将化合物结合到表面的方法

专利名称：将化合物结合到表面的方法
技术领域：
本发明涉及一种将化合物结合到至少一部分物体表面的方法，该方法包括将疏水蛋白样(hydrophobin-like)物质吸附到该表面的步骤。
典型地，疏水蛋白是一类由真菌和细菌分泌的富含半胱氨酸的小分子蛋白质，在遇到亲水-疏水界面时会装配形成两亲性膜。一些疏水蛋白形成的两亲性膜并不稳定，而另一些疏水蛋白则会形成极其稳定的两亲性膜。在壁-空气界面装配时，它们中的一些蛋白会形成一个疏水表面，其具有如气生菌丝和孢子上的棒状超微结构。有些疏水蛋白可以在水-油界面或者疏水固体界面上装配形成两亲性膜，并参与粘附现象。疏水蛋白是真菌大量产生的蛋白质中的一种，或许是为了某些特定目的，各个物种都可能含有几个产生不同疏水蛋白的基因。疏水蛋白现被认为和多种发育过程相关联，比如气生菌丝，子实体和分生孢子的形成，并且在真菌生态中发挥重要作用，包括孢子传播，致病机理和共生。
疏水蛋白在真菌生长和发育过程中的诸多方面都具有功能。比如，它们参与疏水性气生结构(如气生菌丝和子实体)的形成，同时还介导菌丝与疏水性的附着而产生形态发生信号。这些功能的机理都是基于疏水蛋白具有在亲水-疏水界面自装配形成两亲性膜的特性。
由水下菌丝分泌的疏水蛋白可以在水环境中散播，并在空气和培养基的界面上自装配(self-assemble)。伴随着水表面张力的骤降，使得这些菌丝可以突破界面从而在空气中生长。另一方面，由接触疏水环境的菌丝分泌的疏水蛋白会在菌丝表面自装配。两亲性膜的亲水面和细胞壁的亲水性多糖相互作用，而疏水面则会暴露给疏水环境。于是，气生菌丝和孢子变成了疏水性的，而生长于疏水性物质上的菌丝则更加紧密地附着在上面。因此疏水蛋白在真菌的环境中和菌丝表面是有活性的。而且，它们也在细胞壁的基质中有作用而在某正程度上影响细胞壁的组成。在这种情况下，参与的似乎是单体疏水蛋白，而不是自装配的疏水蛋白。就通过测试而知的而言，群交裂褶菌(Schizophyllum commune)的SC3是最典型的I类疏水蛋白，该类中的其它成员也具有相似的性质。一旦与亲水-疏水性界面相接触，SC3单体就自装配形成一10nm厚的两亲性膜。SC3膜的亲水面和疏水面具有的水接触角度分别为36°和110°，使得这样的界面(碳水化合物相比)更适度的亲水及(与特氟隆(teflon)相比)更适度的疏水。SC3在界面上自装配涉及几种构象改变。富含β-折叠的单体一开始采取的是含有较高α-螺旋的构象(α-螺旋状态)。SC3在水-特氟隆界面上就停滞成为这样一种中间过渡状态，而在水-空气界面上蛋白质却成为具有较高β-折叠的形式。起初，所谓的β-折叠状态并没有清晰的超微结构(β-折叠状态I)，但在数小时后，却可以观察到10nm宽棒状束的图案(mosaic)(β-折叠状态II)。伴随这样的超微结构变化并没有检测到相应的二级结构改变。从α-螺旋状态向β-折叠状态的转变同样也可以发生在水-固体界面上，但需要通过升高温度及添加去污剂来诱导。一旦发生了自装配，疏水蛋白的性质就会发生改变。β-折叠状态的疏水蛋白具有极高的表面活性，而单体却没有可检测的表面活性。而且，凝集素活性也增强了。另外，相对于β-折叠状态，α-螺旋状态形式显得更加的不稳定。尽管两种状态都可以强烈地粘附于疏水性表面，α-螺旋形式却可以通过用稀释的冷去污剂处理来解离并转化为单体形式。相反，β-折叠形式的构象及其与疏水性固体的相互作用则不受这样处理的影响。无论是否经过化学或遗传学修饰，疏水蛋白都可以用来改变某个表面的生物物理学性质。这样就可以控制分子或细胞与表面的结合。比如，可以降低致病细菌与导管表面的结合，而也可以增强人成纤维细胞与植入物表面的结合。除了改变生物物理学性质，疏水蛋白还可以用来将某些分子粘附到那些它们通常并不具有高亲和力的表面上。粘附可以通过先将疏水蛋白装配到表面上然后再进行化学交联来完成。例如，通过希夫碱反应(Schiff-basereaction)，可以将蛋白质附着于装配的SC3的亲水性表面的甘露糖残基上。或者，当是蛋白质和多肽时，也可以在制成融合蛋白之后再在感兴趣的表面上装配。本文术语“疏水蛋白样物质”指本质上分离和纯化的两性蛋白质，它们可以包被某种表面，赋予疏水性表面本质上的亲水性，反之亦然，即赋予亲水性表面本质上的疏水性，并且这样的蛋白质不仅包括那些分离自天然的，本质上不含有如碳水化合物聚合物如schyzophylan等真菌组分的疏水蛋白，也包括那些经过化学修饰的已知的典型疏水蛋白或者通过遗传修饰疏水蛋白基因来获得目前自然界不存在的遗传修饰的蛋白质而获得的物质。已知的典型疏水蛋白(见例如WO96/41882，其提供了获得遗传修饰的疏水蛋白样物质的指导)一般是具有直至125个氨基酸长的蛋白质，具有保守序列Xn-C-X5-9-C-C-X11-39-C-X8-23-C-X5-9-C-C-X6-18-C-Xm，其中X代表任何的氨基酸，n和m各自代表整数，如Wessel等揭示(ref.8)。大多数典型的疏水蛋白都含有8个保守的半胱氨酸残基，其形成4个二硫键。然而，当疏水蛋白的二硫键通过化学修饰被还原及巯基被如碘乙酰胺所封闭(blocking)时，在没有亲水-疏水界面时该蛋白就会在水中装配。这样的结构与在水-空气界面上装配的天然疏水蛋白的结构并不能区分开来。显然，疏水蛋白的二硫键保持了单体在水中的可溶性，例如在产生它们的细胞中或者在亲水-疏水界面上发生自装配的培养基中，但从本质上而言，二硫键对疏水蛋白的两性性质却非必需的。
已知I类和II类疏水蛋白的长度都大约为100个氨基酸，都具有典型的疏水性模式。大多数，但不是全部，都含有八个保守的半胱氨酸残基，其形成分子内二硫键。疏水蛋白可以被糖基化，但它们所具有的典型的两性性质却只和它们的氨基酸序列有关。尽管II类疏水蛋白的氨基酸序列相对来说更保守一些，I类疏水蛋白却示出低同源性。所以，虽然并非不可能，但是想通过例如聚合酶链式反应设计通用引物来获得I类疏水蛋白基因是相当困难的。
事实上，所有物理分离的疏水蛋白都在亲水-疏水界面自装配形成两亲性膜。疏水蛋白膜的一面具有较高的亲水性(水接触角低于90°，例如介于22°和63°之间)，而另一面的水接触角则本质上大于90°，例如在93°到140°之间，例如与特氟隆(聚四氟乙烯)和石蜡(水接触角大约110°)具有同样的疏水性。由I类疏水蛋白(例如来自于群交裂褶菌的SC3和SC4)所形成的膜是高度不溶性的(在100℃时与2％十二烷基硫酸钠(SDS)不发生反应)，但却可被甲酸(FA)和三氟乙酸(TFA)所解离。相反，Ophiostoma ulmi的II类疏水蛋白cerato-ulmin(CU)和板栗疫病菌(Cryphonectria parasitica)的II类疏水蛋白cryparin(CRP)形成的膜却可以在60％乙醇和2％SDS中容易地解离，而装配的CU已知可以通过加压或者降温的方式解离。疏水蛋白在自装配时伴随着构象变化。I类和II类疏水蛋白的单体都富含β-折叠结构。在水-空气界面，I类疏水蛋白具有更多的β-折叠结构(称为β-折叠状态)，而在水和疏水固体之间的界面则可以观察到具有增多的α-螺旋结构的形式(称为α-螺旋状态)。α-螺旋状态看来是自装配的一种中间过渡状态，而β-折叠状态则像是稳定的最终形式。在水-空气界面，I类疏水蛋白的单体在几秒钟之内就可以成为α-螺旋状态，但向β-折叠状态的转变则更缓慢，需要数分钟到数小时。