专利名称：Il-17结合化合物及其医药用途的制作方法
IL-17结合化合物及其医药用途本发明涉及新的IL-17抑制多肽、相应的融合蛋白、组合物及其医药用途。
背景技术：
CD4+T细胞通过协助适应性或先天性免疫系统的其它细胞而在指导免疫应答中起重要作用。在早先研究中，鉴定了两类⑶4+T细胞(Thl和Th2)。新近鉴定了⑶4+T细胞的新亚组，即Thl7谱系。Thl7细胞似乎进化为适应性免疫系统的分支，专门用于针对Thl或Th2免疫未完全涵盖的胞外细菌以及一些真菌和微生物的增强的宿主保护。Thl7细胞是在发现新的细胞因子家族即IL-17家族(目前已知其包括6个成员(IL-17A-F))的背景下而鉴定的。IL-17(先前称为CTLA-8)主要由Thl7细胞表达并且将其命名为IL-17A以表明它是该细胞因子家族的创建成员。IL-17成员与其它目前已知的哺乳动物蛋白无序列同源性并且因此构成不同的细胞因子家族。从IL-17F晶体结构推导 出的IL-17家族成员的结构特征表明，与许多细胞因子类似，每一家族成员可能作为同二聚体产生，但结构相似性暗示可存在异二聚体。最近鉴定了由活化的人⑶4+T细胞表达的IL-17A和IL-17F的异二聚体，其通过IL-17RA/IL-17RC复合物进行信号转导(Wright J. F等· (2008) J. of Immunol.，181，第 2799-2805 页)。对在慢性炎性过程中作为中心介质(mediator)以及在若干类型的自身免疫病况(先前认为这些是Thl介导的)中作为主要病原性效应物的Thl7细胞的鉴定预示将出现新的治疗方法(Weaver T 等.(2008) Annu. Rev. Immunol.，25，第 821-852 页)。事实上，促炎细胞因子IL-17主要由Thl7细胞表达并且在类风湿性关节炎(RA)患者的滑液中以升高的水平存在，并且已显示参与早期RA的发展。此外，IL-17是TNF-α和IL-I的强有力诱导物，后者主要导致受影响患者的骨侵蚀以及非常疼痛的后果(Lubberts E. (2008)Cytokine,41，第84-91页)。此外，IL-17的不适当或过度产生与以下各种其他疾病和病症的病理相关例如骨关节炎、骨植入物松弛、急性移植排斥(Antonysamy等.,(1999) J. Immunol, 162,第 577-584 页；van Kooten 等· (1998) J. Am. Soc. Nephrol. , 9,第 1526-1534 页)、败血病、胺毒性休克或内毒素性休克、变态反应、哮喘(Molet等.(2001) J. Allergy Clin. Immunol.,108,第 430-438 页)、骨丢失、牛皮癖(Teunissen 等.(1998) J. Invest. Dermatol, 111,第645-649 页)、局部缺血、系统性硬化病(Kurasawa 等.(2000) Arthritis Rheum. ,43,第2455-2463页)、中风和其它炎性病症。因此，抗-IL-17化合物具有作为抗炎剂的潜能，这是与许多体内研究(其证明中和IL-17减轻炎性过程例如关节炎)一致的治疗方法。例如，在关节炎的初期期间在免疫接种方案后启动的IL-17受体-IgGl-Fc融合蛋白对内源性IL-17的早期中和抑制实验性关节炎的发作(Lubberts等·(2001) J. Immunol. , 167,第1004-1013页)。此外，在动物模型中在胶原诱导的关节炎发作后，用中和抗-IL-17抗体的治疗减少关节炎症、软骨破坏和骨侵蚀(Lubberts 等· (2004) Arthritis and Rheumatism, 50 ;650_659)。组织学分析证实用抗-IL-17抗体治疗后关节炎症被抑制，并且系统性IL-6水平显著降低。相比之下，使用表达鼠IL-17的腺病毒载体过表达系统性以及局部的IL-17，加速了胶原诱导的关节炎(CIA)发作并且加剧了位点处的滑液炎症(Lubberts等.(2001) J. Immunol.，167，第1004-1013页以及 Lubberts 等.(2002)，Inf lamm. Res. 51,第 102-104 页)。虽然抗体通常用于分析、纯化、诊断和治疗目的，这是由于它们易于制备、对实际上任何所需靶抗原的高亲和力和特异性，但它们仍有许多严重缺点，例如需要复杂的哺乳动物细胞生产系统、依赖于二硫键稳定性、一些抗体片段易于聚集、溶解度有限以及最后但并非最不重要的，它们(即使人源化时)可引发非合乎需要的免疫应答。结果，最近出现如下集中关注开发小的球状蛋白，将其作为用于产生新类别多用途的结合蛋白的支架。为产生多样性和靶特异性，通常使具有合适生物物理性质的蛋白框架的表面组分(例如胞外环)组合地突变，用于产生蛋白质文库，以筛查目标靶结合特异性(Binz，H. K.，和Pluckthun, A. (2005)Curr. Opin. Biotechnol. 16,459-469)。这些非免疫球蛋白-来源的结合剂统称为“支架(scaffold) ” (Skerra A. (2000)J. Mol. Recognit. 13，167-187)。在过去的10至15年内，已提出多于50种的不同蛋白支架，该领域最先进的方法是(如 Gebauer M和 Skerra A. (2009) Curr Opinion in ChemicalBiology 13 :245-255中总结的)亲合体(affibody)(基于葡萄球菌蛋白A的Z-结构域)、Kunitz型结构域、adnectin(基于人纤连蛋白的第10个结构域)、anticalin(源自 脂质运载蛋白)、DARPin(源自锚蛋白重复序列蛋白)、avimer(基于多聚化的LDLR-A)、affitin(基于来自极端嗜热古细菌的Sac7d)和源自人Fyn SH3结构域的Fynomer。通常，SH3结构域存在于多种参与细胞信号转导的蛋白中(Musacchio等.(1994)Prog. Biophys. Mol. Biol. 61 ;283_297)。这些结构域在蛋白质内不占据固定位置并且可独立地表达和纯化。目前已知存在多于1000种结构域，其中有约300种人SH3结构域(Musacchio A. (2003) Advances in Protein Chemistry. 61 ;211_268)。尽管 SH3 结构域之间存在极大序列多样性，但它们全部共有保守折叠由两个反-平行β-片层形成的紧凑 β 桶(Musacchio A. (2003)Advances in Protein Chemistry. 61 ;211_268)。通常，SH3结构域结合含有PXXP核心-结合基序的富含脯氨酸的肽(Ren等.(1993) Science259 ；1157-1161)，但也已描述了非常规SH3结合位点的实例(Kark_kainen等.(2006) EMBORep. 7 ; 186-191)。迄今为止大多数已测序的SH3结构域的总长为约60至65个氨基酸，但由于连接二级结构的主要保守元件的环中的插入片段，它们中的一些可具有多达85个氨基酸(Koyama等.(1993)Cell 72(6) ;945_952)。不同SH3结构域的比对揭示了负责形成适当结构以及识别规范的富含脯氨酸基序的保守氨基酸残基(Larson等.(2000)ProteinScience 9 ;2170_2180)。最近本发明人证明Fyn SH3结构域是用于产生结合蛋白的特别引人关注的支架(“Fynomer”)，因为它(i)可以可溶形式在细菌中大量表达，(ii)是单体的并且当储存在溶液中时不聚集，(iii)非常稳定(Tm70. 5°C )，(iii)缺少半胱氨酸残基，和(iv)是人源的，其特征为氨基酸序列从小鼠至人完全保守，并且因此是非免疫原性的(Grabulovski等· (2007) JBC, 282，第 3196-3204 页)。本发明的目标是提供新的IL-17A结合分子，特别为对IL-17A具有高特异性以及高亲和力的结合分子。另一目标是提供适合研究、诊断和医学治疗，优选用于治疗和/或预防IL-17A-介导的疾病和医学病症的药物中的用途的IL-17A-结合分子，优选IL-17抑制剂。意想不到的是，上述目标通过包含选自以下的氨基酸序列的多肽而解决
