专利名称：：猪圆环病毒的生产方法及监控生产的测定法的制作方法
技术领域：
：本发明涉及在批量孵育生产过程中使用荧光抗体细胞分选分析在线(in-process)监控病毒产量的方法。本发明进一步涉及在可能缺乏血清组分的培养基中在线监控并收获被圆环病毒感染的细胞培养物的方法。
背景技术：
：断奶仔猪多系统衰竭综合征(postweaningmultisystemicwastingsyndrome)(PMWS)是最近被识别的仔猪疾病。在加拿大、美国和法国检测到的PMWS综合征的临床特征为体重逐渐减轻，以及体征例如呼吸急促、呼吸困难和黄疽。从病理学观点来看，其表现为淋巴细胞或肉芽肿浸润，淋巴结病以及较罕见的肝炎和淋巴细胞或肉芽肿性肾炎。(ClarkE.G.(1997)Proc.Am.Assoc.SwinePrac.499—501;LaSemaineVeterinaireNo.26，supplementtoLaSemaineVeterinaire1996(834);LaSemaineVeterinaire1997(857):54;Nayar等人(1997)Can.Vet.J.38:385-387)。目前还没有治疗和预防这种疾病的方法。然而，多项证据指出猪圆环病毒是PMWS的病原体(Ellis等人(1998)Can.Vet.J.39:44-51)。圆环病毒已从患有PMWS的猪回收，并且针对猪圆环病毒的抗体已在患有该疾病的猪体内证实。命名为圆环病毒科的病毒科在一系列植物和动物种类中发现并且通常被称为圆环病毒，其特征为包含环状单链脱氧核糖核酸(ssDNA)的圆形无包膜的病毒粒子，平均直径为17-23.5nm。圆环病毒的ssDNA基因组代表已知的最小的病毒DM复制子。如WO99/45956中公开的，依据国际病毒分类委员会笫6次报告，至少6种病毒已鉴定为该科成员(Lukert等人，1995，TheCircoviridae，第166-168页。InMurphy等人，(eds.)VirusTaxonomy,SixthReportoftheInternationalCommitteeonTaxonomyofViruses,Arch.Virol.10Suppl.)。该科中包括的动物病毒是鸡贫血病毒(CAV);味羽病病毒(BFDV);猪圆环病毒(PCV);和鸽圆环病毒。PCV最初从猪肾细胞培养物中分离。PCV在细胞核中复制并产生大的核内包含体。参见Murphy等人(1999，Circoviridae第357-361页，VeterinaryVirology,第3版，AcademicPress,SanDiego)。目前识另'J了2种类型的PCV-PCV1型(PCV1)和PCV2型(PCV2)。作为连续猪肾细胞系PK-15(ATCCCCL31)的持续污染物被分离出的PCV1,在细胞培养物中不会引起可检测细胞病变效应，并且在实验性感染后在猪中未能产生临床疾病(参见AllanG.(1995)Vet.Microbiol44:49-64;Tischer等人(1982)Nature295:64-66;和Tischer等人(1986)Arch.Virol91:271-276)。只在最近，一些作者认为PCV毒林能够致病且与PMWS综合征有关(Nayar等人(1997)Can.Vet.J.38:385-387和ClarkE.G.(1997)Proc.Am.Assoc.SwinePrac.499-501)。Nayar等人用PCR技术在患有PMWS综合征的猪中已检测到PCVDM。和PCV1相反，PCV2与断奶猪中的断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)紧密相关(参见Allan等人(1998)Eur.J.Vet.Diagn.Investig.10:3-10;Ellis等人(1998)Can.Vet.J.39:44-51和Morozov等人(1998)'J.Clin.Microbiol.36:2535-2541)。