在水-固体界面，该蛋白也很容易成为α-螺旋状态，但却认为停滞于这一中间过渡状态。通过组合应用加热和稀释的去污剂可以使其达到β-折叠的最终状态。以上两种形式的装配的疏水蛋白都具有两亲性的性质，并可以用TFA解离，TFA使蛋白质解折叠。在除去溶剂和溶于水后，I类疏水蛋白可以重新折叠成与纯化前或TFA处理前同样的单体结构。然而，即使通过TFA使膜解离之后，II类疏水蛋白的自装配和解装配依然可反复进行。这说明两类疏水蛋白对这类处理都具高度的耐受力。I类疏水蛋白的膜特征在于5-12nm宽的平行棒状束图案。相反，在装配的Claviceps fusiformis的II类疏水蛋白CFTH1、板栗疫病菌的II类疏水蛋白CRP和里氏木霉(Trichoderma reesei)的II类疏水蛋白HFB1和HFB2的表面上却并未发现这样的棒结构。这些棒结构的存在与否或者是棒直径的不同对它们功能的影响程度目前还不清楚。I类疏水蛋白所具有的棒状结构，如群交裂褶菌的SC3和SC4，都与由淀粉样蛋白形成的纤维很相似。它们由两道直径约为2.5nm的2-3根原纤维组成，含有高度的β-折叠结构，可以与荧光染料Thioflavine T(ThT)和刚果红相互作用。这些染料都可以作为探针来区别α-螺旋状态和β-折叠状态，两种染料对β-折叠状态的染色都具有极高的倾向性，而对α-螺旋状态或可溶的疏水蛋白样物质却不反应或很少反应。另外，通过中间物及超过临界浓度，SC3和淀粉样蛋白都会自装配。这提示对即使不是全部，也是很多多肽链而言，淀粉样纤维的形成是共有的。然而，因为淀粉样纤维的形成往往伴随着功能的丧失甚至是疾病(如阿耳茨海默症)，进化上并不会采取形成这种纤维的倾向。然而，一或两个蛋白质上的突变就足以显著增加形成淀粉样纤维的倾向。就我们的知识而言，疏水蛋白是第一个有功能的纤维样蛋白的实例，其在真菌的发育过程中具有多种功能。最近发现SC3疏水蛋白中的四个二硫键的主要作用是在缺乏亲水-疏水界面时防止蛋白质形成淀粉样结构。当二硫键被还原及巯基被碘乙酰胺封闭时，蛋白就会自发地在水中进行装配。于是其结构与在水-空气界面上装配的天然SC3的就不能区别开。显然，疏水蛋白的二硫键使得单体在水中可溶(如在细胞内或在培养基中)，并阻止过早的(precocious)自装配。这可以解释为什么自然界中大多数疏水蛋白都具有八个保守的半胱氨酸残基。疏水蛋白属于最具有表面活性的分子。在50μg/ml-1时，SC3最大能将水的表面张力从72mJ m-2降低到24mJ m-2，由此SC3是已知最具有表面活性的蛋白。其它的疏水蛋白也具有很高的表面活性。它们的表面降低活性(surface-loweringactivity)至少与传统的生物表面活性剂相似。与这些表面活性剂不同，表面活性仅由氨基酸序列引起，而不依赖于脂质缀合物。而且，通过传统的表面活性剂在数秒内最大降低表面张力，而采用I类疏水蛋白时需要数小时的时间。这是因为伴随着分子内构象变化的自组装之后，疏水蛋白可以降低水的表面张力。
尽管疏水蛋白具有相当多的种类，但是它们的主要性质都是相似的。它们的适应性可见下述事实通过遗传工程除去SC3疏水蛋白第一个半胱氨酸残基之前31个氨基酸中的25个，所获得的截短的SC3仅会影响装配好的疏水蛋白亲水面的可湿性(wettability)。最具有特点的疏水蛋白是C.fusiformis的三疏水蛋白(trihydrophobin)CFTH1。它含有三个II类疏水蛋白样单位，每一个之前都具有富含Gly-Asn的重复，并仍然具有和其它II类疏水蛋白一样的作用。因为疏水蛋白可以通过在界面上自装配形成两亲性蛋白膜，所以疏水蛋白可以改变表面的可湿性。
如述，一种测量可湿性的方法是估计或测量一滴水与该表面的接触角。大接触角(＞90°)说明是疏水的，小接触角(＜90°)说明是亲水表面。而且，在气/液和液/液体系中，比如剧烈摇晃的水或者是水包油或油包水分散体系，疏水蛋白溶液中的气泡或油滴可以包被上一层两亲性膜使之稳定。固/液界面也示出相同的稳定作用，例如将一个疏水的塑料如特氟隆薄片(接触角110°)浸入疏水蛋白中，其会被包被一层具有强烈粘附蛋白的膜，其使得表面完全可湿(接触角48°)，即使在经过SDS处理后(接触角62°)，而且疏水蛋白单体从一个亲水的表面上干燥脱离下来，将使得该表面成为疏水性的。
典型的疏水蛋白是i)典型地从如群交裂褶菌等真菌中分离得到的(参考文献8)，但现在也可以重组制备；或ii)具有与至少一种多肽至少具有40％的相同性和至少5％的相似性的多肽，所述至少一种多肽选自i)SEQ ID NO.1的29-131位氨基酸和ii)SEQ ID NO.2的29-133位氨基酸。这样的蛋白可以来自丝状细菌，特别是可形成气生菌丝的细菌，如放线菌，更特别地，丝状细菌可以是链霉菌。可以从中通过采用标准方法分离疏水蛋白的链霉菌是一种转化了可以从大肠杆菌(E.coli)菌株中分离的构建体的链霉菌，其于2000年3月14日保藏在Centraalbureau voor Schimmelcultures(Oosterstraat 1，P.O.Box 273，3740 AG B aarn，the Netherlands)，其保藏号为CBS102638。见于PCT/NL01/00268。Scholtmeijer等(Appl.Environm.Microbiol.68(3)，pp.1367-1373，2002)曾采用疏水蛋白和纤连蛋白的细胞结合结构域的融合蛋白来为疏水蛋白层提供活性化合物(reactivecompound)。
如果不采用融合蛋白，就只可能通过共价偶联的方式为疏水蛋白层提供活性化合物。考虑到甘露糖是已知疏水蛋白唯一的糖基化形式，它也就成为和疏水蛋白进行共价交联的靶位置。特别是Wessels等人(Advances in Microbial Physiology，38，pp.1-45(1997))建议通过共价结合为疏水蛋白层附着小配体，或者是将氨基与甘露糖残基的醛基偶联(p.35)。那个例子涉及到在金表面上将一种蛋白质偶联到疏水蛋白层上。除此之外，Scholtmeijer等人(Appl.Microbiol.Biotechnol.56，pp.1-8，2001)建议将疏水蛋白和活性化合物，或是作为替代物的融合蛋白进行化学交联。然而，对某些活性化合物来说，如果不破坏活性化合物的功能性，要将这些化合物与疏水蛋白进行交联或融合是不可能的。
而且，Bilewicz等人在J.Phys.Chem.B 2001，105，9772-9777，2001年8月，描述过一种方法，可以采用小的电活性化合物Q10，偶氮苯或Q0对电极表面进行功能化，说明疏水蛋白HYPDPt-1可以作为分子胶，或者是根据电活性分子的结构作为它们的基质(matrix)。然而，仍需要提供活性化合物给疏水蛋白层的方法，所述化合物对其发挥生物学功能而依赖的结构的变化敏感。
本发明提供了这样一种提供活性化合物而非小分子电活性化合物给某种物体表面的方法，该方法包括如下步骤用疏水蛋白样物质包被至少一部分上述表面，并将所述化合物与包被的疏水蛋白样物质接触以形成一种涂层，所述涂层包含非共价结合形式的或者至少与疏水蛋白非共价结合的所述化合物。在这里定义的小分子电活性化合物是可以在氧化状态，即氧化还原反应中发生改变的化合物，而且它的分子量要小于疏水蛋白的分子量，特别地分子量要小于2000道尔顿，更特别地小于1000道尔顿。在这里定义的活性化合物包括蛋白质(包括肽和糖蛋白)和核酸。