(i) (G/E) VTLFVALYDY- (X) a_D_ (X) b-SFHKGEKF- (X) C_I_ (X) d_G_ (X) e-ffff- (X)f-A- (X) g-SLTTG- (X) hGYIPSNYVAPVDSIQ (I)其中a至h为0至20，优选a为I至10,更优选2至8,最优选6 ;优选b为O至5,更优选I至3,最优选I ;优选c为O至5,更优选I至3,最优选I ;优选d为I至10，更优选3至9，最优选5或7 ;优选e为O至5,更优选I至3,最优选I ;优选f为O至5，更优选I至3，最优选I ; 优选g为O至5,更优选I至3,最优选I ;优选h为O至6，更优选I至3，最优选I或2 ;(ii)与(i)具有至少至少70%、优选至少80 %、更优选至少90 %、最优选至少
95%氨基酸序列同一性的氨基酸序列；(iii)由与编码(i)的核酸的互补链杂交的核酸编码的氨基酸序列，优选在严格条件下杂交；(iv)可通过至少一个氨基酸的取代、添加和/或缺失而得到的⑴至(iii)的片段或功能衍生物，其中所述多肽结合IL-17A。上述通式(I)是人Fyn SH3支架的重复和广泛突变分析以及基于IL-17A结合的选择的结果。标为X的位置可因氨基酸类型以及氨基酸数目而大不相同。优选地，X无一是半胱氨酸。X的优选氨基酸数目由a至h的下标表示，其全部优选为O至20，更优选O或I至10。在天然人Fyn SH3中，(幻3和(X)d将分别与RT环和Src环相关。优选但非必需的是，》\和(X)d提供环结构。已知典型的环结构包括2个至不止20个氨基酸(Larson等· (2000) Protein Science 9 ;2170_2180)。因此，优选(X) a 和 / 或(X) d 具有 2 至 20 个氨基酸。优选a为I至10,更优选2至8,最优选为6。优选d为I至10,更优选3至9,最优选为5或7。优选(X) a为TAFWPG，更优选为VAFWPG，最优选为KAFWPG。优选(X) d为LNSSE，更优选为TRTSD或LHTSD，最优选为LRTSD。(X)b, (X)c, (X)e, (X)f和(X)g彼此独立地优选为O至5，更优选为I至3，最优选为
I。(X)h优选为O至6，更优选I至3，最优选为I。在最优选的实施方案中，式(I)为(G/E) VTLFVALYDY- (X) 6-D_ (X)「SFHKGEKF- (X)「I- (X) 5_7-G_ (X)「ffff- (X)「A- (X)「SLTTG- (X) ^2Gyipsnyvapvdsiq (ia)当然，式⑴的氨基酸序列中存在许多变异，这仍将允许本发明多肽的IL-17A结合。因此，本发明还涵盖包含与(i)具有至少50、60或70%，优选至少80%，更优选至少90%,最优选至少95%的氨基酸序列同一性的氨基酸序列的多肽。本文使用的术语氨基酸序列之间的“氨基酸序列同一性”意指涉及生物化学技术人员通常并且广泛使用的比对和比较技术。两个氨基酸序列的氨基酸序列同一性可通过常用的比对方法和工具来确定。例如为确定任意多肽相对式(I)氨基酸序列的氨基酸序列同一11"生程度，可采用SIM局部相似性程序(Xiaoquin Huang和Webb Miller, " ATime-Efficient, Linear-Space Local Similarity Algorithm. " Advances in AppliedMathematics，第12卷337_357，1991.)，这可从作者及其研究所免费获得(也可参见万维网http://www. expasy. org/_tools/sim-prot. html);就多重比对分析而言，可使用 Clustalff(Thompson 等，CLUSTAL Wimproving the sensitivity of progressivemultiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gappenalties and weight matrix choice. “，Nuclei Acids Res. ,22(22) :4673-4680,1994.)。优选地，本发明多肽、片段或功能衍生物与式(I)氨基酸序列的氨基酸序列同一性程度相对式(I)的完整序列来确定。此外，本发明还涵盖包含由与编码⑴的核酸的互补链(优选在严格条件下)杂交的核酸编码的氨基酸序列的多肽。换言之，由本发明多肽涵盖的氨基酸序列优选由其编码核酸间接限定，该核酸仍必须能与编码式(I)氨基酸序列的核酸的互补链杂交。在本领域中，核酸是否彼此杂交通常通过特定比对和比较工具以及通过实验来确定。在现有技术中，除了用于确定在严格条件下一种核酸与特别参考的核酸序列杂交的能力的常用和/或 标准实验方案(例如 Sambrook 和 Russell, Molecular cloning A laboratory manual (3卷)，2001)之外，优选通过用比对工具，例如BLASTN (Altschul等·，J. Mol. Biol. ,215,403-410,1990)和LALIGN比对工具来比较编码目标多肽的任意核酸与编码式(I)氨基酸序列的核酸序列的互补链，从而分析并确定在严格条件下这两种核苷酸序列杂交的能力。最优选地，编码疑似为本发明多肽的目标多肽的核酸与编码式(I)氨基酸序列的核酸的互补链杂交的能力在以下条件下用DNA印迹测定来证实在45°C下的6x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)，随后在 65°C下于 O. 2x SSC, O. 1% SDS 中洗涤。此外，本发明涵盖包含上述本发明氨基酸序列中任一种的片段、优选功能片段、或功能衍生物的多肽。因此，术语“本发明的多肽或氨基酸序列”还涵盖具有上述鉴定性质(即结合IL-17A)的本发明多肽或氨基酸序列的功能片段和衍生物。本发明多肽或氨基酸序列的功能衍生物意欲涵盖任何氨基酸序列和/或其化学衍生物(非天然氨基酸等同物、糖基化、化学衍生)，其具有基本上足够可及的氨基酸残基或非天然等同物以证明结合IL-17A。本发明多肽或氨基酸序列的功能衍生物中，可缺失、修饰、插入和/或取代一个或多个氨基酸。此外，在"功能衍生物"的背景下，插入是指一个或多个氨基酸插入到上述非衍生化的结合蛋白中。优选(越来越优选)的是，功能衍生物不包括多于5、4、3、2个，或也不包括多于I个氨基酸的改变(即缺失、修饰、插入和/或取代的氨基酸)。在另一实施方案中，优选(越来越优选)的是，多肽或氨基酸序列的全部氨基酸中，不多于
