专利名称：胸腺肽α1单克隆抗体的制备方法及用途的制作方法
技术领域：
本发明属生物技术，涉及单克隆抗体制备方法，尤其是关于胸腺肽α1的单克隆抗体制备方法，具体涉及胸腺肽α1单克隆抗体的制备方法及用途。
近年国外学者将胸腺肽提纯为几种单独成分，发现其中胸腺肽α1的生物学活性比胸腺肽混合物活性高10～1000倍。胸腺肽α1属于胸腺肽第五组分，具有免疫调节作用，在体外可以促进致敏细胞生成淋巴因子，如a-IFN，r-INF，IL-2；增强细胞因子高亲和力受体的表达；调控骨髓前体细胞和脾细胞的末端脱氧核酸转移酶(TdT)活性；增强骨髓前体细胞的Thy 1和Lyt1，2，3的表达；加速NK细胞的生成，促进NK细胞的活性；通过增强辅助T细胞的活性可以促进混合淋巴细胞的反应；拮抗胸腺细胞成熟过程中的凋亡。体内应用结果也表明其在T细胞发育和功能重建中具有重要意义；可促进淋巴细胞分泌IL-2和IL-2受体的表达；增强宿主的抗感染能力；促进病毒清除；增强免疫功能；有抗氧化、抑制癌细胞生长等重要作用；临床上常应用于治疗肿瘤，抗病毒及免疫缺陷病人的辅助治疗，并可作为疫苗增强剂使用。Chien等用胸腺肽α1治疗慢性乙型肝炎患者，其HBV DNA血清清除率和HBeAg阴转率高于未用胸腺肽α1治疗对照组，且病理学检查亦发现治疗组炎症及纤维生成情况均显著低于对照组。在治疗肝纤维化方面胸腺肽α1也有独到之处。目前发现对肝纤维化只有IFN有一定疗效，但其存在低反应性和剂量限制等缺点，Sherman等将IFN和α1合用，治疗慢性丙型肝炎，随机分组，双盲对照，观察到合用组各项检测指标均优于单用IFN组和未处理对照组，其中HCV RNA清除率为37.1％，明显高于单用IFN组的18.9％。胸腺肽α1对肝癌也有治疗作用，Stefanini等用它治疗了12例肝癌患者，发现其存活期显著延长。
胸腺肽α1的抗肿瘤和抗炎症作用十分明显，但是，胸腺肽α1作用机理至今尚未清楚，胸腺肽α1在不同的人体内含量有何不同，它是如何进入细胞，在胞内如何作用的等问题有待进一步研究。而胸腺肽α1单克隆抗体的缺乏严重制约了这方面的研究进展。
本发明胸腺肽α1单克隆抗体的制备方法包含以下步骤(1)制备抗原采用戊二醛交联法将胸腺肽α1合成肽和牛血清白蛋白交联，交联物用透析袋透析，测定蛋白质浓度。
(2)免疫小鼠取10周龄BALB/C小鼠，第一次免疫用0.1∽0.3ug胸腺肽α1交联物和福氏完全佐剂乳化，腹腔注射，再分别间隔20-40天用胸腺肽α1交联物和福氏不完全佐剂乳化，同样腹腔注射做第二次免疫和第三次免疫。并于融合前2-4天加倍量抗原尾静脉加强免疫。
(3)细胞融合、克隆化培养按常规免疫取1×108免疫小鼠脾细胞和1×107处于对数生长期FO小鼠骨髓瘤细胞，在聚乙二醇作用下融合，在小牛血清的HAT选择性培养基下培养，经过三次抗体阳性筛选后扩大培养，并以1×106/ml细胞，0.5ml/只腹腔注射诱生腹水产生。
(4)抗体检测和特异性鉴定采用ELISA间接法，Western免疫印迹法等方法对所得到的胸腺肽α1单克隆抗体进行鉴定，并用单克隆抗体Ig亚类鉴定法证实所表达单克隆抗体Ig亚类为IgG2b。
本发明的另一个目的是利用获得的胸腺肽α1单克隆抗体，制备成多种检测试剂，包括ELISA试剂盒、放免试剂盒等，用于研究胸腺肽α1作用机理以及胸腺肽α1表达水平的检测。
本发明有两个显著特点1.本发明制备的单克隆抗体是针对胸腺肽α1 28肽的单克隆抗体；2.利用本发明可以获得大量纯的胸腺肽α1单克隆抗体。
实施例1本发明涉及到的胸腺肽α1单克隆抗体的一个制备方法(1)制备抗原采用戊二醛交联法将胸腺肽α1合成肽和牛血清白蛋白交联，交联物用透析袋透析，测定蛋白质浓度。
(2)免疫小鼠取10周龄BALB/C小鼠，第一次免疫用0.1ug胸腺肽α1交联物和福氏完全佐剂乳化，腹腔注射，每只小鼠0.2ml，再分别间隔一个月用胸腺肽α1交联物和福氏不完全佐剂乳化，同样剂量腹腔注射，做第二次免疫和第三次免疫。并于融合前3天加倍量抗原尾静脉加强免疫。
(3)细胞融合、克隆化培养按常规免疫取1×108免疫小鼠脾细胞和1×107处于对数生长期FO小鼠骨髓瘤细胞，在50％聚乙二醇(PEG，MW 4000，Sigma)作用下融合，在20％小牛血清的HAT选择性培养基下培养，经过三次100％抗体阳性筛选后扩大培养，并以1×106/ml细胞，0.5ml/只腹腔注射诱生腹水产生。
(4)抗体检测和特异性鉴定采用ELISA间接法，Western免疫印迹法等方法对所得到的胸腺肽α1单克隆抗体进行鉴定，并用单克隆抗体Ig亚类鉴定法证实所表达单克隆抗体Ig亚类为IgG2b。
实施例2胸腺肽α1单克隆抗体的几个应用应用该发明技术，获得的胸腺肽α1单克隆抗体，可以制备成ELISA试剂盒，放免试剂盒等，用于检测人外周血中胸腺肽α1的含量；也可用于研究胸腺肽α1的作用机理等，评价胸腺肽α1治疗流行性感冒，慢性肝炎，免疫功能低下，恶性肿瘤等疾病的疗效，具有极大的社会效益和经济效益。
无需进一步详细阐述，相信采用前面所公开的内容，本领域技术人员可最大限度地应用本发明。因此，前面的优选具体实施方案应理解为仅是举例说明，而非以任何方式限制本发明的范围。