在此，本发明提供了一个方法，其中第一个(非共价附着的)活性化合物包括例如蛋白质物质，如肽，但更有利的是一种具有比已知疏水蛋白分子量(15kD)更高分子量的多肽，所述多肽仍旧非共价地附着于所述涂层且基本上未失去反应性。令人惊奇的是，通过将所述表面浸入包含所述化合物的溶液就能将这种化合物基本上非共价地附着到表面上，从而优选保留所述化合物的反应性，如酶活性或与配体或抗原结合的倾向性。共价偶联被传统地认为主要与糖基化疏水蛋白的存在相关，现在认为当该涂层基本上不含进行这种共价偶联所需的甘露糖残基时，所述表面也可以具有更大的分子。这促使使用其它疏水蛋白样物质包被较大分子附着的物体表面。常规使用SC3，其在自然状态下具有一个包含糖基化残基的N端，也可以采用非糖基化物质，如没有所述糖基化N端的trSC3(截短的SC3)，还可以采用其它具有两亲性蛋白质特性的疏水蛋白样物质，例如不是所有经典保守半胱氨酸残基均处于各自位置并能够提供具有亲水朝向的疏水表面的物质，反之亦然。
在一个实施方案中，本发明提供了这样一个物体，它有至少一部分表面具有两亲性疏水蛋白样涂层(膜)，其中所述涂层额外具有一种非小分子电活性化合物的活性化合物。令人惊奇的是，发现该活性化合物具有比例如Q10，偶氮苯和Q0大的多的分子量，现在对分子量(MW)大于1千道尔顿(kD)，优选大于2kD，更优选大于15kD，更优选大于50kD的活性化合物可以提供非共价结合。而且，当该涂层基本上不含甘露糖残基时也具有结合，从而可以结合肽、多肽或者其它蛋白质物质而无需共价交联到甘露糖残基，使得有更多的疏水蛋白样物质可以与活性物质结合而不仅仅是经典已知的糖基化疏水蛋白。如上所述，这样的结合现在允许酶、受体、抗体、结合分子本身和其它活性蛋白质的结合(或者对核酸而言的杂交)不被其(二级或三级结构)构象限制所阻碍(而这种构象限制的阻碍在传统的交联过程中经常碰到)，因此可以保持其完整的反应性。固定化蛋白质，如酶或抗体的优越性在于随时间的稳定性延长以及观察到对高温以及更极端pH值的稳定性增加。
在另一个实例中，一个物体优选包含进行例如基因表达分析的基因芯片或DNA(或RNA或PNA)阵列，其中所述活性化合物包含核酸。非共价结合于所述疏水蛋白样涂层上的核酸可以用来改进杂交方案。
大体上，本发明提供了具有一种表面的物体，所述表面包含疏水/亲水性界面，还包含非小分子电活性化合物的活性化合物，这样的表面可以包括液/液界面，如油/水界面；也包括固/液界面，如固/水界面，或甚至固/固界面，尤其是其中第一个固体包含疏水性表面，而第二个固体包含亲水性表面。本发明提供了获得一种物体的方法，所述物体在所述界面的至少部分表面具有两亲性疏水蛋白样涂层，其中所述涂层额外具有活性化合物，使得所述化合物保持反应性，即稳定和有活性，甚至可以在基本上无水或甚至是在包被表面完全干燥的条件下延长储存时间，该方法包括如下步骤将所述物体与疏水蛋白样化合物的溶液接触以获得一个包被物体，将所述包被物体与含有至少一种活性化合物的溶液接触，在适于包被所述表面和将所述活性化合物附着到所述涂层的条件下进行。使用疏水蛋白样物质的一大优越性是它可以被大量地廉价地生产。疏水蛋白样物质也可以从自然界分离得到，或者根据Wessels和Wsten等人(Wessels，J.G.，1997，A dv.Microb.Physiol 381-45；Wosten，H.A.B.et al.，1993，The Plant Cell 51567-1574)及其修饰方法通过遗传修饰的生物体并纯化获得。使用前，冷冻干燥的疏水蛋白样物质可以用纯TFA解装配，再用液氮或在空气中过滤干燥。单体蛋白可溶解于如50mM磷酸缓冲液或水溶液中。
如前所述，疏水蛋白是真菌分泌的最丰富的蛋白质之一。由于装配的膜的稳定性，I类疏水蛋白最有应用的希望。这类疏水蛋白在担子菌的培养基中特别丰富。比如，可以计算出，在生长了4天的群交裂褶菌的培养基中，大约有15％的整合入蛋白质的35S都合成SC3疏水蛋白，基于该蛋白特别的性质，通过简单的程序从每升培养基中可以轻松地纯化20mg的SC3，在疏水/亲水性界面浸渍可以积聚疏水蛋白样物质。株系选择，选择产生遗传修饰的疏水蛋白的株系和优化培养条件以及分子遗传方法，如增加基因剂量和在发酵工业中常用真菌中进行异源生产都可以进一步提高产量。另一个方面，针对某些应用所需的量通常很少。从自然界制造了一种“昂贵的”产物作为改变表面的可湿性的蛋白质来看，就可以容易理解这个问题。事实上，装配的两亲性膜真正性质需要其以单层存在。用单层的疏水蛋白样物质包被的表面不仅可以用单一的单层包被，还可以用多个单层所述物质包被。这种单层膜的厚度仅大约为10nm，因此需要极少量的疏水蛋白就可以显著改变可湿性。例如，从吸附到特氟隆上的SC3分子数中，就能计算出大约1.5mg的SC3疏水蛋白就足够包被1m2的特氟隆表面，使得该表面的疏水程度从110°降低到48°水接触角。
从大自然学到的另外重要一课是真菌产生不同的疏水蛋白以作为不同的目的。比如，在群交裂褶菌中，SC3膜是包被气生菌丝并为这些结构提供了水排斥特性(water-repellent property)，而在子实体的气道中则排列着SC4疏水蛋白。人们怀疑是否这些膜的生物物理学性质的不同导致了不同的功能，尤其是因为来自于众多不同物种的疏水蛋白可能比同一个物种的不同疏水蛋白更加密切相关。在为特定目的使用遗传工程加工疏水蛋白前，这是一个在仿生学上需要认真考虑的一点。
为此，本发明的具有包被的表面的物体发现可以在组织工程中应用，尤其是用于包被疏水性表面以增加它的生物相容性。已指出，疏水蛋白膜与疏水性表面的附着非常牢固，而且显著地改变了表面可湿性。例如，本发明的具有包被的表面的物体还发现可以应用于提高改善医学植入物的生物相容性，所述医学植入物包括人造血管和外科手术器械。而且，如疏水性固体或液体(油)的物体也可以通过用疏水蛋白包被之后分散在水中。用疏水蛋白膜包被的油小泡(oil vesicle)可以例如用来运送亲脂性药物。简单的说，用剧烈改变表面性质的非常薄的层(大约10nm)包被表面的疏水蛋白的性质使其可以用于纳米技术。开始时，单体形式是最水溶性的，然而与装配状态(α-螺旋状态或者β-折叠状态)不同，在溶液中可以发现一些四聚体。装配可以在很大的温度范围内进行，然而为包含活性化合物，应该根据这样的活性化合物热降解的个体敏感性进行。例如，大多数酶在超过50℃后会变得不稳定；然而，也可以使用热稳定酶。一般来说，包被随时间改善，于是一般都是用大约16小时(即过夜)来包被一个表面。然而，根据溶液中单体的浓度，疏水蛋白包被30秒以后就已经发生。如果通过所述化合物的自装配所述溶液能够在所述物体的表面上形成上述单层，就获得了充分的包被。这样的溶液在每毫升中含有至少100ng，更好是1mg，优选2mg，更优选20-100mg的疏水蛋白样化合物。从本质上来说，过量通常只会加速包被而不会改善包被。优选一种方法，其中在将所述包被的物体和所述活性化合物接触之前，用疏水蛋白样物质预处理所述包被的物体。还优选选择预处理，其包括将所述包被的物体和去污剂溶液接触，如Tween 20(Polysorbate 20)，NP40(Nonidet P-40)或SDS溶液。在用疏水蛋白包被之后，优选在30-80℃在所述溶液中加热所述包被的物体。或者，可以选择α-螺旋状态或者是β-折叠状态。