4%、3%、2%或不多于1%被改变(即是缺失、修饰、插入和/或取代的氨基酸)。衍生物中的取代可为保守或非保守取代，但优选保守取代。在一些实施方案中，取代还包括天然存在氨基酸与非天然存在氨基酸的交换。保守取代包括用另一具有与被取代氨基酸相似的化学性质的氨基酸来取代氨基酸。优选地，保守取代是选自以下的取代(i)用不同的碱性氨基酸来取代碱性氨基酸；(ii)用不同的酸性氨基酸来取代酸性氨基酸；(iii)用不同的芳族氨基酸来取代芳族氨基酸；(iv)用不同的非极性、脂族氨基酸来取代非极性、脂族氨基酸；和(V)用不同的极性、不带电氨基酸来取代极性、不带电氨基酸。碱性氨基酸选自精氨酸、组氨酸和赖氨酸。酸性氨基酸选自天冬氨酸或谷氨酸。芳族氨基酸选自苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。非极性、脂族氨基酸选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和异亮氨酸。极性、不带电氨基酸选自丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、脯氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。与保守氨基酸取代相比，非保守氨基酸取代是一个氨基酸与任何氨基酸的交换，其不属于上述α)至(V)的保守取代。若功能衍生物包括缺失，则衍生物中，一个或数个存在于参考多肽中的氨基酸被除去。然而，缺失不应过于广泛而使衍生物包含总数少于3个、优选少于4个、更优选少于5个以及最优选少于6个的氨基酸。如上所述，本发明多肽或氨基酸序列的氨基酸也可被修饰，例如化学修饰。例如，多肽的氨基酸的侧链或自由氨基端或羧基端可被修饰，例如通过糖基化、酰胺化、磷酸化、泛素化等来进行。如本领域熟知的，化学修饰还可发生在体内，例如在宿主细胞中。例如，合适的化学修饰基序，例如存在于多肽的氨基酸序列中的糖基化序列基序将致使多妝被糖基化。在本发明所有提及功能衍生物的实施方案中，须理解的是，具有本文上述限定的式(I)的氨基酸序列是其中引入功能衍生物的起始分子。在插入和具有相同序列的两个起始分子(只是第一分子中Xa等于4，而在第二分子中Xa等于5)的情况下，若到例如Xa的C-末端中的插入在第一分子中是两个氨基酸，而在第二分子中是一个氨基酸，那么将产生具有相同长度以及可能相同氨基酸序列的分子。本发明多肽结合IL-17A，优选人IL-17A。优选地，它们特异性结合IL-17A，即它们·不结合其它细胞因子或者结合程度低得多，优选低至至少2、5、10、50、100、500或1000分之一。用于确定本发明多肽的结合特异性的示例性以及优选的ELISA测定在实施例6和7中提供。在优选的实施方案中，本发明多肽特异性地以高结合亲和力结合人以及食蟹猴(cynomolgus)IL-17A。在另外的优选的实施方案中，本发明多肽具有与人IL-17A的特异性(体内和/或体外)结合亲和力，优选Kd为10_7至10_12M、更优选10_8至10_12M、最优选低于10_12M。例如并且还优选的，本发明多肽的结合亲和力可通过下述实施例2来确定。在最优选的实施方案中，本发明多肽选自附于说明书的SEQ ID NO 1至119或其功能衍生物。在优选的实施方案中，本发明多肽不仅结合而且实际上抑制IL-17A(功能)。该能力在实施例3和10中证明，其中证明了多肽响应加入IL-17A而抑制人皮肤成纤维细胞中IL-6的诱导的能力。此外，本发明多肽在溶液中具有高的稳定性，例如在4°C下它们在单纯磷酸缓冲盐水中在至少6个月内是稳定的(参见实施例4)。然而，稳定性不局限于体外组合物，而是还已在静脉内注射本发明多肽的小鼠中被证明(参见实施例5和12)。总之，本发明多肽非常适合用于研究、诊断和医疗应用。除取代IL-17A抗体之外，它们还得以设计新且较小免疫原性的融合蛋白，用于体内和体外药物和诊断应用。因此，在第二方面，本发明涉及融合蛋白，其包含与药学上和/或诊断上的活性组分融合的本发明多肽。如上所述，本发明的融合蛋白可包含非多肽组分，例如非肽接头、非肽配体，例如用于治疗上或诊断上相关的放射性核素。优选地，所述活性组分是选自以下的细胞因子IL_2、IL-12、TNF-α、IFNa、IFNβ , IFN y , IL-10、IL-15、IL-24、GM-CSF、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6, IL-7、IL-9、IL-IUIL-13、LIF、CD80、B70、TNF β、LT- β、CD-40 配体、Fas-配体、TGF- β、IL-1 α 和 IL-1 β。在另一优选的实施方案中，所述活性组分是毒性化合物，优选小的有机化合物或多肽，更优选选自以下的毒性化合物加利车霉素(calicheamicin)、美登木素生物碱(maytansinoid)、新制癌菌素(neocarzinostatin)、埃斯波霉素(esperamicin)、达内霉素(dynemicin)、可达菌素(kedarcidin)、maduropeptin、多柔I匕星(doxorubicin)、柔红霉素(daunorubicin)、auristatin、蓖麻毒蛋白-A链、蒴莲根毒蛋白II (modeccin)、截短的假单胞菌外毒素A、白喉毒素和重组白树毒蛋白(recombinant gelonin)。在另一优选的实施方案中，本发明的融合蛋白为这样的融合蛋白，其中所述活性组分为优选选自以下的趋化因子IL_8、GROa、GROP、GRO y , ENA-78, LDGF-PBP, GCP-2、PF4、Mig、IP-10、SDF-I a / β、BUNZ0/STRC33、I-TAC, BLC/BCA-1、MIP-I a、MIP-I β、MDC,TECK, TARC, RANTES, HCC-I、HCC-4, DC-CKl、MIP-3 a、MIP-3 β、MCP-1-5、嗜酸性粒细胞趋化因子(Eotaxin)、嗜酸性粒细胞趋化因子_2、1-309、MPIF_l、6Ckine、CTACK, MEC、淋巴细胞趋化蛋白(Lymphotactin)和 CXXXC 趋化因子(Fractalkine)。在又一优选的实施方案中，本发明多肽或融合蛋白含有人工氨基酸。在本发明融合蛋白的另外的优选实施方案中，所述活性组分为荧光染料，优选选自以下的组分Alexa Fluor 或 Cy 染料(Berlier 等，“Quantitative Comparison ofLong-wavelength Alexa Fluor Dyes to Cy Dyes Fluorescence of the Dyes and TheirBioconjugates”，J. Histochem. Cytochem. 51 (12) 1699-1712, 2003.);光敏剂，优选光毒的红色突光蛋白 KillerRed(Bulina 等· (2006)Nat Biotechnol.，24，95-99)或血卩卜啉；前凝血剂因子，优选组织因子；用于前药活化的酶，优选选自羧肽酶、葡糖醛酸糖苷酶和葡糖苷酶的酶；来自以下的放射性核素Y -发射同位素，优选99mTc、123I、mIn，或者正电子发射体，优选 18F、64Cu、68Ga、86Y、124I，或者 β -发射体，优选 131I、90Y、177Lu、67Cu，或 α -发射体，优选213Bi^211At0在另一优选的实施方案中，本发明多肽可直接或通过化学接头连接本文上述限定的一种或多种非-多肽组分。在本发明融合蛋白的更优选实施方案中，所述活性组分为一个或多个功能Fe结构域，优选一个或多个人功能Fe结构域(参见例如SEQ ID NO :117-119和SEQ ID NO :130)，其允许延长本发明IL-17A结合多肽的体内半衰期，并且其中的一些将哺乳动物的免疫应答指向本发明的融合蛋白多肽组分的特异性靶结合位点，例如在治疗、预防和/或诊断应用中。本发明多肽可与一个或多个功能Fe结构域的N-或C-端或者与一个或多个Fe结构域的N-和C-端两者融合。优选本发明融合蛋白包括与一个或多个(优选一个)Fe结构域的至少一侧(优选N-端)融合的本发明多肽的多聚体，优选四聚体、三聚体或最优选二聚体。在这一方面，注意的是，命名为(2C1)2-Fc的Fynomer-Fynomer-Fc融合蛋白证明了多聚体的多肽-Fe融合物的优点，其对IL-17A具有比相应单体2C1-Fc融合蛋白更高的亲和力，如下述实施例2中图3e和3f以及表II证明的。因此，本发明优选的实施方案涉及多聚体的多肽-Fe融合蛋白。