关于PCV1的核苷酸序列在Mankertz等人(1997)J.Virol.71:2562-2566)和Meehan等人(1997)J.Gen.Virol.78:221-227)中公开，并且关于PCV2的核苷酸序列在Hamel等人(1998)J.Virol.72:5262-5267;Mankertz等人(2000)VirusRes.66:65-77和Meehan等人(1998)J.Gen.Virol.79:2171-2179中公开。PCV2毒抹在W000/01409中公开且已保藏在英国PortonDown,Salisbury,WiltshireSP4OJG应用微生物学研究中心(CentreforAppliedMicrobiology&Research)的欧洲细胞培养物保藏中心，并且包括登记号V97100219;登记号V9700218;登记号V97100217;登记号V98011608;和登记号V98011609。WO00/77216同样7^开了PCV2。在PCV2基因组中已鉴定了多达13个可读框(M尸)。Meehan等人，(1998))也称为M尸《包含核苷酸398-1342(GenBank登记号AF055392)并且可能编码预测分子量为37.7kD的蛋白质。^F2(Meehan等人，(1998));也称为朋尸7J,包含与1-314相连的核苷酸1381-1768(GenBank登记号AF055392),且可以编码预测分子量为27.8kD的蛋白质。PCV2ORFs1-13的进一步描述可以在美国专利号6,368,601、6,391,314、6，660272、6,217,883、6,517,843、6，497,883以及AU764379、EP1019510、MX221562、MX216996、RU2237492和NZ505008中找到，所述专利全文引入本文作为参考。PCV2的与PCV1分离林的高度相似(86%同一性)(Meehan等人，(1998))。PCV1的0RF1蛋白质已部分表征(Meehan等人，1997;Mankertz等人，(1998)Virusgenes16:267-276)并且已显示是病毒复制所必需的，很可能涉及病毒DNA复制。其0RF2s之间的蛋白质序列同一性(66%同一性)低于0RF1之间的同一性，但是每个0RF2具有高度保守的碱性N-末端区，类似于在禽类圆环病毒鸡贫血病毒(CAV)(Meehan等人，1998)的主要结构蛋白质的N-末端区所观察到的那种。最近，Mankertz等人，在(1998)J.Gen.Virol.79:381—384中已提出PCV1分离林的,2(Mankertz等人命名为ORFl,1998)编码衣壳蛋白。PCV2基因组的转录分析仍未公开。使用PCV1分离林获得的近期数据表明M尸2转录物是被剪接的(Mankertz等人，1998)。的培养病毒。Tischer等人((1987)ArchVirol.96:39-57)报导猪肾细胞通过D-葡糖胺处理被刺激进入细胞周期中的S期。然而，该处理必须谨慎进行因为D-葡糖胺对细胞培养物有毒性(参见，Allan等人(2000)J.Vet.Diagn.Investigation.12:3-14)。仍需要用于培养圆环病毒包括例如PCV1、PCV2以及其他圆环病毒的方法，从而使得高产量的圆环病毒是可能的。此类方法特别对于制备PCV2抗原作为针对PMWS的疫苗将是有利的。本发明致力于此需要。本发明涉及用于培养和定量感染或抗原量，以及测定针对圆环病毒特别是猪圆环病毒(PCV)的抗体的方法，其允许在线监控批量培养中的病毒生产过程。虽然猪圓环病毒在猪组织培养物中可以作为污染物4皮检测，但该病毒的成功的大规模批量培养需要快速测定法以允许连续监控病毒生产过程以获得最佳产量。因此，本发明的目的是开发用于监控圆环病毒如猪圆环病毒体外培养过程的方法，以便能够检查ORFs的动态表达。本发明也希望增加细胞培养物的病毒产量用于生产疫苗，所述疫苗可能需要灭活的PCV或者无毒性PCV毒林(例如，在适应各种细胞培养和/或使用诱变剂处理受感染的细胞培养物后，或者PCV遗传修饰后，通过选择无毒性PCV毒株)作为活疫苗。另外，从培养的猪圓环病毒获得的抗原材料也可用于诊断用途。因此需要在提供适合于疫苗或其他用途的病毒颗粒的条件下能够定期且快速监控圆环病毒的批量细胞培养过程。