本发明还提供了一种方法，其中在固定活性化合物之后，物体用两亲性疏水蛋白样化合物固定，至少80％，更好90％或优选99％的α-螺旋状态，因而为阵列系统提供了一种封闭方法。这样，本发明提供了一种获得某种物体的方法，如用于探测核酸(DNA，RNA或PNA)的阵列系统，或者用于免疫分析的分析系统(ELISA板，或者是其它如在抗原抗体之间发生的结合相互作用的表面)，其至少部分表面具有活性化合物，其中所述表面额外具有两亲性疏水蛋白样包被。这样的封闭由疏水蛋白样包被组成，其主要呈α-螺旋状态。本发明也提供了在此所述的在对物体表面进行包被的方法的应用。所述表面可以是简单的直线或是复杂的曲面，可以在物体内部也可以在外部。例如，可以通过排列具有本发明的活性化合物的疏水蛋白样物质的毛细管来调节小管(small tube)、微球体或微海绵的毛细管活性。
在此特别提供了具有蛋白质性质的活性分子的物体表面，这些分子可包括传统的(多/单克隆)或合成抗体或其片段，如Fab或单链抗体或者是其它结合分子(任选还可以包括酶，如过氧化物酶或者荧光基团)，酶，如葡萄糖氧化酶，胆固醇氧化酶，或者是过氧化物酶，或者是本文详细描述中的单加氧酶，或是碱性磷酸酶，萤光素酶，酯酶，脂肪酶，或胰蛋白酶，或酶组合，用来测量配体相互作用的受体，光受体或集光复合体，及其组合等。共价结合往往导致反应性的丧失，这些化合物结合本专利的方法可以尤其基本上保持它们对配体、抗原、底物等的反应性，可能是因为它们与包被之间的键是非共价的。这样的反应性可以例如通过表面等离子共振(surface plasmonresonance，SPR，也称为BIACORE传感系统)测量，它可以不使用标记而对分子间相互作用进行实时的灵敏检测。对金物体表面(疏水的)用疏水蛋白溶液包被只需要温育一会儿即可(一般来说，半小时就足够了)。然后表面用水清洗以去处任何未结合的疏水蛋白。表面可以用去污剂处理以获得β折叠状态包被。表面可以直接用于结合小分子(如泛醌)、肽、蛋白质、酶、脂质、核酸等。质量的增加可以被检测而且是一种定量测定结合到用疏水蛋白包被的一定表面区域的物质量的手段。
本发明也提供了具有一种表面的物体，所述表面可以用来检测特异的分子间相互作用，比如，在展示技术或ELISA类型的分析中检测抗原-抗体的相互作用，或者检测核酸与核酸之间的相互作用，可以是DNA、RNA或PNA。疏水蛋白的两亲性性质使得其成为理想的封闭试剂。用疏水蛋白样物质包被疏水表面降低了疏水表面“粘性”，从而降低了疏水化合物和疏水区域的α-特异性结合。这将有助于改善如此的检测方法。本发明提供了具有一种表面的物体，所述表面至少一部分具有活性化合物，其中所述表面还额外具有疏水蛋白样化合物以降低与所述表面不必要的α-特异性相互作用。在优选的实施方案中，一个固体支持物表面，如ELISA板，用抗体进行包被之后再用疏水蛋白单体的溶液进行处理，使得该化合物的反应性基本保持不变，并降低所述表面的α-特异结合性。特别地，化合物是一种疏水性化合物或含有疏水性锚的化合物。这样的化合物在疏水蛋白包被中是最稳定保持的一类化合物。认为平面疏水性化合物或锚都是有利的。本申请中术语“锚”指该化合物中的一部分，所述部分具有没有亲水性基团的一侧和/或部分。认为正和/或负电荷的缺少或者降低是有利的。如果存在电荷，优选来自弱酸性或碱性基团，其可以释放或者接受一个氢离子来消除电荷。
本发明将在此进一步通过实施例进行详细的描述。
发明详述1、葡萄糖氧化酶在玻璃碳电极上的固定化通过将电极置于疏水蛋白(100μg/ml)的溶液中温育15分钟而将玻璃碳电极(glassy carbon electrode)用疏水蛋白包被，然后用水彻底冲洗电极。随后，将包被的电极浸入含有葡萄糖氧化酶(SIGMA210,000单位/g固体，终浓度为1.8mg/ml)的溶液中2小时，然后用水冲洗。
将用酶修饰和功能化的电极置于一个三电极系统(three electrodesystem)中，所述系统包括Ag/AgCl参比电极和Pt计数电极(counterelectrode)，使用pH7(25mM)的磷酸缓冲液。当加入葡萄糖时，固定化的葡萄糖氧化酶催化反应形成过氧化氢，其可以被检测到小电流，该电流与葡萄糖浓度成正比。在疏水蛋白层中固定化的葡萄糖氧化酶还保持活性。将修饰电极于4℃保存在密封容器中，而不是保存于液体中，并且频繁测试其对葡萄糖的活性和反应。在67天的测试期中，该电极具有活性，并没有受到频繁测试的影响。
2、胆固醇氧化酶在玻璃碳电极上的固定化通过将电极置于疏水蛋白(100μg/ml)的溶液中温育15分钟将玻璃碳电极用疏水蛋白包被，然后用水充分冲洗电极。随后，将包被的电极浸入含有胆固醇氧化酶(2mg/ml)的溶液中2小时，然后用水冲洗。将用酶(胆固醇氧化酶0.5U/ml)修饰和功能化的电极置于一个三电极系统中，所述系统包括Ag/AgCl参比电极和Pt计数电极，使用pH7(25mM)的磷酸缓冲液作为电解质。为克服胆固醇在水中的低溶解性，胆固醇溶解于含有异丙醇和Triton的磷酸缓冲液中(Ropers，M-H.et al.，2001，Phys.Chem.Chem.Phys.3240-245)。
在加入胆固醇后，固定化的胆固醇氧化酶催化反应形成过氧化氢。过氧化氢可以在电极上形成可检测到的小电流，该电流与所加入的胆固醇浓度相关。本实施例证明了胆固醇氧化酶的固定化，而且其依然有活性。
3、葡萄糖氧化酶和过氧化物酶的固定化除了可以在电极表面进行固定化之外，葡萄糖氧化酶还可以在包被的特氟隆(聚四氟乙烯，PTEE)薄片上固定化。包被是在25℃在3ml玻璃管中将特氟隆薄片在2ml的100μg/ml的疏水蛋白溶液(在这里对SC3，trSC3和SC4进行了分别的实验)中温育15分钟来完成的。这些薄片随后从疏水蛋白溶液中取出并用大量水洗以去除所有未结合的疏水蛋白。葡萄糖氧化酶的固定化是将这些包被的特氟隆薄片于葡萄糖氧化酶(1mg/ml)的溶液中温育2小时，然后用水冲洗。
固定化葡萄糖氧化酶的存在与活性是通过将经过处理的特氟隆薄片在含有过氧化氢酶(1520单位/mg，SIGMA；浓度0.4mg/ml)和邻联茴香胺(终浓度68μg/ml)的溶液中温育而测试的，其在氧化时在435nm出现吸收峰并显色。添加葡萄糖后，在435nm观测到吸收，其表明过氧化物酶氧化邻联茴香胺。邻联茴香胺的氧化直接与由葡萄糖氧化酶形成的过氧化氢量相关，因而与葡萄糖浓度相关。
或者，将过氧化物酶固定于特氟隆上，而将葡萄糖氧化酶添加到溶液中。溶液在添加了葡萄糖后的显色也证明了固定化的过氧化物酶的活性。
或者，将葡萄糖氧化酶固定于特氟隆薄片，而将过氧化物酶固定于另一个特氟隆薄片。将两片都置于含有邻联茴香胺的容器中，在添加葡萄糖后溶液显色。这证明可以固定化多种可以催化多步反应的酶。将包被的和功能化的特氟隆除去就足以终止反应，说明这些酶并没有从表面上去吸附。功能化的特氟隆薄片在4℃下保存几星期后依然有活性。