抗体的"功能Fe结构域”是技术人员熟知的术语并且基于抗体的木瓜蛋白酶切割来定义。根据其重链恒定区的氨基酸序列，将免疫球蛋白分为以下类别IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些中的几个可再分为亚类(同种型)，例如IgGl、IgG2、IgG3和IgG4、IgAl和IgA2。依据重链恒定区，将不同类别的免疫球蛋白分别称为[α]、[δ]、[ε]、[y]和[μ ]。抗体的功能Fe结构域直接参与基于补体激活、Clq结合以及Fe受体结合的ADCC (抗体依赖性细胞介导的细胞毒性)和CDC(补体依赖性细胞毒性)。4种人IgG同种型结合不同的受体，例如新生儿Fe受体、激活的Fe Y受体、Fe Y RI、Fe 丫1 11&和卩(^1 111&、抑制性受体Fe Y RIIb，以及具有不同亲和力的Clq，从而产生非常不同的活性。已知激活和抑制人抗体Fe结构域的受体的亲和力可经工程改造和改变(参见Strohl W. (2009) Curr OpinBiotechnol，20，第685-691页)。如上所述，因此本发明包括Fe融合物，其允许延长本发明IL-17A结合多肽的体内半衰期，并且其包含人源的功能Fe结构域，优选人IgGl抗体的功能Fe结构域(参见例如SEQ ID NO :117-119以及SEQ ID NO :130)。在本发明融合蛋白的更优选实施方案中，活性组分是一个或多个具有激活或沉默效应物功能的IgGl工程改造的人功能Fe结构域，优选一个或多个具有沉默效应物功能的 IgGl工程改造的人功能Fe结构域，以及最优选一个或多个具有沉默效应物功能且在L234和L235中突变的IgGl工程改造的人功能Fe结构域(参见例如SEQ ID NO :131-135)，依据 Kabat 的 EU 索引(EU index)来编号(参见 Johnson G 和 Wu T. T. (2000) Nucleic AcidsRes. 28，第 214-218 页)。又一优选的实施方案涉及如上述的本发明多肽或融合蛋白，还包含调节血清半衰期的组分，优选选自聚乙二醇(PEG)、免疫球蛋白和白蛋白-结合肽的组分。此外，优选本发明的融合蛋白包含上述本发明IL-17A结合多肽的任一种，优选选自SEQ ID NO :117至119以及SEQ ID NO =130-135或其功能衍生物的那些。注意的是，本发明的多肽或融合蛋白优选本发明多肽的单体但还涵盖多聚体，优选四聚体、更优选三聚体或最优选二聚体。本发明的多肽和融合蛋白可通过许多常规且熟知的技术中的任一种来制备，例如普通的有机合成策略、固相辅助合成技术或通过市售的自动合成仪。在另一方面，它们还可通过单独的常规重组技术或与常规合成技术组合的常规重组技术来制备。在这一方面，本发明的其它方面涉及(i)编码本发明多肽或融合蛋白的核酸，
(ii)包含所述核酸的载体，和(iii)包含所述多核苷酸和/或所述载体的宿主细胞。优选地，本发明涉及分离并纯化的核酸，其包括(i)编码本发明多肽，优选编码式(I)的氨基酸序列，更优选编码(G/E)VTLFVALYDY- (X) 6-D- (X) -SFHKGEKF- (X)「I- (X) 5_7-G- (X) rffff- (X) -A- (X) -SLTTG- (X) ^-GYIPSNYVAPVDSIQ的核酸；(ii)与⑴的核酸序列具有至少60或70%、优选至少80%、更优选至少90%、最优选至少95%序列同一性的序列的核酸；(iii)与(i)或(ii)的核酸互补链杂交的核酸；(iv)核酸，其中所述核酸可通过(i)、(ii)或(iii)的核酸之一的取代、添加和/或缺失而得到；(V)与编码本发明多肽的(i)的核酸的互补链杂交的(i)至(iv)的核酸中任一种的片段。更优选地，本发明的核酸包括编码如上所述的多肽或融合蛋白的核酸。在这一方面，理解的是，上述核酸⑴至(V)中任一种优选编码结合IL-17A并更优选抑制IL-17A功能的多肽。本发明的核酸可为DNA、RNA、PNA及其任何其它类似物。载体和宿主细胞可为适合目的的任何常规类型，例如本发明多肽和/或融合蛋白的制备，治疗上有用的载体和宿主细胞，例如用于基因治疗。技术人员将能从大量的现有技术中选择那些核酸、载体和宿主细胞，并且通过常规方法以及无需过度负担来确定它们针对所需目的的具体适合性。优选地,核酸有效连接(operably linked)至启动子,优选连接至选自以下原核启动子的启动子T5启动子/Iac操纵基因元件、T7启动子/Iac操纵基因元件，或选自以下真核启动子的启动子hEFl-HTLV、CMV enh/hFerL启动子。 还优选的是，本发明的重组载体是包含本发明核酸并且优选能产生本发明多肽或融合蛋白的载体。优选这样的载体选自PQE载体、pET载体、pFUSE载体、pUC载体、YAC载体、噬菌粒载体、噬菌体载体、用于基因治疗的载体例如逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒。此外，本发明涉及包含本发明核酸和/或载体的宿主细胞。此外，本发明涵盖特异性结合本发明多肽或融合蛋白的抗体。若抗体结合融合蛋白，则它特异性结合其由本发明多肽或融合表位组成的一部分，即部分地由本发明多肽组成和部分地由药学上和/或诊断上的活性组分组成的抗体的结合位点，其优选为多肽或肽。抗体可为多克隆或单克隆抗体。本文使用的术语“抗体”不仅指完整的抗体分子，还指抗原-结合片段，例如Fab、F(ab’)2、Fv和单链Fv片段。还包括嵌合抗体,优选人源化抗体。此类抗体作为用于区分任意蛋白和本发明多肽的研究工具是有用的。另一方面涉及表达本发明的单克隆抗体的杂交瘤细胞系。因为本发明的多肽和融合蛋白证明了 IL-17A-结合和抑制性质以及储存和体内稳定性，所以本发明的另一方面涉及包含本发明的多肽或融合蛋白、核酸和/或重组载体以及任选的药学上可接受的载体的药物组合物。术语药物组合物还意欲涵盖用于体内使用的诊断组合物。本发明的药物组合物可用任何常规方法制备。在实现治疗患有下文指出的疾病的受试者中，本发明的至少一种化合物可用任何形式或方式给予，其使治疗性多肽或其治疗性片段以有效量而生物可利用的，包括口服或胃肠外途径。例如，本发明的组合物可经皮下、肌内、静脉内、通过吸入等给予。制备制剂领域的本领域技术人员可容易地依据所选产品的具体性质、待治疗的疾病或病症、疾病或病症的阶段以及其它相关情况选择适当的给予形式和方式(参见例如 Remington' s Pharmaceutical Sciences, Mack PublishingCo. (1990))。合适的载体或赋形剂可为可作为活性成分的溶媒或介质的液体物质。合适的载体或赋形剂为本领域熟知并且包括，例如稳定剂、抗氧化剂、PH-调节物质、控释赋形剂等。本发明的组合物优选以冻干形式提供。就即刻给予而言，将其溶于合适的水性载体例如注射用无菌水或无菌的缓冲生理盐水。若希望产生更大体积用于经输注而非推注给予，则有利的是，在最后制备时将人血清白蛋白或患者自身的肝素化血液掺入溶剂中。或者，制剂可经皮下给予。存在过量的生理上惰性蛋白例如人血清白蛋白，可防止由吸收至用于输注溶液的容器和输液管的壁上而导致的药学上有效多肽的损失。若使用白蛋白，合适的浓度为盐水溶液的O. 5至4. 5%重量。本发明的IL-17A-结合和抑制多肽特别可用于治疗和/或预防IL-17A-和/或Thl7相关疾病或医学病症。因此，本发明的又一方面涉及本发明的多肽或融合蛋白、核酸和/或重组载体用于医药用途的用途，即用于制备药物的用途，所述药物优选用于治疗和/或预防疾病或医学病症，优选选自IL-17A和/或Thl7相关疾病或医学病症。在优选的实施方案中，本发明的医药用途涉及治疗和/或预防选自以下的疾病或医学病症炎性、自身免疫和/或骨丢失相关疾病和病症。