以160–200℃反应12–48h，降至室温后，过滤或离心即得所述靶向荧光碳点的溶液。

本发明还提供了所述的线粒体靶向荧光碳点在作为线粒体荧光探针中的应用，

以及所述线粒体靶向荧光碳点在作为线粒体靶向抗癌药物载体中的应用。

碳点由于其制备简单、具有荧光发光能力、尺寸小、水溶性好以及生物毒性低的性质而被广泛应用于许多领域，如生物成像、生物监测和药物载体等。本发明制备的碳点，首次实现了对哺乳动物细胞的线粒体成像的能力，且其抗光漂白的能力远高于常规的有机分子染料。相较于商品化的线粒体成像试剂，我们合成的碳点由于制备简单、水溶性好、安全性好、成本低廉，更加能够推广使用，并有望取代商品化的线粒体荧光探针。同时，由于碳点表面存在着包括氨基、羧基、巯基以及羟基等功能基团，该碳点可以通过物理或化学作用有效负载抗癌药物，实现定位于线粒体的靶向药物治疗。本发明将拓展荧光碳点在生物医学领域的应用。

本发明首次以壳聚糖、乙二胺和巯基丁二酸的混合物为碳源，利用水热合成法一步制得成本低、水溶性好、生物毒性低并具有线粒体荧光成像和线粒体靶向载药功能的新型荧光碳点。以溶解于0.1M硫酸中的硫酸奎宁溶液(量子产率为54％)作为标准品进行相对量子产率测试，我们发现该碳点荧光量子产率为12％，并且在不同激发波长下能够分别发出蓝色、绿色和红色的荧光。制备得到的碳点还具备对哺乳动物细胞的线粒体成像的能力，其抗光漂白的能力远高于常规的有机分子染料。同时，由于碳点表面存在着包括氨基、羧基、巯基以及羟基等功能基团，可通过物理或化学作用负载药物，实现基于线粒体靶向的药物输运，这将进一步拓宽碳点在生物医学领域的应用。

技术效果：相对于现有技术，本发明具有以下优势：

(1)优异的线粒体靶向成像性能：其对哺乳动物细胞线粒体的靶向成像具有普适性，在100μg/mL的浓度下便可实现对包括以肺细胞(AT II)与肝细胞(L02)为代表的正常组织细胞和以巨噬细胞(Raw264.7)为代表的人体免疫细胞以及以乳腺癌细胞(MCF-7)、肝癌细胞(HepG2)和宫颈癌细胞(HeLa)为代表的癌细胞的线粒体成像，同时其成像可实现免清洗，为荧光成像操作带来巨大的简便；

(2)优异的线粒体靶向载药功能：通过共价作用，可连接抗癌药物，所得到的碳点-药物复合体仍然保持碳点本身的线粒体靶向性质，从而可以实现定位于线粒体的癌症治疗并因此可极大地提高药物的抗癌疗效。

(3)优异的荧光性质：所制得的碳点荧光强度大，荧光激发光谱和发射光谱分布均很广，从而极大地拓宽了其对哺乳动物细胞线粒体成像检测的应用范围。在作为药物载体时，碳点本身的荧光可赋予药物分子荧光示踪的特性，为研究药物的定位机制提供了可能；

(4)优异的抗光漂白能力：该碳点在激光照射下不易被光漂白，其光稳定性远高于常规的有机染料分子如罗丹明123以及MitoTracker系列染料等，因此可以实现长时间连续成像观察；

(5)较高的生物相容性：经细胞毒性评价实验，该荧光碳点在0.5mg/mL的浓度时，对正常肺细胞和乳腺癌细胞的毒性依旧很低，均保持着80％左右及以上的存活率，即碳点本身的性质并不会对细胞造成很强的毒害，表现出很好的生物相容性；