4、不同种酶在特氟隆表面的固定化通过SC3疏水蛋白将氧化还原酶(葡萄糖氧化酶，过氧化物酶，漆酶)、水解酶(脂肪酶，酯酶)和蛋白酶(胰蛋白酶)在特氟隆上固定。首先将表面通过浸入到所述蛋白水溶液(0.3mg/ml)中大约30分钟进行包被。随后将获得的修饰表面再次浸入到酶的水溶液中约30分钟。在每步之后，特氟隆表面都要用足够的缓冲液冲洗。在将功能化表面浸入到相应底物的溶液中之后，固定化酶的活性通过分光光度计在412nm和435nm进行测定。这些溶液的光密度值在这些功能化表面浸入后升高，在移出后保持不变。这些实验示出固定化酶并没有变性和从表面上去吸附。功能化特氟隆于4℃储存于含有缓冲溶液的Eppendorf管中。几星期后，不同的表面依然是功能化的。
所采用的酶来自于黑曲霉(Aspergillus niger)的葡萄糖氧化酶(SIGMA；210U/mg固体，终浓度1.0mg/mL)，辣根过氧化物酶(SIGMA；1520U/mg固体，终浓度0.14mg/mL)，来自Trametes sp.的漆酶(Biocatalysts，Wales；终浓度2.1mg/mL)，来自Candidacylindracea的脂肪酶(Biocatalysts，Wales，终浓度0.25mg/mL)，猪肝酯酶(SIGMA；41U/mg固体，终浓度2.4mg/mL)，牛胰胰蛋白酶(SIGMA；8,750U/mg固体)。
底物在pH7葡萄糖用于葡萄糖氧化酶；在milli-Q水中邻联茴香胺用于过氧化物酶和漆酶；在pH7.7对硝基苯辛酸(p-nytrophenyl-caprylate)用于脂肪酶；在pH7.7对硝基苯乙酸用于酯酶以及N-α-苯甲酰基-d，l-精氨酸对硝基酰苯胺盐酸(N-α-benzoyl-d，l-arginine p-nitroanilide hydrochloride)用于胰蛋白酶。
5、抗体和第二种酶的固定化包被有疏水蛋白的特氟隆薄片如上述制备。特氟隆薄片在25℃在100μg/ml的含有等摩尔量的葡萄糖氧化酶抗体和过氧化物酶或仅含有过氧化物酶的溶液中温育2小时。将聚有固定化抗体和/或过氧化物酶的疏水蛋白包被的特氟隆薄片用水认真清洗以去除所有未结合的蛋白。将这些薄片在4℃在不同浓度(很稀)的葡萄糖氧化酶溶液中温育1小时。然后将这些薄片用水清洗以去除没有结合的酶，并将薄片置于含有1ml过氧化物酶活性溶液(4-氨基比林(4-aminophenazone)和酚)的1.5ml比色皿中(与光路平行)。反应从向比色皿中加入葡萄糖储存溶液开始，之后在515nm处显色。
没有葡萄糖氧化酶抗体的特氟隆薄片在与低浓度葡萄糖氧化酶温育后，几乎未示出任何葡萄糖的转化，而具有固定化葡萄糖氧化酶抗体的特氟隆薄片在与同样低浓度葡萄糖氧化酶温育后却示出极高的活性。这个实例说明在疏水蛋白层上的固定化抗体可以用来在传感器表面上从高度稀释的样品中富集某一种酶。
6、抗体的固定化在酶标板的孔中加入疏水蛋白溶液(100μg/ml)温育15分钟后用水充分清洗。然后将含有Oregon green488山羊抗兔抗体(O6381，Molecular Probes)(Ab1)的溶液加入孔中。温育15分钟后将其倒空并用水充分清洗。抗体的固定是根据Oregon green标记抗体供应商提供的方案通过荧光分析并与未包被孔的荧光(吸收/发射最大波长～496/524nm)比较。抗体Ab1固定化的饱和度是由抗体Ab1浓度滴定和荧光强度来研究的。
固定化抗体与包被表面相结合的效果是通过对其它两种抗体来研究的，一种是不与Ab1相互作用的Ab2a，另一种是与Ab1相互作用的Ab2b。为了避免Ab2直接在疏水蛋白包被上固定化，如上述处理孔并使用具有最大量的固定化抗体Ab1的孔。加入含有不同浓度抗体Ab2a和抗体Ab2b的溶液并在温育15分钟后去除，并清洗孔。抗体Ab2a和抗体Ab2b与Ab1相比具有不同的吸收/发射最大波长，从而可以独立于Ab1而通过荧光检测。
或者，如上述将抗绿色荧光蛋白(GFP)的Living ColorsTM抗体固定于疏水蛋白包被的孔中。在孔中加入GFP并温育15分钟。在充分清洗后这些小孔还保持有荧光，说明固定化的(非荧光)抗体保持了其与GFP结合的能力。阴性对照是疏水蛋白包被的孔，用前述Oregon green 488山羊抗兔抗体处理，其不会固定化GFP。
或者，如上述，将抗半乳糖苷酶抗体固定于疏水蛋白包被，并加入β-半乳糖苷酶。在充分清洗之后，酶活性通过加入X-gal来测试。阴性对照是疏水蛋白包被的孔，用前述Oregon green 4山羊抗兔抗体处理，其不会固定化半乳糖苷酶。
疏水蛋白SC3存在的效果通过将孔与疏水蛋白SC3，SDS在80℃与温育1小时后来研究。并进行了上述同样的实验。同样地，通过滴定抗体Ab1和额外的疏水蛋白SC3单体的量研究了加入单体疏水蛋白的阻断效果。根据标准的ELISA方法，进行了同样的实验，说明通过疏水蛋白进行的非共价固定化效果更加敏感和方便。标准的ELISA方法由如下步骤组成固定化100μl抗半乳糖苷酶抗体(10μg/ml的10mM pH7.2磷酸缓冲液)，室温温育3小时。之后倒空酶标板并拍干残留液体。用0.1M含有1M NaCl，0.02％(w)Tween-20的磷酸缓冲液，pH7.2洗5次。加入300μl封闭液(BSA，脱脂牛奶和酪蛋白都经过测试)温育15分钟。倒空孔，拍干，洗3次。封闭之后，将不同浓度的β-半乳糖苷酶混合物加入到不同的孔中。清洗之后，如前述测定孔的β-半乳糖苷酶活性。这个方法可以与在疏水蛋白包被的孔中抗半乳糖苷酶抗体的固定化相比较。β-半乳糖苷酶低浓度敏感性则可以和ELISA方法比较。
7、疏水蛋白的封闭效果本发明还提供了一种物体，其具有可以用来检测特异的分子结合作用的表面，比如在展示技术中或是在ELISA类型分析中检测抗原-抗体相互作用；或是检测核酸-核酸相互作用，如DNA，RNA或PNA。疏水蛋白的两亲性特性使得它可以理想的封闭剂。用疏水蛋白样物质包被疏水表面可以降低该疏水表面的“粘性”，从而减少疏水性化合物与疏水性区域的α-特异性结合。这将改良这种检测方法。本发明提供了一种物体，它至少一部分表面具有活性化合物，其中所述表面还具有疏水蛋白样化合物以降低与所述表面不必要的α-特异性相互作用。在优选的实施方案中，某种固体支持物表面，例如ELISA酶标板，由一种抗体包被，之后该表面进一步用单体疏水蛋白溶液处理，保留了该化合物的反应性基本不变并降低该表面的α-特异性结合性质。我们将标准的ELISA分析稍作修饰，将已知的封闭剂如BSA，脱脂牛奶，酪蛋白和明胶与疏水蛋白的封闭性质进行了比较ELISA酶标板的孔用包被液处理，所述包被液含有pH7.2的10mM磷酸缓冲液和10μg/ml抗半乳糖苷酶抗体，室温温育1小时，然后拍干液体而倒空孔。用含有1M NaCl、pH7.2的0.1M磷酸缓冲液洗5次。通过加入几种浓度的BSA、脱脂牛奶、酪蛋白和单体疏水蛋白，温育15分钟进行封闭，随后拍干液体倒空孔并洗3次。封闭后，将不同浓度和比例的β-半乳糖苷酶和GFP加入不同孔中，浓度范围介于β-半乳糖苷酶∶GFP为1000∶1到GFP∶β-半乳糖苷酶为1000∶1。用含有1M NaCl+0.02％(v/v)Tween-20的0.1M磷酸缓冲液洗5次。清洗之后通过荧光分析测试孔的GFP，表明如前述α特异结合和β-半乳糖苷酶活性以测试感兴趣蛋白的结合。GFP的存在和β-半乳糖苷酶可以用封闭类型比较，说明疏水蛋白的极好封闭能力。
8、通过非共价结合配体进行的靶向通过遗传工程构建，疏水蛋白被认为是多样的，可以形成疏水蛋白和配体的融合蛋白。或者，融合可以在翻译后发生，如通过交联。本实例描述了与疏水蛋白非共价结合的配体，其甚至可以进一步增加疏水蛋白的多能性和易用性。