在最优选的实施方案中，所述炎性、自身免疫和/或骨丢失相关疾病和病症选自关节炎、优选类风湿性关节炎、慢性进行性关节炎(arthritis chronica progrediente)、反应性关节炎、牛皮癣关节炎、肠病性关节炎(enterophathic arthritis)和变形性关节 炎、风湿性疾病、脊椎关节病、强直性脊椎炎、莱特尔综合征(Reiter syndrome)、超敏反应(包括呼吸道超敏反应和皮肤超敏反应)、变态反应、系统性红斑狼疮、炎性肌肉病症、多软骨炎、硬皮病(sclerodoma)、韦格纳肉芽肿病(Wegner granulomatosis)、皮肌炎、史-约综合征(Steven-Johnson syndrome)、慢性活动性肝炎、重症肌无力、牛皮癣、特发性口炎性腹湾、自身免疫炎性肠病、溃瘍性结肠炎、克罗恩病(Crohn' s disease)、肠易激综合征、内分泌性眼病、格雷夫斯病(Graves disease)、结节病、局部缺血、系统性硬化病、多发性硬化、原发性胆汁性肝硬化、青少年糖尿病(I型糖尿病)、自身免疫血液病症、溶血性贫血、再生障碍性贫血、单纯红细胞性贫血、特发性血小板减少症、色素层炎(前眼色素层炎和后色素层炎)、干性角膜结膜炎、春季角膜结膜炎、间质性肺纤维化、肾小球性肾炎(具有和不具有肾病综合征)、特发性肾病综合征或微小病变肾病、肿瘤、皮肤炎症的炎性疾病、角膜炎症、肌炎、骨植入物松弛(loosening of bone implants)、急性移植物排斥、代谢紊乱、动脉粥样硬化、糖尿病，和血脂障碍(dislipidemia)、骨丢失、骨关节炎、骨质疏松症、呼吸道阻塞疾病或呼吸道炎性疾病的牙周疾病、哮喘、支气管炎、尘肺病、肺气肿、急性及超急性炎性反应、涉及IL-17A-介导的TNF-α的疾病、急性感染、败血症、感染性休克、内毒素性休克、成年呼吸窘迫综合征、脑膜炎、肺炎、严重烧伤、恶病质、衰竭综合征、中风、疱疹性基质性角膜炎(herpetic stromal keratitis)以及干眼疾病。上述说明的全部疾病和医学病症具有的共同点是它们的起因和/或症状均为IL-17A-和/或Th-17相关的。用于治疗和/或预防疾病或医学病症，优选选自IL-17A-和/或Thl7_相关的疾病或医学病症，更优选上文列举的疾病或医学病症的本发明化合物，即多肽、融合蛋白、核酸、载体和宿主细胞的给予量和方式当然将因下列因素而不同本发明特定的多肽或融合蛋白抑制剂、单个患者组或患者、另外的医学上有效化合物的存在情况以及接受治疗的病症的性质和严重程度。然而，目前优选的是，应给予预防性和/或治疗性使用剂量为约O. Olmg至约20mg/千克体重、优选约O. Img至约5mg/千克体重。优选地，预防性和/或治疗性使用的给予频率在以下范围内约每周两次至约每3月一次、优选约每2周一次至约每10周一次、更优选每4至8周一次。本发明的IL-17A-结合多肽和融合蛋白合宜地并优选地经胃肠外、静脉内(优选给予到肘前或其它外周静脉中)、肌内或皮下给予。IL-17A-结合多肽还可作为滴眼剂局部递送。优选的对患者的预防性和/或治疗性治疗涉及每月一次至每2至3月一次或频率更低地给予本发明多肽。因此，本发明还涉及治疗方法，其中将药理学上有效量的上述药物组合物给予有需要的患者，优选患有IL-17A-和/或Thl7-相关疾病或医学病症，更优选患有上文说明的疾病或医学病症之一的患者。本文使用的术语“治疗”涉及疾病或医学病症的预防性和/或治疗性治疗。本发明的IL-17A-结合多肽和融合蛋白可作为单独有效成分给予，或与其它药物(例如免疫抑制剂或免疫调节剂或其它抗炎剂)联合给予，例如作为其它药物的佐剂或与其它药物组合，例如用于治疗或预防上述疾病。例如，本发明的IL-17A-结合多肽和融合蛋白可与以下组合使用免疫抑制单克隆抗体，例如对白细胞受体(例如MHC、CD2、CD3、CD4、CD7、CD8、CD25、CD28、CD40、CD45、CD58、CD80、CD86 或其配体)具有亲和力的单克隆抗体；其它免疫调节化合物，例如具有CTLA4或其突变体至少一部分胞外域(例如与非-CTLA4蛋白序列连接的CTLA4或其突变体的至少胞外部分(例如CTLA4Ig (例如命名为ATCC 68629)或其突变体，例如LEA29Y))的重组结合分子；粘着分子抑制剂，例如LFA-I拮抗物、ICAM-I或-3拮抗物、VCAM-4拮抗物或VLA-4拮抗物。此外，本发明的多肽和融合蛋白可与以下组合使用DMARD,例如金盐(Gold salts)、柳氮磺卩比唳(sul phasalazine)、抗痕药(antimalarias)、甲氨喋呤(methotrexate)、D-青霉胺(D-penicillamine)、硫唑嘌呤(azathioprine)、麦考酌·酸(mycophenolic acid)、环抱霉素 A、他克莫司(tacrolimus)、西罗莫司(sirolimus)、二甲胺四环素(minocycline)、来氟米特(lefIunomide)、糖皮质激素；钙依赖磷酸酶抑制剂，例如环孢菌素A或FK 506 ;淋巴细胞再循环的调节剂，例如FTY720和FTY720类似物；mT0R抑制剂，例如雷帕霉素(rapamycin) ,40-0- (2-羟乙基)-雷帕霉素、CCI779、ABT578、AP23573或TAFA-93 ;具有免疫抑制性质的子囊霉素(ascomycin)，例如ABT-281、ASM981等；皮质类固醇；环磷酰胺；硫唑嘌呤(azathioprene);甲氨喋呤；来氟米特；咪唑立宾(mizoribine)、麦考酹酸；麦考酹酸吗乙酯(mycophenolate mofetil)；15-脱氧精胍菌素(15-deoxyspergualine)或其免疫抑制同源物、类似物或衍生物；或化疗齐U，例如紫杉醇、吉西他滨(gemcitabine)、顺钼(cisplatinum)、多柔比星(doxorubicin)或5-氟尿卩密唳；抗-TNF剂,例如针对TNF的单克隆抗体,例如英夫利昔单抗(infliximab)、阿达木单抗(adal imumab)、CDP870，或TNF-RI或TNF-RII的受体构建体，例如依那西普(Etanerc印t)、PEG-TNF-RI ;促炎细胞因子的阻断剂，IL-1阻断剂，例如阿那白滞素(Anakinra)或IL-1阱(trap)、AAL160、ACZ 885、IL-6阻断剂；蛋白酶的抑制剂或激活剂，例如金属蛋白酶、抗-IL-15抗体、抗-IL-6抗体、抗-IL-23抗体、抗-IL-22抗体、抗-IL-21抗体、抗-IL-12抗体、抗-IFN- Y抗体、抗-IFN- α抗体、抗-⑶20抗体，NSAID，例如阿斯匹林或抗感染剂。当然，所列举的用于同时给予的药剂是非限制性且不完整的。通过下列实施例中的说明进一步描述本发明，无一实施例将被理解为限制如所附权利要求书概述的本发明范围。附I显示本发明IL-17-结合多肽的实施方案的SDS PAGE分析(a)Bl_2 (SEQ IDNo :39)(第 I 道)、E4(SEQ ID NO :57)(第 2 道)、2C1 (SEQ ID NO :107)(第 3 道)、E4_Fc (SEQID NO :117)(第4道非还原条件，第5道还原条件)、2Cl-Fc(SEQ ID NO :118)(第6道:非还原条件，第7道还原条件)的SDS PAGE ； (b) [(2C1)2-Fc] (SEQ ID NO :119)(第I道:非还原条件，第2道还原条件)的SDSPAGE。根据参考分子量全范围蛋白标记物(marker)来估计(2C1) 2-Fc的分子量(未显示)。