需要可以快速给出结果的监控方法，而不是目前为此目的使用的劳动密集且耗时的方法。本申请中任何文件的引用或认同并非承认此类文件可用作本发明的现有技术。发明概述本发明提供了基于FACS的程序，用于在线监控和快速测定被圆环病毒感染的细胞培养物的有效收获点，从而使得可以获得该病毒的最佳产量。该方法包括提供被圆环病毒感染的宿主细胞的种子培养物并由其接种批量培养物，孵育种子培养物，取出培养细胞的等分试样，分离悬浮细胞和贴壁细胞，使贴壁细胞脱离其基质，测定宿主细胞存活力，并通过FACS测定0RF1-和0RF2-阳性细月包的百分比，由此确定培养物的收获点。本发明的一个方面提供了基于FACS的方法，用于检测宿主细胞培养物的圆环病毒抗原的生产，其中该方法可以包括下列步骤从被圆环病毒感染的宿主细胞培养物中获得包含非贴壁宿主细胞群和附着至基质的宿主细胞群的样品，从该样品中分离出其非贴壁宿主细胞，从该样品中分离出其贴壁宿主细胞和基质并使贴壁宿主细胞脱离基质，通过使所述细胞与0RF1特异性抗体接触来测定非贴壁和脱离的贴壁宿主细胞中的0RF1量，通过使所述细胞与0RF2特异性抗体接触来测定非贴壁和脱离的贴壁宿主细胞中的受感染细胞百分比，和将样品中的0RF1-和0RF2-阳性细胞百分比和该样品中的圆环病毒量相关联。在该方法的各个实施方案中，圆环病毒可以是PCV2。在各个实施方案中，宿主细胞林可以是PK-15或者其他合适的细胞系。然而，预期本发明的方法可以有效地应用于检测和在线监控在分离的宿主细胞上培养的任何圓环病毒生产，并且对于该圆环病毒存在可用的病毒抗原特异性抗体。本发明的另一方面提供了基于FACS的方法，用于在线监控来自培养的宿主细胞的圆环病毒生产，该方法包括下列步骤从被圆环病毒感染的宿主细胞培养物中获得时间依赖性的多个样品，该系列中的每个样品包含非贴壁宿主细胞群和附着至基质的宿主细胞群，从细胞培养物的每个样品中分离出其非贴壁宿主细胞，从细胞培养物的每个样品中分离出其贴壁宿主细胞和基质并使贴壁宿主细胞脱离基质，通过使用流式细胞法测量碘化丙锭摄取来测定样品中宿主细胞的存活力，通过使所述细胞与0RF1特异性抗体接触测定非贴壁和脱离的贴壁细胞中的0RF1量来测定非贴壁和脱离的贴壁细胞中存在的ORFl阳性细胞百分比，通过FACS测定与细胞结合的抗体量并将结合抗体的量与细胞中存在的ORFl量相关联，通过使所述细胞与0RF2特异性抗体接触测定非贴壁和脱离的贴壁宿主细胞中的0RF2量来测定非贴壁和脱离的贴壁细胞中存在的0RF2阳性细胞百分比，通过FACS测定与细胞结合的抗体量并将结合抗体的量与细胞中存在的0RF2量关联，和对存活力、0RF1和0RF2水平中的变化作图，从而确定在宿主细胞培养物中的圆环病毒生产的时间过程。在本发明的这种方法的一个实施方案中，细胞存活力可以使用碘化丙锭和流式细胞法来测定。在本发明的这种方法的各个实施方案中，圆环病毒可以是PCV2并且宿主细胞林可以是PK-15，虽然该方法不应解释为只能应用于这种圆环病毒毒林/宿主细胞组合。本发明的再一方面是以可能对例如疫苗制备有用的产量生产圆环病毒的方法，包括下列步骤通过在线监控0RF1的表达制备圆环病毒种子培养物并且用圆环病毒种子培养物接种宿主细胞培养物，在不存在胎牛血清的情况下孵育宿主细胞培养物，监控(i)宿主细胞存活力，和(ii)由宿主细胞表达的ORFl和0RF2，并当宿主细胞培养物的非贴壁细胞和贴壁细胞中0RF2的表达几乎相同时，从宿主细胞培养物中收获圆环病毒。本发明的这个方面的各个实施方案中，种子培养物中的圆环病毒产量可以通过使用基于荧光抗体细胞分选(FACS)的方法监控悬浮宿主细胞中的圆环病毒ORFl和0RF2抗原表达来测定，并且其中当0RF2由非贴壁细胞表达时收获种子培养物。在本发明的这个方面的各个实施方案中，细胞存活力可以通过使用流式细胞法测量碘化丙锭摄取来测定。在本发明的这种方法的各个实施方案中，圆环病毒可以是PCV2并且宿主细胞林可以是PK-15,虽然该方法不应解释为只能应用于这种圆环病毒毒抹/宿主细胞组合。然而，预期本发明的方法可以有效地应用于检测和在线监控在分离的宿主细胞上培养的任何圆环病毒生产，并且对于圆环病毒存在可用的病毒抗原特异性抗体。