如Scholtmeijer等(Scholtmeijer，K.，et al.，2002，A ppl.Environ.Microbiol 681367-1373)所述用未修饰的疏水蛋白的修饰方法进行实验，所述疏水蛋白在装配后与含有RGD肽的溶液温育。如述进行成纤维细胞的生长和活性测定和其余样品的测定。重要地，如述用疏水蛋白包被特氟隆薄片并与含有包含RGD(RGD肽)的氨基酸序列的多肽的溶液接触以在包被表面固定化含有RGD的肽。以7500细胞/cm2将成纤维细胞(细胞系L292，来源于小鼠肺泡脂肪组织)接种于24孔板，其中已经放置了包被的或裸露的特氟隆薄片，以及含有添加了10％胎牛血清、1×104u ml-1的青霉素、1×104u ml-1链霉素和谷氨酰胺溶液(1∶100；Gibco BRL USA)的RPMI 1640培养基。在阳性对照中，成纤维细胞在不含有特氟隆薄片的情况下生长。生长情况分别在24、48、72和96小时评价。在显微镜下对在不同表面上观察培养物的铺满来评价生物相容性。结果表明，含有RGD肽的非共价固定化可以用来产生一种修饰的表面，这种改造导致增加的生物相容性。其结果说明非共价相互作用也能用于产生一种修饰的表面。
或者，如Wosten等(Wosten，H.A.B.et al.，1994，EMBO J.135848-5854)所述制备疏水蛋白小泡，使用如Wang等(Wang，X.et al.，2002，Prot.Science.111172-1181)所述用丹酰化标记的trSC3检测荧光。疏水蛋白小泡在含有RGD肽的溶液中温育，洗涤，然后与成纤维细胞温育。在将成纤维细胞从未结合的疏水蛋白小泡中分离后，细胞级分中的小泡可由荧光测定，并与没有结合RGD序列的对照疏水蛋白小泡比较。
9、酯酶、脂肪酶和胰蛋白酶的固定化在3ml玻璃管中，将胶状特氟隆(150nm)和特氟隆薄片，聚乙烯薄片和玻璃薄片(0.8×2.5cm)在25℃于2ml的100μg/ml疏水蛋白溶液中(可以是SC3，trSC3或SC4中的任何一种)温育，时间从10分钟到16小时不等。将这些薄片从疏水蛋白溶液中取出，立即用大量水冲洗以去除任何未结合的疏水蛋白(5×50ml水，5分钟)；这些包被被认为是α-螺旋状态；部分薄片在2％SDS溶液中煮沸10分钟，然后将薄片用水充分清洗；这些包被被认为是β-折叠状态。胶状特氟隆通过温和的离心来收集(2000rpm，2分钟)，将上清液去除，用2ml纯水重悬特氟隆沉淀并再次离心。如此用水将特氟隆沉淀洗5次以去除所有未结合的疏水蛋白。
在3ml玻璃管中，将裸露和疏水蛋白包被的薄片(α-螺旋状态和β-折叠状态)置于2ml的酶溶液中在25℃温育2小时。所用的酶溶液为100μg/ml的60KD酯酶(猪肝)，40KD脂肪酶(小麦胚乳)或25KD胰蛋白酶(牛胰)。随后这些薄片用水彻底清洗以去除所有未结合的酶。
将这些具有和不具有固定化酶的薄片用来进行显色分析。在1.5ml的比色皿中加入1ml 5mM4-硝基苯乙酸溶液(酯酶底物)，5mM的Nα-苯甲酰基-DL精氨酸对硝基苯胺(胰蛋白酶底物)，或在适当缓冲液中标记的5mM的1，2-二-O-癸酰基外消旋甘油-3-戊二酸-试卤灵(1，2-di-O-decanoyl-rac-glycero-3-glutaric acid-resorufin)。将比色皿放入分光光度计中，通过将具有或无固定化酶的疏水蛋白包被薄片放入与光路平行的比色皿时开始反应。随后随时间在适当波长出现光吸收。温育1小时后，将这些薄片从比色皿中取出，比色皿继续反应24小时。薄片用水清洗后转移到另一个含有新鲜底物的新比色皿中再次反应。薄片1天中在新鲜底物中温育3次，在1天后，1周后和1月后通过测定薄片活性和在从混合物中移走薄片后的剩余活性来确定包被的稳定性。结果表明酯酶、脂肪酶和胰蛋白酶都可以以α-螺旋状态和β-折叠状态附着于裸露的薄片和疏水蛋白包被的薄片上。然而，附着于裸露薄片上的酶是没有活性的，但附着于疏水蛋白包被薄片上的酶不但具有活性，而且可以在4℃在缓冲液中或干燥条件下稳定直至1个月。将薄片从底物溶液中取出后，反应完全停止，说明固定化的酯酶、脂肪酶和胰蛋白酶牢固附着于薄片上。采用圆二色谱测定法，包被了疏水蛋白的胶状特氟隆用于葡萄糖氧化酶、酯酶、脂肪酶和胰蛋白酶的结合实验。400ul的100μg/ml的上述酶溶液被加入到1mm比色皿中，在190和250nm记录圆二色谱。向这样的溶液中加入升高浓度的纯胶状特氟隆和疏水蛋白包被的特氟隆并通过记录CD光谱了解变化。通过具有和没有特氟隆的可溶酶的CD光谱的差异判断酯酶、脂肪酶、葡萄糖氧化酶和胰蛋白酶在与裸露的特氟隆结合时都发生了结构变化。当用疏水蛋白包被的特氟隆加入到酶溶液中时，CD信号变化并不明显(在与疏水蛋白信号进行校正以后)。而且通过离心胶状特氟隆部分酶会从溶液中去除，说明这些酶固定在特氟隆球上。更进一步，油滴也可以用疏水蛋白来包被。在3ml水中通过超声乳化100μl油(矿物油或石蜡油)，再加入3ml疏水蛋白(200μg/ml)水溶液来包被油滴。或者可以将油直接在疏水蛋白溶液中乳化再加入3ml。在室温或者在60℃在含有0.02％NaN3时放置过夜后，乳状液在10,000g离心30分钟，并用水通过离心将油滴洗4次以去除可溶性疏水蛋白。然后将装配的疏水蛋白的油滴重悬于小体积水中(总体积200μl)。
20μl疏水蛋白包被的油滴在1ml的100μg/ml酯酶、脂肪酶和胰蛋白酶溶液中在25℃温育2小时。温育后，将这些油滴按前述方法用水离心洗涤5次以去除所有未结合的酶。将与酶结合、洗过的SC3包被的油滴转移到含有1ml上述适合于特氟隆，聚乙烯和玻璃薄片的适当的底物溶液的1.5ml比色皿中。在分光光度反应1小时后，将油滴从比色皿中吸出，剩余溶液继续反应24小时。
结果表明脂肪酶、酯酶和胰蛋白酶都可以被固定于SC3包被的油滴上，即使经受了高强度的清洗，这些酶依然附着在上面。往比色皿中加入这些包被的油滴可以马上启动底物的转化反应，说明这些固定化酶是具有催化活性的。将这些油滴移开，立刻就终止转化反应，说明所有的酶都通过去除油滴而被有效去除。
10、萤火虫萤光素酶的固定化向2块酶标板中加入150μl的100μg/ml疏水蛋白溶液(SC3，TrSC3和SC4中的任意一种)或150μl的水。在25℃温育，时间从10分钟到16小时。将孔用水充分洗以去除任何未结合的疏水蛋白；这些包被认为是α-螺旋状态。向其中一块酶标板中疏水蛋白包被和未包被的孔中加入2％SDS热溶液，并置于60℃20分钟。将SDS处理的孔用水充分洗。这些包被认为是β-折叠状态。往裸露和疏水蛋白包被的孔(α-螺旋和β-折叠)中加入150μl的10-100μg/ml的萤火虫萤光素酶溶液(Roche，Cat No.411523)，并在0℃温育2-16小时。这些孔用0.5M pH7.5的Tris-乙酸缓冲溶液漂洗以去除所有未结合的酶。为了分析固定化酶的活性，向萤火虫萤光素酶包被的空中加入100μl于0.5M pH7.5的Tris-乙酸缓冲溶液(底物，Roche，ATPBioluminescence Assay试剂盒CLS II，1号瓶，Cat.No.1 699 695)。通过向孔中加入50μl系列稀释(3×10-5-3×10-10M)的ATP储存液(Roche，ATPBioluminescence Assay试剂盒CLS II，2号瓶，Cat.No.1699 695)起始反应。根据方法，使用MTP-format发光仪随时间测量记录发光。