图2显示本发明IL-17A-结合多肽的尺寸排阻色谱图(SEC) (a)克隆B1_2(SEQID NO :39)、(b)E4(SEQ ID NO :57)、(c)2Cl (SEQ ID NO :107)、(d)E4_Fc(SEQ ID NO:117)、(e) SEC-峰纯化的E4-Fc (在纯化后的40天后进行分析并且在4°C于PBS中储存)、(f)2C1-Fc(SEQ ID NO :118)、(g)(2C1)2_Fc(SEQ ID NO :119)。图3描述本发明IL-17A-结合多肽的BIAcore传感图(a)克隆B1_2(SEQ IDNO :39)、(b) E4 (SEQ ID NO :57)、(c)2Cl(SEQ ID NO :107)、(d)E4_Fc(SEQ ID NO :117)、(e)2Cl-Fc(SEQ ID NO :118)、f) (2C1)2-Fc (SEQ ID NO :119)。图4描述IL-17A抑制细胞测定的结果(a)在用IL-17A孵育NHDF细胞后IL_6的剂量依赖性诱导。(b)Fyn SH3来源的IL-17结合剂和IL-17A受体-Fe嵌合体剂量依赖性抑制NHDF细胞中IL-17A-诱导的IL-6产生。(c)与b)相同，Fyn SH3野生型蛋白用作无IL-17A结合亲和力的对照蛋白。(d)XTT-测定存活的细胞能将四唑盐XTT代谢生成有色产物。在我们的实验中，在用IL-17A、IL-17A和Fyn SH3结合剂、或IL-17A以及IL_17R_Fc 嵌合体孵育24小时后所有细胞是存活的。图5描述用命名为G3(SEQ ID NO :34)的本发明IL-17A-结合多肽在纯化后一天(在4°C储存于PBS中)进行的尺寸排阻色谱。采用Superdex 75 (GE Healthcare)柱进行色谱。图6描述用命名为G3 (SEQ ID NO 34)并储存在4°C (a)和_20°C (b)多于6个月的本发明IL-17A-结合多肽进行的尺寸排阻色谱。图7显示小鼠中命名为E4-Fc(SEQ ID NO :117)的本发明IL-17A-结合多肽的药代动力学数据(a)绘制血清中E4-Fc浓度对比静脉内注射后时间的图像，(b)与(a)相同，但用半对数显示。最后4个时间点用于计算最终半衰期(50. 6小时)。图8显示命名为2C1 (SEQ ID NO :107)的本发明多肽的结合特异性的表。吸光度结果涉及使用不同靶蛋白进行的ELISA 人IL-17A、人IL-17F、mIL_17A(鼠IL-17A)、TNF-α (人肿瘤坏死因子a)、BSA(牛血清白蛋白)、卵白蛋白(母鸡蛋清)、IL_6 (人白细胞介素6)。图9显示本发明2C1 (SEQ ID NO :107)的Fyn SH3-来源的多肽的特异性。在ELISA中使用不同IL-17家族成员、不同物种的IL-17A以及其它不相关的抗原，并将本发明2C1 (SEQ ID NO :107)的FynSH3_来源的多肽作为结合剂。本发明2C1(SEQ ID NO :107)的FynSH3-来源的多肽仅结合人和食蟹猴IL-17A。未能检测到与任何其它抗原的结合。在图右边(虚线右边)，显示对人IL-17C的ELISA信号，其通过在另一天用人IL-17A对照而测定。图例hIL-17A :人白细胞介素17A，hIL-17B :人白细胞介素17B，hIL_17D :人白细胞介素17D，hIL-17E :人白细胞介素17E，hIL-17F :人白细胞介素17F，小鼠IL-17A :小鼠白细胞介素17A，大鼠IL-17A :大鼠白细胞介素17A，犬IL-17A :犬白细胞介素17A，cyno I1-17A 食蟹猴白细胞介素17A，EDB :纤连蛋白的外结构域B，hIL-6 :人白细胞介素6，hTNF a :人肿瘤坏死因子a，卵白蛋白来自鸡蛋清的白蛋白，BSA:牛血清白蛋白阴性对照没有抗原用于包被，hIL-17C :人白细胞介素17C。
图10描述在用食蟹猴IL_17A(由包涵体再折叠的)包被的芯片上的本发明2C1 (SEQ ID NO :107)的 Fyn SH3-来源的多肽的 Biacore 传感图。图11显示Fe融合蛋白的SDS PAGE分析。第I道完整范围的彩色蛋白标记物(GE Healthcare)，第2道2C1-Fc (SEQ ID NO :130)，第3道完整范围的彩色蛋白标记物(GE Healthcare)，第 4 道2Cl-m5-Fc (LALA) (SEQ ID NO : 133)，第 5 道2Cl-mlO_Fc (LALA)(SEQ ID NO :134)，第 6道2Cl-ml5-Fc (LALA) (SEQ ID NO :135)，第 7道2Cl-m5E-Fc (LALA)(SEQ ID NO :132)，第 8 道2Cl-Fc(LALA)(SEQ ID NO :131)。图12显示与4°C下在PBS中储存的标准对照2Cl_Fc(SEQ ID NO :130) (x)相比，在37°C下人血清中储存5天后结合IL-17A的2Cl_Fc(SEQ ID NO :130) ( ·)的ELISA0图13显示在单次静脉内注射到小鼠中后，2C1-Fc (LALA) (SEQ ID NO :131)在不同时间点的血清浓度。将哺乳动物细胞中产生的2C1-Fc (LALA)融合蛋白(SEQ ID NO :131)经静脉内(iv)(n = 5)注射(40yg/动物)到小鼠中。PK图的最后4个时间点用于计算2C1-Fc融合蛋白的最终半衰期(53小时)。图14显示急性炎症模型中本发明抗-IL-17Fyn SH3-来源的多肽2C1 (SEQ ID NO:107)抑制人IL-17A诱导的KC产生。经皮下注射3 μ g人IL-17A(IL-17)、PBS (PBS)、3 μ g 人 IL-17A 与 17μ g 本发明单体 Fyn SH3-来源的多肽 2C1 (SEQ ID NO : 107) (IL-17+2C1)、3 μ g人IL-17A与16 μ g野生型Fyn SH3单体(IL-17+野生型)、仅17 μ g本发明单体FynSH3-来源的多肽2C1(SEQ ID NO :107) (2C1)或仅16 μ g野生型Fyn SH3单体(野生型)的2小时后，取血液样品并定量小鼠-血清中的KC水平。显示4只小鼠/组的平均KC水平(土SD)，只有野生型对照组(不含或含IL-17A的Fyn SH3)除外，其中显示3只小鼠的平均水平(土 SD)。图15描述急性炎症模型中2C1-Fc融合蛋白(SEQ ID NO :130)抑制人IL-17A诱导的KC产生。静脉内注射2Cl-Fc/IL-17:44yg的2Cl-Fc(SEQ ID NO : 130)，随后皮下注射3yg人IL-17A。在给予IL-17A 2小时后，从小鼠中取血液样品并且通过ELISA测量KC血清水平。如下进行对照实验PBS/IL-17 :静脉内注射PBS，随后皮下注射IL-17 ；2C1-Fc/PBS :静脉内注射2Cl-Fc(SEQ ID NO :130)，随后皮下注射BPS ；PBS/PBS :静脉内注射PBS，随后皮下注射PBS ;显示3-5只小鼠/组的平均KC水平(土SD)。