应当注意在本公开内容中以及特别在权利要求和/或段落中，术语例如"包含"可以具有在美国专利法中对其认定的含义；例如它们可以意指"包括"；并且此类术语如"基本上由……组成"具有在美国专利法中归于其的含义，例如它们涵盖未明确叙述的元件，但排除在现有技术中发现或影响本发明的基本或新颖特征的元件。这些以及其他实施方案在下文详细描述中/〉开，或由于下文详细描述而变得显而易见并由下文详细描述所涵盖。附图简述作为例子给出，但不希望将本发明单独限制于描述的具体实施方案的下列详细描述，与引入本文参考的附图结合可以被最好地理解，其中图1举例说明从细胞培养物中分离悬浮和贴壁PK-15细胞以及测定其中的病毒抗原0RF1和0RF2的方案；图2举例说明细胞悬浮液中PK-15总细胞的流式细胞法计数，包:括活细力包和死细月包；图3举例说明通过碘化丙锭摄取中的变化和FACS检测被PCV2感染的PK-15细胞群中死细胞的比例；图4举例说明在整个孵育期间在胎牛血清存在下被PCV2感染的PK-15细胞的工作种子培养物存活力的时间过程；图5举例说明0RF1的免疫检测和经由FACS的测量；图6举例说明在工作种子培养物醉育期间PCV2病毒0RF1和0RF2抗原的生产；和图7举例说明在3天后从培养基中除去FCS后被PCV2感染的PK-15细胞中的病毒抗原0RF1和0RF2的生产。发明详述在下文中引用了各种文件，并且在下文引用的文件中参考或引用了各种文件。这并不是承认任何此类文件实际上是关于本发明的现有件在此引入本文作为参考。''^'如本文使用的，术语"流式细胞仪"指用第一个波长的光照射悬浮在流体介质中的颗粒，并且能够检测相同或不同波长处的光的任何装置，其中检测到的光表明了细胞或在细胞上的指示剂的存在。"流式细胞仪"可以与细胞分选仪偶联，所述细胞分选仪能够使颗粒或细胞与不发射第二种光的其他颗粒和细胞分离。细胞表面上的指示剂可以是与荧光团偶联的抗体，例如但不限于FITC(如果是荧光抗体细胞分选(FACS))。如本文使用的，术语"宿主细胞"指用于病毒优选圆环病毒感染和复制的宿主的分离细胞。如本文使用的，术语"贴壁细胞"指在体外生长且附着至基质的动物细胞。基质可以是培养容器的表面，或者，如在批量细胞培养中可以是颗粒状固体支持物如CYTODEX(AmershamBiosciences,Inc)珠等。通过需要酶消化亚细胞基质的方法，包括在受控条件下使用蛋白酶例如，但不限于，胰蛋白酶消化，可以使此类细胞与下面的固体支持物分离。相反，术语"非贴壁细胞"指在培养的过程中已与基质分离的那些培养细胞。如本文中使用的，基因、基因位点或其转录物用斜体指示；并且由其表达的蛋白质或多肽用非斜体指示。如本文中使用的，术语"0RF1"和"0RF2"分别指由可读框^/7和朋尸2表达的圆环病毒抗原(如Meehan等人，(1998)J.Gen.Virol.78:221-227指定的)。0RF1被认为是早期复制酶并且0RF2被认为是促成病毒衣壳的多肽。在PCV2基因组中已鉴定出13个可读框(M尸s)。PCV20RFs的进一步描述可以在全文引入本文作为参考的美国专利号6，368，601、6，391，314、6，660272、6，217，883、6，517，843、6，497，883以及AU764379、EP1019510、MX221562、MX216996、RU2237492和NZ505008中找到。PCV2中每个ORF蜂皮指定的各种名称之间的相互关系显示于下文实施例1中。如本文使用的，0RF1和0RF2分别与0RF4和0RF13相对应(如上文参考的专利中指定的)。术语"在线"指在整个培养期间监控细胞和病毒培养物，包括被病毒感染的细胞培养物，所特有的参数。监控可以是连续的，例如监控培养基的pH或氧含量，或者可以是定期监控，其中样品在所选时间点取自培养物，检测并测量参数例如存活力或病毒抗原含量并且将参数对培养时间作图。如本文使用的，术语"种子培养物"指被所选病毒例如圆环病毒感染且随后孵育一定时间以允许病毒滴度增加的宿主细胞培养物。通常，但不是必需的，种子培养物的体积少于接受种子培养物的后续主要培养基或发酵培养基的体积。