温育1小时后，将底物溶液从孔中除去，并用0.5M pH7.5的Tris-乙酸缓冲溶液冲洗孔3次。往孔中加入新鲜的底物和ATP溶液，并测定反应。一天之内将这些孔在新鲜的底物中温育3次，1天后，1周后和1月后通过孔中的反应活性测定来确定包被的稳定性。
结果说明萤火虫萤光素酶可以附着到裸露的和疏水蛋白包被的孔上(α-螺旋状态和β-折叠状态)。然而，附着到裸露孔的酶没有活性，而附着到疏水蛋白包被孔上的酶有活性并可以稳定保持直至1个月。
(注意浓度为1mg/ml的浓缩萤光素酶当以50μl每份冷冻时可以稳定数个月，稀释溶液不稳定，应保存于冰浴。还注意其对振动及于塑料管中保存敏感！)。
11、碱性磷酸酶的固定化向2块酶标板的孔中加入150μl的100μg/ml疏水蛋白溶液(SC3，TrSC3和SC4中的任一种)或150μl的水。在25℃温育，时间从10分钟到16小时。将孔用水充分洗以去除任何未结合的疏水蛋白；这些包被认为是α-螺旋状态。向一块酶标板中疏水蛋白包被的和没包被的孔中加入2％SDS热溶液，并将其置于60℃20分钟。将SDS处理的孔用水充分洗。这些包被认为是β-折叠状态。在提供的稀释缓冲溶液中制备从5到100倍稀释的人胎盘碱性磷酸酶(4u/ml，Roche，SEAPchemiluminescent Reporter gene assay，Cat.No.1 779 842)。往裸露和疏水蛋白包被的孔(α-螺旋状态和β-折叠状态)中加入150μl每种稀释液，并在25℃温育2小时。这些孔用稀释缓冲溶液充分洗以去除所有未结合的酶。
为了分析固定化酶的活性，将50μl底物试剂和100μl稀释缓冲溶液(Roche，SEAP chemiluminescent Reporter gene assay，Cat.No.1 779842)加入到碱性磷酸酶包被的孔中，并在25℃温育10分钟。根据MTP-format发光仪操作手册测量记录发光现象。
温育2小时后，将底物溶液从孔中除去，并用稀释缓冲溶液冲洗孔。往孔中加入新鲜的底物和稀释缓冲溶液，并进行反应。一天内将这些孔在新鲜的底物中温育2次，1天后，1周后和1月后通过测定孔中的活性确定包被的稳定性。
结果说明碱性磷酸酶可以附着到裸露的和疏水蛋白包被的孔上(α-螺旋状态和β-折叠状态)。然而，附着到裸露孔的酶没有活性，而附着到疏水蛋白包被孔上的酶有活性并可以稳定直至1个月。
12、捕光复合物(light harvesting complex，LHC)的固定化用疏水蛋白(SC3，TrSC3和SC4中的任意一种)在100μg/ml疏水蛋白溶液中包被三种不同的电极底物(亲水性的GE和疏水性的GCE或TMFE)并将2种置于水中。在25℃温育，时间从10分钟到16小时。电极用水冲洗以去除任何未结合的疏水蛋白；这些包被称为α-螺旋状态。将每种类型的一个疏水蛋白包被的和一个裸露的电极分别在2％SDS溶液中煮沸10分钟。将SDS处理过的电极用水充分冲洗。这些包被称为β-折叠状态。如Bilewicz等，J.Phys.Chem.B 2001，105，9772-9777)所述将不同类型的包被和裸露电极装入电活性化合物Q10、偶氮苯或Q0，或者介质，如亚甲蓝。将多种包被或裸露的电极，无论是否装入电活性化合物，都在25℃在根据Rhiel等人方法(Rhiel E.et al.，1997，Botanica Acta 110，109-117)分离的Cyclotellacryptica的不同浓度的LHC中温育2小时。用适当的缓冲液冲洗电极。
为了分析固定化LHC的活性，电极(在合适的缓冲液中)被置于黑暗中，随后转移至光线中，进而测量电流。这样的暗-光循环在同一天内重复数次，在1天后，1周后和1月后确定固定化LHC的稳定性。
13、固定化DNA除了蛋白质，还可以固定化其它一些分子。作为例子，描述DNA的固定化。
尽管熟知固定化DNA的方法，但大多数固定化DNA的方法都是基于共价结合，因此需要一个活性基团，通常是DNA分子的5’末端。在疏水蛋白包被固定化DNA同样很牢固，但不需要DNA末端的活性基团，因此具有更通用。同时，相对于线性共价结合的DNA来说，固定化不容易断裂。本实施例描述了DNA的固定化与结合时的可及性(accessibility)。
PCR管(聚丙烯，Sarstedt)用50μl的100μg/ml的SC3疏水蛋白溶液在25℃包被16小时。将SC3疏水蛋白溶液去除，并加入100μl1％SDS，加热至80℃处理10分钟，这样可以得到β-折叠。或者是加入100μl水，在80℃加热10分钟(α-螺旋状态)。这些管用100μl水洗涤5次后加入含有质粒的溶液，温育15分钟后，再用200μl水洗涤10次以洗掉未结合的DNA。具有固定化DNA的管在用特异于固定化DNA的引物的PCR反应中作为反应管。在管中进行标准的PCR(50μl，96℃1分钟，60℃30秒，72℃4分钟，25个循环)，产物通过凝胶分析。没有包被的管里没有PCR产物，说明DNA被冲洗掉了。具有α-螺旋的包被的管里有PCR产物，说明质粒DNA被固定化于疏水蛋白包被。具有β-折叠的包被的管里没有DNA固定化，说明不同包被类型具有不同的特异性。
所得PCR产物不仅证明了疏水蛋白固定化DNA的能力，还证明固定化的DNA依然可以和寡核苷酸和酶类相接触，如聚合酶。
14、CYP2D6和CYP2C19在特氟隆表面的固定化细胞色素P450是含有血红素单加氧酶的一个超家族。在它们的活性中心有一个铁原子，可以氧化形式(Fe3+)和底物相结合。而发生还原反应时则成为Fe2+。用分子氧可以将Fe2+再次氧化为Fe3+，同时释放出新的氧化产物。细胞色素P450的两个实例是CYP2D6和CYP2C19，存在于人肝脏中并参与代谢生物异源物质，如药物。
如上述，通过将特氟隆在具有疏水蛋白(100μg/ml)的溶液中温育，用具有细胞色素的溶液清洗之后再次清洗，就在特氟隆薄片上固定化了细胞色素CYP2D6和CYP2C19。用结合到特氟隆上的CYP2D6和CYP2C19包被的特氟隆薄片在含有NADPH和模型底物右美沙芬(dextromethorphan)和美芬妥英(mephenytoin)的培养基中温育。温育了几个时间阶段之后，底物右美沙芬和美芬妥英及其代谢产物右啡烷(dextrorphan)和4-羟基美芬妥英(4-hydroxymephenytoin)一同被测定。每一种固定化细胞色素的代谢程度可以根据底物和产物的比值来计算出来。
15、CYP2D6和CYP2C19在电极表面的固定化将玻璃碳电极通过浸入含有疏水蛋白(100μg/ml)的溶液中15分钟用疏水蛋白进行包被。随后彻底洗涤电极。通过将电极分别在含有CYP2D6或CYP2C19的溶液中温育15分钟后洗涤，将细胞色素CYP2D6和CYP2C19分别结合到每种疏水蛋白包被的电极上。将修饰过的电极置于含有NADPH和模型底物右美沙芬和美芬妥英的培养基中。测量在温育期间通过与底物右美沙芬和美芬妥英接触而诱导的电势。电势大小反映了同工酶的代谢。温育1小时后，将电极移开并定量底物(右美沙芬和美芬妥英)和产物(右啡烷和4-羟基美芬妥英)。两者的比值就是细胞色素活性的反映，并与所测定的电势相关。