实施例实施例I :如通过单克降噬菌体ELISA测定的，本发明Fyn SH3-来源的多肽结合IL-17A。方法将编码SEQ ID NO :1至116中所示氨基酸序列的DNA克隆到噬菌粒载体pHENl中，如 Grabulovski 等(Grabulovski 等· (2007) JBC, 282,第 3196-3204 页)中对 FYN SH3 文库所述。按照标准实验方案进行曬菌体的制备(Viti,F等·(2000)Methods Enzymol. 326,480-505)。含噬菌体的单克隆细菌上清液用于ELISA:将生物素化的IL-17A(购自R&DSystems,依据制造商的说明用NHS-PE04-生物素(Pierce)进行生物素化)固定在链霉抗生物素-包被的孔(Streptaffells, High Bind, Roche)上，在用 PBS、2%牛奶(Rapilait,Migros, Switzerland)封闭后，施用20 μ I的PBS、10%牛奶和80 μ I的噬菌体上清液。在孵育Ih并洗涤后，用抗-M13-HRP抗体缀合物(GE Healthcare)检测结合的噬菌体。通过加入BM蓝色POD底物(Roche)来进行过氧化物酶活性的检测，并且通过加入IM H2SO4终止反应。通过DNA测序来验证结合剂的DNA序列(BigDye Terminator v3. I循环测序试剂盒，ABI PRISM3130 Genetic Analyzer, Applied Biosystems)。结果Fyn SH3-来源的IL-17A结合剂的氨基酸序列示于如序列表中所附的SEQ ID NO:I至116中。 实施例2 :本发明的Fyn SH3-来源的多肽高亲和力地结合人重组IL-17A。该实施例显示不同形式的Fyn SH3-来源的IL-17A-结合多肽的克隆及表达，以及通过尺寸排阻色谱和表面等离振子共振实验来表征这些多肽。a) Fyn SH3-来源的IL-17A-结合多肽的克隆及表达将选择的Fyn SH3-来源的IL-17A-结合多肽(克隆Bl_2 SEQ ID NO :39，克隆E4 SEQ ID勵57和克隆2(1 SEQ ID NO :107)克隆到胞质表达载体pQE_12中并且表达以及纯化，如 Grabulovski 等(Grabulovski 等.(2007) JBC, 282,第 3196-3204 页)描述的。b)克隆并表达与人IgGl抗体的Fe部分融合的Fyn SH3-来源的IL-17A-结合多肽对克隆E4和2C1(SEQ ID NO :57和SEQ ID NO : 107)进行克隆并且表达为含人IgGl抗体的Fe部分的融合蛋白(参见下文的程序；SEQ ID NO :117和118)。此外，克隆具有10个氨基酸的接头的2C1 二聚体[(2C1)2-Fc]并表达为Fe融合蛋白(SEQ ID NO :119)。使用引物fm5(5，ATCGGGA-TCCGACAAAACTCACACATGCC3，，SEQ ID NO :121)和 fm6(5’ TACGAAGCT-TTCATTTACCCGGAGACAGGG 3’，SEQ ID NO :122)并且将市售pFUSE-hIgGl-Fc2 (Invivogen)真核载体用作模板，PCR扩增人IgGl的Fe部分。用BamHI/HindHI消化所得PCR产物，并且与先前用相同酶消化的pASK_IBA2载体(IBA-Biotagnology)连接，从而产生新的载体pAF。用fm7(5，ATATCACCATGGGGCCGGAGTGACACTCTTT-GTGGCCCTTTATG 3，，SEQ ID NO:123)和 fm8(5’ CGTAGGA-TCCCTGGATAG-AGTCAACTGGAGC 3’，SEQ ID NO : 124)，PCR 扩增克隆E4和2C1(SEQ ID NO :57和SEQ ID NO :107)的遗传信息。为制备与Fe融合的2C1 二聚体，将2C1DNA模板用于两次独立的PCR。在第一反应中，使用引物47b. fo (5’AGA GCC ACCTCC GCCTGA ACC GCC TCC ACC CTG GAT AGA GTC AAC TGG AGC CAC3，，SEQ ID NO :125)和52. ba(5’ GAC TAA CGA GAT CGC GGA TCCGGA GTG ACA CTC TTT GTG GCC CTT TAT 3’，SEQID NO :126)，并且在第二 PCR 中，使用引物 48b. ba (5，GGT GGA GGC GGT TCAGGC GGA GGTGGC TCT GGA GTG ACA CTC TTT GTG GCC CTTTAT 3，，SEQ ID NO : 127)和51. fo(5，ATC CCAAGC TTA GTG ATGGTG ATG GTG ATG CAG ATC CTC TTC TGA GAT GAG TTT TTGTTC ACC CTGGAT AGA GTC AAC TGG AGC CAC 3’，SEQ ID NO :128)。用PCR将两个DNA片段组合，在两结构域之间产生具有10个氨基酸接头(GGGGSGGGGS，SEQ ID NO :120)的2C1同二聚体。如针对2C1单体所描述的使用引物fm7和fm8进一步扩增所得DNA片段。随后用NcoI/BamHI消化所得PCR产物并且将其克隆到双重消化的周质表达载体PAF中。将质粒电穿孔到大肠杆菌TGl中并且用O. 2 μ g/ml无水四环素诱导蛋白质表达。将细菌培养物在25°C下于旋转摇床中培养过夜，并且在单个蛋白A-亲和色谱步骤中从周质级分纯化Fynomer-Fc融合蛋白。用20 μ I的蛋白质溶液进行SDSPAGE(Invitrogen)分析。c)尺寸排阻色谱(SEC)
使用Superdex 75 柱(10/300)或 Superdex 75Short Column(5/150)(GEHealthcare)在AJCTA FPLC系统上进行尺寸排阻色谱(SEC)。d)亲和力测量使用BIAcore 3000仪器(Biacore)进行亲和力测量。为分析生物素化IL-17A与单体的Fyn SH3-来源的IL-17A-结合多肽之间，以及生物素化IL-17A与E4-Fc(SEQ ID NO:117)之间的相互作用，使用链霉抗生物素SA芯片(Biacore)并分别固定化1300和510RU生物素化IL-17A。运行缓冲液为PBS,O. I % NaN3和表面活性剂P20 (Biacore)。以20 μ I/min的流速并且注射不同浓度Fyn SH3-来源的IL-17A-结合多肽来测量相互作用。为分析IL-17A与2C1-Fc融合物以及(2C1)2_Fc融合物之间的相互作用，将CM5芯片(Biacore)用2900RU山羊抗-人IgG Fe-特异性抗体(Jackson Immunoresearch)包被。运行缓冲液为HBS-EP (Biacore)。通过以10 μ Ι/min的流速注射约250至275RU Fe融合蛋白，随后通过以30μ Ι/min的的流速注射不同浓度的IL_17A(R&D Systems)来测量相互作用。使用BIA评估3. 2RC1软件评估相互作用的所有动力学数据(各自的kon/koff)。e)结果在未优化条件下在摇瓶中，本发明单体的Fyn SH3-来源的IL-17A-结合多肽的表达产率范围为60至85mg/升细菌培养物。Fe-融合蛋白的表达产率为O. 2至O. 4mg/升(表I)。Fe-融合蛋白具有所附SEQ ID NO :117至119中列举的序列。表I.在未优化条件下在摇瓶中，大肠杆菌中的细菌培养物在纯化后的表达产率
权利要求
1.一种包含选自以下的氨基酸序列的多肽 (i)(G/E) VTLFVALYDY- (X) a_D_ (X) b_SFHKGEKF_ (X) C_I_ (X) d_G_ (X) e-ffff- (X) f_A_ (X)g-SLTTG- (X) hGYIPSNYVAPVDSIQ (I) 其中a至h为O至20， 优选a为I至10、更优选2至8、最优选6 ； 优选b为O至5、更优选I至3、最优选I ; 优选c为O至5、更优选I至3、最优选I ; 优选d为I至10、更优选3至9、最优选5或7 ; 优选e为O至5、更优选I至3、最优选I ; 优选f为O至5、更优选I至3、最优选I ; 优选g为O至5、更优选I至3、最优选I ; 优选h为O至6、更优选I至3、最优选I或2 ; (ii)与⑴具有至少70%、优选至少80%、更优选至少90%、最优选至少95%氨基酸序列同一性的氨基酸序列； (iii)由与编码(i)的核酸的互补链杂交的核酸编码的氨基酸序列，优选在严格条件下杂交； (iv)可通过至少一个氨基酸的取代、添加和/或缺失而得到的(i)至(iii)的片段或功能衍生物， 其中所述多肽结合IL-17A。