根据长期的法律约定，如本文包括权利要求使用的，术语"a"和"an"应理解为"一个(种)"或"多个(种)"。缩写:0RF，可读框；朋尸，编码ORF的核苷酸序列；PK,猪肾；PCV,猪圆环病毒；PK-15,猪肾细胞；FACS，荧光抗体细胞分选；ELISA，酶联免疫吸附测定法；Mab,单克隆抗体；FITC，异硫氰酸荧光素；IgG，免疫球蛋白G;PBS/BSA，磷酸盐緩沖盐水/牛血清白蛋白。本发明提供了用于测定被圆环病毒特别是猪圆环病毒感染的宿主动物细胞培养物中的病毒产量的方法。然而，本发明的方法一般可应用于特别是批量培养程序中，在细胞培养物上生长的任何其他圆环病毒毒林或类型。本发明的方法对监控猪圆环病毒毒林PCV2的批量培养的病毒产量特别有用。本发明中基于FACS的方法包括测定细胞培养基中悬浮的宿主细胞和保持附着至固体支持物的那些细胞的存活力，所述固体支持物例々口，但不卩艮于，CYTODEX(AmershamBiosciences,Inc)。培养的宿主细胞的病毒载量通过下列方法测量测定非贴壁和脱离的贴壁细胞中存在的ORFl-阳性细胞百分比，测定非贴壁和脱离的贴壁细胞中存在的0RF2-阳性细胞百分比，将样品中的0RF1-和0RF2-阳性细胞百分比与样品中的圆环病毒量相关联。病毒产量通过检测和测量悬浮细胞中的两种抗原来确定，例如从宿主细胞转移至无血清培养基时起5-7天。因此本发明的一个实施方案是适合于滴定PCV2的新型测定法，其基于通过流式细胞法使用对0RF1或0RF2特异的单克隆抗体来免疫检测PK-15宿主细胞中的病毒蛋白质。此外，PK-15细胞的生长动力学也可以通过流式细胞法来监控。本发明方法的快速性允许测定最佳收获点来达到高病毒产量。可以选择提供对例如疫苗生产有用的病毒产量的收获点，同时最小化细胞孵育期，随之降低成本。本发明的方法快速地产生定量数据。这允许在整个孵育期过程中反复监控病毒生产并易于选择最合适收获点。测量病毒滴度的常规方法慢得多且涉及扩充培养测试样品以形成可计数斑。在PK-15细胞上生长的病毒的常规板测定法基于使用以0RF2单克隆抗体为基础的ELISA的免疫荧光检测，耗时且劳动密集，需要几天才能得到有用的结果。本发明的一个方面是用于在批量培养期间快速测定培养的宿主细胞的存活力特性的方法。虽然该方法对监控用于病毒生产的任何细胞培养都是有用和合适的，但是该方法对在线监控PK-15细胞的细胞培养物是特别有用的，所述PK-15细胞用于批量生产PCV2圆环病毒，用于疫苗生产。依据本发明方法的这个方面中，以及如图l举例说明的，批量细胞培养物的样品分成悬浮(非贴壁)细胞群和附着至固体基质的细胞群。用于在PK-15宿主细胞培养中使用的基质是，例如，CYT0DEX(AmershamBiosciences,Inc)珠，尽管也可以选择组织培养领域技术人员已知的任何其他合适材料。密度大的基质珠允许通过重力来沉降，并且含有非贴壁细胞的悬浮培养基可通过各种方法中的任何一种去除，如抽吸、倾析、离心等。附着至基质的细胞随后可以通过例如胰蛋白酶消化脱离基质，在显微镜下监控消化脱离的程度以确定细胞脱离基质的最大点，而对细胞自身的损伤最小。收获脱离的细胞以产生两种所需细胞群中的第二种。本文描述了用于生产能够特异地识别圆环病毒例如但不限于PCV2的0RF1或0RF2蛋白质中一种或多种表位的抗体的方法。此类抗体可以包括，但不限于，多克隆抗体、单克隆抗体(mAbs)、嵌合抗体、单链抗体、Fab片段、F(ab"2片段、由FAb表达文库产生的片段、抗独特型(抗-Id)抗体，以及上述任何一种的表位结合片段。有利地，用于在本发明中使用的抗体是对由圆环病毒M/7和M尸2基因表达的0RF1或0RF2蛋白质特异的单克隆抗体。最有利地，0RF1或0RF2蛋白质由圆环病毒PCV2表达。对于抗体生产，各种宿主动物可以通过注射分离的0RF1或0RF2多肽或其免疫原性肽进行免疫。此类宿主动物可以包括，但不限于，例如兔、小鼠、和大鼠等。取决于宿主种类，可以使用各种佐剂增加免疫应答，包括，但不限于，弗氏(完全和不完全)，矿物胶如氢氧化铝，表面活性物质如溶血卵磷脂、pluronic多元醇、多聚阴离子、肽、油乳剂、匙孔血蓝蛋白、二硝基苯酚，以及可能有用的人佐剂例如BCG(卡介苗)和小棒杆菌(Cor，6a"e"'咖；ar層)。