16、BSA、纤连蛋白和RPMI培养基中蛋白质的固定化将BSA(牛血清白蛋白)和纤连蛋白固定在包被的特氟隆薄片上。在3ml玻璃管中，通过将特氟隆在2ml的100μg/ml的疏水蛋白溶液(SC3或是trSC3)中在25℃温育15分钟进行包被。将薄片从疏水蛋白溶液中取出后立即用大量水洗涤以去除任何未结合的疏水蛋白。将包被的和裸露的特氟隆薄片在含有BSA或纤连蛋白的溶液(50μg/ml)中温育14小时后用水洗涤。裸露的和包被的特氟隆上的BSA或纤连蛋白通过用TFA提取所有蛋白质，蒸发TFA及在SDS-PAGE上上样并按照标准程序进行染色来检测。结果说明BSA和纤连蛋白没有被固定化在裸露的特氟隆上，却可以被固定在包被的特氟隆上。而且，在SC3包被的和TrS3包被的特氟隆薄片上存在不同量的BSA或纤连蛋白。另外，还用补充的RPMI培养基(SIGMACat No.R0883)代替BSA或纤连蛋白如上述进行了相似的实验。同样没有在裸露的特氟隆上发现有蛋白质的固定化，而在SC3和TrSC3包被的特氟隆上检测到了蛋白质量的不同。
17、在生物传感器系统中的应用本发明的另一项应用涉及一种提供传感器的方法，所述传感器具有用作生物传感器的良好特征。生物传感器使用生物分子来检测其它的生物分子或化学物质。生物传感器可以例如使用单克隆抗体来检测抗原，或者用小的合成DNA分子去检测DNA。生物传感器是一种装置，它包括了一个与信号转导器非常接近(in close proximity to)或与其集成的生物识别(传感)元件，以产生一种特异于靶化合物(分析物)的一种无试剂传感系统。转导器是传感器的物理性成分，其对生物传感过程的产物产生响应，其可以是光学的，电化学的，热力学的，压电学的或是磁力的，对输出反应的形式可以是被放大的，储存的和显示的。生物识别元件可以是一种生物材料或是仿生学材料(比如，组织，微生物，细胞器，细胞受体，酶，抗体，核酸等)。生物感受元件的优势就在与它们区别感兴趣的分析物和相似物质时的非凡能力。生物传感仅当分析物被生物元件特异性识别时发生。使用生物传感器，可以非常精确地测量特异的分析物。优选生物元件以非共价的方式结合于传感器表面，如同本发明所提供的方法一样，保持这些生物化合物的二级和三级结构完整，进而允许最佳的生物识别。
对一种给定的分析物-识别元件反应来说，可以应用几种转导方式。在电压恒定的条件下采用安培计来检测电流的变化。用电导仪来检测两个电极之间电导率的变化。用电压计来检测电流恒定(通常为零)时的电压变化。根据光学结构，可以将光学转导器主要分为两种模式(非本征(extrinsic)和本征的(intrinsic))。在本征模式中，入射波并不能穿透样本，但却可在倏逝场中延入射波方向进行传播并与样品在表面相互作用。生物识别光学检测的其它表面方法是基于对入射光在不同材料的界面上产生的激发场进行调节。比如，BIAcore系统就是通过表面等离子共振检测仪(surface plasmon resonancedetector)来监测生物特异性相互作用。质量检测器通常是基于石英晶体，其可预知受表面微小变化而影响的频率变化，如抗体与表面固定化抗原的结合。
生物传感器概念的实施在很大程度上依赖于以“非反应物”形式制造组分和进行组装的关键技术。“非反应物”形式，在大多情况下，是通过将生物识别元件固定在传感器表面来完成的。有利地，用允许非共价附着生物识别分子的化合物包被生物感应器表面。比如，将金传感器表面(疏水性的)用疏水蛋白溶液仅仅通过温育一段时间进行包被。然后用水清洗表面以去除任何未结合的疏水蛋白。再用去污剂处理该表面以获得β-折叠状态包被，所述包被的表面可以直接用于结合生物识别分子，如抗体、酶、肽、脂质、核酸或碳水化合物。通常，固定化基质可以仅起到支持物的作用，或其也可以涉及与生物传感元件识别分析物相关的信号介导。
优选固定化基质不会影响生物传感器的敏感性。然而只采用疏水蛋白包被传感器表面会减弱信号传导，我们发现可以向上述疏水蛋白包被中掺入一种化合物来增强传感器的性能。例如本文提供的，这种化合物是可以掺入疏水蛋白包被中以与不含有所述化合物的疏水蛋白包被相比可以改良传感器敏感性的电活性化合物。在优选的实施方案中，本发明提供了一种方法，其提供了具有疏水蛋白样物质的传感器表面，其中所述包被还具有一种活性化合物以改良传感器的灵敏度，也称为信号转导器，以及具有非共价结合的生物识别化合物。
权利要求
1.一种物体，其至少有一部分表面具有疏水蛋白样包被(或膜)，其中所述包被还额外具有一种活性化合物。
2.根据权利要求1所述的物体，其中所述活性化合物分子量(MW)大于1千道尔顿(1Kd)。
3.根据权利要求1或2所述的物体，其中所述包被基本上不含有甘露糖残基。
4.根据权利要求1-3中的任一项所述的物体，其中所述活性化合物含有蛋白质物质。
5.根据权利要求1-4中的任一项所述的物体，其中所述活性化合物包含酶。
6.根据权利要求1-4中的任一项所述的物体，其中所述活性化合物包含抗体或其片段。
7.根据权利要求1-3中的任一项所述的物体，其中所述活性化合物包含核酸。
8.根据权利要求1-7中的任一项所述的物体，其中所述活性化合物被非共价地结合到所述包被上。
9.根据权利要求1-8中的任一项所述的物体，其中所述表面包含液/液界面。
10.根据权利要求1-8中的任一项所述的物体，其中所述表面包含固/液界面。
11.一种向物体表面提供活性化合物的方法，该方法包括如下步骤将物体表面的至少一部分用疏水蛋白样物质涂层进行包被，并将该化合物与包被的疏水蛋白样物质相接触以在所述疏水蛋白样物质和所述化合物之间形成非共价键。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述物质可以在所述物体表面通过所述物质的自装配形成单层。
13.根据权利要求11或12所述的方法，其中在所述包被的物体与所述活性化合物相接触之前，对所述包被的物体进行预处理。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述包被的物体用去污剂溶液进行预处理。
15.根据权利要求11-14任一项所述的方法，包含将所述包被的物体的表面加热到30-80℃的范围。
16.一种向物体表面提供活性化合物的方法，该方法包括如下步骤将物体表面的至少一部分用活性化合物涂层进行包被，并进一步地将该表面与疏水蛋白样物质的溶液相接触以在所述疏水蛋白样物质和所述表面之间形成非共价键，保持所述化合物的反应性基本不变。
全文摘要
本发明涉及将化合物结合到物体表面至少一部分的方法，所述方法包括将疏水蛋白样(hydrophobin－like)物质吸附到所述表面上的步骤。本发明提供了向物体表面提供活性化合物的方法，该方法包括如下步骤至少将物体表面的一部分用疏水蛋白样物质涂层进行包被，并将该化合物与包被的疏水蛋白样物质相接触以在所述疏水蛋白样物质和所述化合物之间形成非共价键。
文档编号G01N33/543GK1675238SQ03819807
公开日2005年9月28日 申请日期2003年6月13日 优先权日2002年6月21日
发明者哈尔姆·扬·赫托克, 里克·林克, 卡琳·朔尔特迈耶, 约翰内斯·韦尔默, 艾娃·玛丽亚·罗加斯卡, 阿兰·乔治·吉兰·瓦尔卡里乌斯 申请人:应用超微系统股份有限公司