(6)良好的水分散性和稳定性。所制得的荧光碳点具有很好的水分散性和稳定性，适合在含水的生物体系中的线粒体成像以及线粒体靶向载药的应用。

(7)本发明制备方法简单、原料价廉易得、可实现大量制备。

附图说明

图1为利用壳聚糖、乙二胺、巯基丁二酸的混合物制备荧光碳点的合成示意图；

图2为本发明制得的荧光碳点的透射电子显微镜(TEM)图；

图3为本发明制得的荧光碳点的紫外-可见吸收光谱图；

图4为本发明制得的荧光碳点的荧光发射光谱图；

图5为本发明制得的荧光碳点对于MCF-7成像效果图；

图6为本发明得的荧光碳点对于不同细胞线粒体成像效果图；

图7为本发明制得的荧光碳点对于不同细胞的毒性评价结果图；

图8为本发明制得的荧光碳点连接光敏剂孟加拉玫瑰红(RB)后所得物质(CDs-RB)透射电子显微镜图；

图9为本发明制得的荧光碳点连接光敏剂孟加拉玫瑰红(RB)后所得物质(CDs-RB)与碳点以及RB的紫外-可见吸收光谱图；

图10为本发明制得的荧光碳点连接光敏剂孟加拉玫瑰红(RB)后所得物质(CDs-RB)与碳点以及RB的荧光发射光谱图；

图11为本发明制得的荧光碳点连接光敏剂孟加拉玫瑰红(RB)后所得物质(CDs-RB)对MCF-7细胞的线粒体成像效果图；

图12为本发明制得的荧光碳点连接光敏剂孟加拉玫瑰红(RB)后所得物质对MCF-7细胞的光疗效果图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实例，进一步阐明本发明，应理解这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。

以下实施例中所用壳聚糖分子量在10kDa-1000kDa。

实施例1

本实施例荧光碳点的制备，包括以下步骤：

(1)原料的准备：称取壳聚糖、巯基丁二酸和乙二胺，使其质量比为5:2:1，三者完全溶解于稀盐酸溶液后充分混匀并转移至水热反应釜中；

(2)反应：在水热反应釜中以180℃反应24h，形成碳点溶液；

(3)纯化：离心或过滤即得目标荧光碳点溶液。

该反应的示意图见图1，制备所得荧光碳点的透射电子显微镜结果见图2，制备所得荧光碳点的紫外–可见吸收光谱见图3，制备所得荧光碳点的不同波长激发下的荧光发射光谱见图4。

实施例2到9

实施例2荧光碳点的制备步骤与实施例1相同，只是步骤(1)中壳聚糖、巯基丁二酸和乙二胺三者质量比为1:1:1。

实施例3荧光碳点的制备步骤与实施例1相同，只是步骤(1)中壳聚糖、巯基丁二酸和乙二胺三者质量比为1:1:10。

实施例4荧光碳点的制备步骤与实施例1相同，只是步骤(1)中壳聚糖、巯基丁二酸和乙二胺三者质量比为1:10:1。

实施例5荧光碳点的制备步骤与实施例1相同，只是步骤(1)中壳聚糖、巯基丁二酸和乙二胺三者质量比为1:10:10。

实施例6荧光碳点的制备步骤与实施例1相同，只是步骤(1)中壳聚糖、巯基丁二酸和乙二胺三者质量比为20:1:1。

实施例7荧光碳点的制备步骤与实施例1相同，只是步骤(1)中壳聚糖、巯基丁二酸和乙二胺三者质量比为20:1:10。

实施例8荧光碳点的制备步骤与实施例1相同，只是步骤(1)中壳聚糖、巯基丁二酸和乙二胺三者质量比为20:10:1。

实施例9荧光碳点的制备步骤与实施例1相同，只是步骤(1)中壳聚糖、巯基丁二酸和乙二胺三者质量比为2:1:1。

实施例10到11

实施例10荧光碳点的制备步骤与实施例1相同，只是步骤(2)中，反应条件为：在160℃下反应48h。

实施例11荧光碳点的制备步骤与实施例1相同，只是步骤(2)中，反应条件为：在200℃下反应12h。

实施例12

测试实施例1所制得的荧光碳点对MCF-7细胞的成像效果，方法如下：

(1)细胞培养：复苏MCF-7细胞，在RPMI-1640完全培养基中于37℃、5％CO₂环境中培养，待细胞密度长至80％左右时，用胰酶消化并通过流式细胞仪计数，使最终每个孔中细胞数量为5×10⁴个/mL，仍于37℃、5％CO₂环境中培养24h。

(2)细胞染色：分别配制线粒体染料(MitoTracker)、内质网染料(ER Tracker)、高尔基体染料(Golgi Tracker)以及溶酶体染料(LysoTracker)，与实施例1中所制得的碳点溶液混合，使混合液中碳点浓度为200μg/mL。而后，用磷酸缓冲液(PBS)清洗细胞2–3次，加入200μL已配好的混合染液，于37℃、5％CO₂环境中共孵育30min。最后用RPMI-1640完全培养基清洗细胞，除去溶液中游离的染料分子。

(3)共聚焦荧光显微镜成像观测：用波长为488nm、552nm和638nm的激光作为激发光，其中碳点经488nm激光激发发射绿色荧光，而线粒体染料经638nm激光激发发射红色荧光而内质网染料、高尔基体染料和溶酶体染料经552nm激发发射红色荧光。考虑上述染料与碳点本身的荧光发射存在一定的重叠，故每次的共染通过控制单一染色时的拍摄条件，保证在相应的拍摄条件下碳点与不同细胞器染料不会发生串色现象，以保证实验结果的准确性。