本发明涉及的部分参考文献[1]Goldstein A L，Low TL，McAdoo M，et al.Thymosin alphalisolationand sequence analysis of an immunologically active thymic polypeptide[j].Proc Natl Acad Sci USA，1977，74(2)725[2]傅华林，甘人宝。胸腺素α1及其临床应用。生命的化学1997，1743-45[3]Garaci E，Pica-F，Mastino A，et al.Combination treatment withzidovudine thymosin alpha 1 and interferon-alpha in humanimmunodeficiency virus infection.Int J Immunother 1993，13(1)7[4]Korba BE，Tennant BC，Cote PJ，et al.Treatment of chronic woodchackhepatitis virus infection with thymosin alpha 1[J].Hepatology，1990，12880[5]Stefanini G F，Faschi F G，Castelli E，et al.Thymosin a1 andtranscatheter aterial chemombolization in hepatocellular carcinomapatientsa preliminary experience.Hepatogastroenterology 1998，45209-215[6]Frederick E，Weller，Milton G，et al.Mi croELISA method for measuementof human serum thymosin a1.Journal of Immunological Methods 1985，80，45-53[7]Genevieve S，Incefy，Kazumi Ishimura.A radioimmunoassay for thymosinalphal-1.Journal of Immunological Methods 1986，87，9-17[8]Baumann C A，Badanchian M，Goldstein A L.Thymosin a1.antagonizesdexamethasune and CD3-induced apoptosis of CD4+，CD8+thymocytes throughthe activation of cAMP and protein kinase C dependent second messengerpathways.Mech Aging Dev 1997；9485-101[9]梁喆，王德堂，米力，等，系列杂色法分析人-(人-鼠)杂交瘤C8的染色体。第四军医大学学报，1994，158[10]Andreakos E，Taylor PC，Feldmann M.Monoclonal antibodies in immuneand inflammatory diseases.Curr Opin Biotechnol.2002 Dec；13(6)615-20[11]Ando T，Latif R，Pritsker A，et al.A monoclonal thyroid-stimulatingantibody.J Clin Invest.2002 Dec；110(11)1667-74.
权利要求
1.一种胸腺肽α1单克隆抗体的制备方法及用途，其特征是由胸腺肽α1合成肽纯品免疫的Balb/c小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合产生的融合细胞所表达，获得胸腺肽α1单克隆抗体，利用获得的胸腺肽α1单克隆抗体可制备多种检测试剂，用于研究胸腺肽α1作用机理以及胸腺肽α1表达水平的检测。
2.如权利要求1所述的胸腺肽α1单克隆抗体的制备方法，其特征是该方法包含以下步骤(1)制备抗原采用戊二醛交联法将胸腺肽α1合成肽和牛血清白蛋白交联，交联物用透析袋透析，测定蛋白质浓度。(2)免疫小鼠取BALB/C小鼠，第一次免疫用0.1∽0.3ug胸腺肽α1交联物和福氏完全佐剂乳化，再分别间隔20-40天用胸腺肽α1交联物和福氏不完全佐剂乳化，做第二次免疫和第三次免疫，并于融合前2-4天加倍量抗原加强免疫。(3)细胞融合、克隆化培养按常规免疫取免疫小鼠脾细胞和处于对数生长期FO小鼠骨髓瘤细胞，在聚乙二醇作用下融合，在小牛血清的HAT选择性培养基下培养，经过三次抗体阳性筛选后扩大培养，腹腔注射诱生腹水产生。(4)抗体检测和特异性鉴定采用ELISA间接法，Western免疫印迹法等方法对所得到的胸腺肽α1单克隆抗体进行鉴定，并用单克隆抗体Ig亚类鉴定法证实所表达单克隆抗体Ig亚类为IgG2b。
3.如权利要求1所述的胸腺肽α1单克隆抗体的用途，其特征是用本发明获得的胸腺肽α1单克隆抗体，可制备成包括ELISA试剂盒、放免试剂盒等检测试剂，用于研究胸腺肽α1作用机理以及胸腺肽α1表达水平的检测。
全文摘要
本发明提供一种胸腺肽α1单克隆抗体的制备方法及用途，是由胸腺肽α1合成肽纯品免疫的Balb/c小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合产生的融合细胞表达获得胸腺肽α1单克隆抗体，用该方法获得的胸腺肽α1单克隆抗体，可制备成多种检测试剂，用于研究胸腺肽α1作用机理以及胸腺肽α1表达水平的检测。
文档编号G01N33/577GK1424327SQ02159878
公开日2003年6月18日 申请日期2002年12月24日 优先权日2002年12月24日
发明者陈智, 陈 峰 申请人:浙江大学