2.权利要求I的多肽，所述多肽具有与人IL-17A的特异性结合亲和力，优选Kd为10_7至10_12M、更优选10_8至10_12M、最优选低于10_12M。
3.权利要求I或2的多肽，所述多肽选自SEQID NO :1至119或其功能衍生物。
4.一种融合蛋白，所述融合蛋白包含与药学上和/或诊断上的活性组分融合的权利要求I至3中任一项的多肽。
5.权利要求4的融合蛋白，其中所述组分为细胞因子，优选选自IL-2、IL-12、TNF-a、IFN a、IFN β,IFN Y、IL-10、IL-15、IL-24、GM-CSF、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-II、IL-13、LIF、CD80、B70、TNF β、LT-β、CD-40 配体、Fas-配体、TGF-β、IL-1 α 和IL-I β ο
6.权利要求4的融合蛋白，其中所述组分为毒性化合物，优选小的有机化合物或多肽，更优选选自以下的毒性化合物加利车霉素、美登木素生物碱、新制癌菌素、埃斯波霉素、达内霉素、可达菌素、maduropeptin、多柔比星、柔红霉素、auristatin、蓖麻毒蛋白-A链、蒴莲根毒蛋白II、截短的假单胞菌外毒素A、白喉毒素和重组白树毒素。
7.权利要求4的融合蛋白，其中所述组分为趋化因子，优选选自IL-8、GROa、GROβ、GRO Y、ENA-78、LDGF-PBP, GCP-2、PF4、Mig、IP-10、SDF-I a / β、BUNZ0/STRC33、I-TAC,BLC/BCA-1、MIP-I a、MIP-I β、MDC, TECK、TARC, RANTES, HCC-U HCC-4、DC-CK1、MIP-3 a、ΜΙΡ-3β、MCP-1-5、嗜酸性粒细胞趋化因子、嗜酸性粒细胞趋化因子-2、1-309、MPIF-U6Ckine、CTACK, MEC、淋巴细胞趋化蛋白和CXXXC趋化因子。
8.权利要求4的融合蛋白，其中所述组分为突光染料,优选选自AlexaFluor或Cy染料的组分。
9.权利要求4的融合蛋白，其中所述组分为光敏剂，优选光毒的红色荧光蛋白'KillerRed或血卩卜啉。
10.权利要求4的融合蛋白，其中所述组分为前凝血剂因子，优选组织因子。
11.权利要求4的融合蛋白，其中所述组分为用于前药活化的酶，优选选自羧肽酶、葡糖醛酸糖苷酶和葡糖苷酶的酶。
12.权利要求4的融合蛋白，其中所述组分为来自以下的放射性核素Y-发射同位素，优选99mTc、123I、mIn，或者正电子发射体，优选18F、64Cu、68Ga、86Y、124I，*# β -发射体，优选mI、9°Y、177Lu、67Cu，或者 α-发射体，优选 213Bi、211At。
13.权利要求4的融合蛋白，其中所述组分为功能Fe结构域，优选人功能Fe结构域，更优选包含多聚体的、优选二聚体的权利要求I至3中任一项的多肽的人功能Fe结构域。
14.前述权利要求中任一项的多肽或融合蛋白，其还包含调节血清半衰期的组分，优选选自聚乙二醇(PEG)、免疫球蛋白和白蛋白-结合肽的组分。
15.权利要求4至14中任一项的融合蛋白，其包含权利要求I至3中任一项的多肽。
16.包含选自SEQID NO :1至119或其功能衍生物的多肽的融合蛋白。
17.权利要求I至3中任一项的多肽或权利要求4至16中任一项的融合蛋白，所述融合蛋白包含权利要求I至3中任一项多肽的多聚体，优选二聚体或三聚体。
18.一种分离并纯化的核酸，其包含 (i)编码权利要求I 或 2 的多肽，优选编码(G/E) VTLFVALYDY-(X)6-D-(X)-SFHKGEKF-(X) rI-(X) 5_7-G- (X) !-Wff- (X) -A- (X) -SLTTG- (X) h-GYIPSNYVAPVDSIQ 的核酸； (ii)具有与(i)的核酸序列有至少70%、优选至少80%、更优选至少90%、最优选至少95%序列同一性的序列的核酸； (iii)与(i)或(ii)的核酸的互补链杂交的核酸； (iv)核酸，其中所述核酸可通过或(iii)的核酸之一的取代、添加和/或缺失而得到； (V)与编码权利要求I或2的多肽的(i)的核酸的互补链杂交的(i)至(iv)的核酸中任一种的片段。
19.权利要求18的核酸，所述核酸编码权利要求I至17中任一项的多肽或融合蛋白。
20.权利要求18或19的核酸，其中所述核酸为DNA、PNA或RNA。
21.权利要求18至20中任一项的核酸，其中所述核酸有效连接至启动子，优选连接至选自以下原核启动子的启动子T5启动子/Iac操纵基因元件、Τ7启动子/Iac操纵基因元件，或选自以下真核启动子的启动子hEFl-HTLV、CMV enh/hFerL启动子。
22.—种重组载体，所述重组载体包含权利要求18至21中任一项的核酸，其中所述载体优选能够产生权利要求I至17中任一项的多肽或融合蛋白。
23.权利要求22的重组载体，其选自pQE载体、pET载体、pFUSE载体、pUC载体、YAC载体、噬菌粒载体、噬菌体载体、用于基因治疗的载体例如逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒。
24.—种宿主细胞,其包含前述权利要求中任一项的核酸和/或载体。
25.一种抗体，其特异性结合权利要求I至3中任一项的多肽。
26.一种杂交瘤细胞系，其表达权利要求26的单克隆抗体。
27.一种药物组合物，其包含前述权利要求中任一项的多肽或融合蛋白、核酸和/或重组载体以及任选的药学上可接受的载体。
28.前述权利要求中任一项的多肽或融合蛋白、核酸和/或重组载体用于制备药物的用途，所述药物优选用于治疗和/或预防选自 IL-17A-和Thl7-相关疾病或医学病症的疾病或医学病症。
29.权利要求28的用途，其中所述疾病或医学病症选自炎性、自身免疫性和/或骨丢失相关的疾病和医学病症。
30.权利要求28和30的用途，其中所述疾病或医学病症选自关节炎、优选类风湿性关节炎、慢性进行性关节炎、反应性关节炎、牛皮癣关节炎、肠病性关节炎和变形性关节炎、风湿性疾病、脊椎关节病、强直性脊椎炎、莱特尔综合征、超敏反应(包括呼吸道超敏反应和皮肤超敏反应)、变态反应、系统性红斑狼疮、炎性肌肉病症、多软骨炎、硬皮病、韦格纳肉芽肿病、皮肌炎、史-约综合征、慢性活动性肝炎、重症肌无力、牛皮癣、特发性口炎性腹泻、自身免疫炎性肠病、溃疡性结肠炎、克罗恩病、肠易激综合征、内分泌性眼病、格雷夫斯病、结节病、多发性硬化、原发性胆汁性肝硬化、青少年糖尿病(I型糖尿病)、自身免疫血液病症、溶血性贫血、再生障碍性贫血、单纯红细胞性贫血、特发性血小板减少症、色素层炎(前眼色素层炎和后色素层炎)、干性角膜结膜炎、春季角膜结膜炎、间质性肺纤维化、肾小球性肾炎(具有和不具有肾病综合征)、特发性肾病综合征或微小病变肾病、肿瘤、皮肤炎性疾病、角膜炎症、肌炎、骨植入物松弛、代谢紊乱、动脉粥样硬化、糖尿病，和血脂障碍、骨丢失、骨关节炎、骨质疏松症、呼吸道阻塞疾病或呼吸道炎性疾病的牙周疾病、哮喘、支气管炎、尘肺病、肺气肿、急性及超急性炎性反应、涉及IL-17A-介导的TNF- α的疾病、急性感染、感染性休克、内毒素性休克、成年呼吸窘迫综合征、脑膜炎、肺炎、严重烧伤、恶病质、衰竭综合征、中风、疱疹性基质性角膜炎以及干眼疾病。
全文摘要
本发明涉及新的IL-17抑制多肽、相应融合蛋白、组合物及其医药用途。
文档编号C07K14/435GK102869678SQ201080049435
公开日2013年1月9日 申请日期2010年8月24日 优先权日2009年8月27日
发明者D·格拉布洛夫斯基, M·赛拉斯梅尔科, F·穆尔朗, S·S·布拉克, J·贝钦格, N·巴恩齐格, S·巴泰 申请人:科瓦根股份公司