荧光成像结果见图5。由图可见，碳点的绿色荧光与线粒体染料的红色荧光重叠在一起，表明二者具有共定位的性质，也即碳点能特异地靶向到MCF-7细胞的线粒体，实现对线粒体的染色。

实施例13

测试实施例1所制得的荧光碳点对HeLa,HepG2,AT II,L02以及Raw264.7细胞的线粒体成像效果，其方法与实施例12相同，其中细胞器染料仅选择线粒体染料进行与碳点的共染。结果如图6。由图可见，实施例1所制得碳点对上述五种细胞均具有优异线粒体靶向成像的性能。

实施例14

测试实施例1所制得的荧光碳点的细胞毒性，步骤如下：选择正常肺细胞(ATII)和乳腺癌细胞(MCF-7)，以5×10⁴个/mL细胞悬液分别与浓度为0,10,20,50,100,200,500,1000μg/mL的荧光碳点孵育24h后，利用酶标仪采用MTT检测法测荧光碳点对两种细胞的毒性。结果见图7。实验结果表明荧光碳点在工作浓度(100μg/mL)及以上(200,500μg/mL)时，正常细胞和癌细胞都有80％及以上的存活率，说明该荧光碳点材料具有良好的生物相容性。

实施例15

测试实施例1所制得的荧光碳点(CDs)与孟加拉玫瑰红(RB)的化学连接，即制备CDs-RB，方法如下。

(1)RB溶于二甲基甲酰胺(DMF)，与二环己基碳二亚胺(DCC)和1-羟基苯并三唑(HoBt)按照1:6:6的物质的量比在室温活化4小时。

(2)将经活化后的RB与碳点按照1:10的质量比室温反应12小时。

(3)用分子量为1000的透析袋在二甲基亚砜(DMSO)和水的混合物中透析2天。该反应所得CDs-RB的透射电子显微镜图见图8，紫外–可见吸收光谱见图9，荧光发射光谱(以347nm为激发波长)见图10。由图可见，所制得的CDs-RB粒径为30nm左右，其在418nm处的荧光发射出现了碳点的发射峰和RB的发射峰，证明了CD-RB的成功合成，且碳点和RB之间存在一定的荧光共振能量转移现象，导致其能在418nm处激发出RB的发射峰。

实施例16

测试实施例15所制得的CDs-RB对MCF-7线粒体靶向特性，其方法与实施例13相同。结果见图11。由图可见，实施例15所制得CDs-RB在488nm激发光下所发射的绿色荧光与MitoTracker在638nm处激发所发射的红光基本重合，说明CDs-RB能特异性靶向在线粒体中，成功保持了碳点本身的靶向性质。

实施例17

测试实施例15所制得的CDs-RB与RB的MCF-7光疗效果，其方法如下：

(1)细胞培养：复苏MCF-7细胞，在RPMI-1640完全培养基中于37℃、5％CO₂环境中培养，待细胞密度长至80％左右时，用胰酶消化并通过流式细胞仪计数，使最终种96孔板时细胞数量为5×10⁴个/mL，仍于37℃、5％CO₂环境中培养24h。

(2)细胞光疗：在RPMI-1640完全培养基中配制RB溶液与CDs-RB溶液，使两者最终含有的RB浓度为5μg/mL。而后再用cell PBS清洗细胞，分别加入100μL上述配制的RB和CDs-RB溶液于相应的孔中，于37℃、5％CO₂环境中培养30min。而后用RPMI-1640完全培养基清洗2–3次。以532nm激光在不同强度(0,10,20,30,40,50mW)下分别照射5min，而后转移至37℃、5％CO₂环境中继续培养4h。

(3)细胞存活率检测：配制5mg/mL噻唑蓝(MTT)，并于每个细胞孔中加入10μL配好的5mg/mL的MTT溶液，于37℃、5％CO2环境中培养4h。而后倒出每个孔中的培养液，各加入150μL DMSO，最后用酶标仪测量在492nm处的吸光度。结果见图12。

如图12所示，在30mW的光照强度下，CDs-RB组的细胞存活率很低，在20％左右。这说明绝大部分细胞在RB的光动力治疗效果下死亡。与之相反，RB组的细胞即使在50mW强度的激光照射下，其细胞存活率仍高达90％以上，说明RB本身的光动力疗效很差。以上实验证明了CDs-RB在靶向线粒体的光动力抗癌治疗上的应用潜力。