免疫步骤完成后，可以收集与0RF1或0RF2蛋白质反应的抗血清并且需要时，可以分离多克隆抗"0RF1(或抗"0RF2)蛋白质抗体。多克隆抗体是来源于用抗原免疫的动物血清的抗体分子异质群体，所述抗原例如是靶基因产物，或其抗原功能性衍生物。为了产生多克隆抗体，宿主动物例如上文所述的那些可以通过注射补充了如上所述的佐剂的0RF1或0RF2蛋白质进行免疫。单克隆抗体是针对特定抗原的抗体同质群体，可以通过提供经由培养的连续细胞系来生产抗体分子的任何技术获得。这些包括，但不限于Kohler和Milstein的杂交瘤才支术(1975)Nature256:495-497;和美国专利号4，376，IIO)，人B细胞杂交瘤技术(Kosbor等人(1983)ImmunologyToday4:72;Cole等人(1983)Pro"Natl.Acad.Sci.U.S.A.80:2026-2030)，以及EBV-杂交瘤技术(Cole等人(1985)MonoclonalAntibodiesAndCancerTherapyAlanR.Liss，Inc.笫77-96页)。简言之，从被免疫的小鼠收获脾细胞且与永生化细胞(即，骨髓瘤细胞)融合以产生抗体生产性杂交瘤。杂交瘤可以用免疫化学法歸选，以确定生产与0RF1或0RF2蛋白质特异反应的单克隆抗体的杂交瘤。用于获得定制的多克隆抗血清和单克隆抗体的商业来源也是可利用的。，H口，HTIBio—Products，Inc.(Ramona，Calif.)生产定制的抗体、抗血清、腹水和杂交瘤系。用于生产、分离和纯化常规和单克隆抗体的方案可以类似于下列中描述的那些Cassone等人(1988)J.Med.Microbiol.27:233-238;Hancock和EvanProductionandCharacterizationofAntibodiesagainstSyntheticPeptides第23-33页，ImmunochemicalProtocolsed.M.M.Manson，(1992)(HumanaPress,Totowa,N.J.);Goding,J.W.,MonoclonalAntibodies:PrinciplesandPractice,第二版，(1986)(AcademicPressLtd.,London)以及Lam和Mutharia,"Antigen-AntibodyReactions,"第104-132页，MethodsforGeneralandMolecularBacteriology,ed.P.Gerhardt:(1994)(ASMPress,Washington,D.C.)，其内容整体引入本文作为参考。此类抗体可以是任何免疫球蛋白类包括IgG、IgM、IgE、IgA、IgD，及其任何亚类。本发明中生产MAbs的杂交瘤可以在体外或体内培养。高滴度MAbs的体内生产使得这成为目前优选的生产方法。可替代地，用于单链抗体生产的技术例如，但不仅是，美国专利号4，946，778;Bird(1988)Science242:423-426;Huston等人(1988)Pro"Natl.Acad.Sci.85:5879-5883;和Ward等人(1989)Nature334:544-546,可以适合于生产0RF1或0RF2蛋白质特异性抗体。单链抗体经由氨基酸桥连接Fv区的重链和轻链片段产生单链多肽而形成。识别特异性表位的抗体片段可以通过已知技术产生。例如，此类片段包括，但不限于可以通过胃蛋白酶消化抗体分子产生的F(ab')2片段和可以通过还原F(ab')2片段的二硫桥产生的Fab片段。可替代地，可以构建Fab表达文库(Huse等人(1989)Science246:1275-1281)以允许快速且容易地鉴定具有所需特异性的单克隆Fab片段。依据本发明制备的抗体可以用于检测细胞、细胞提取物之中或之上、或者其他包含0RF1或0RF2蛋白质的生物制剂中的0RF1(或0RF2)蛋白质。此外，此类抗体可以用检测分子标记以允许检测抗原/抗体复合物。合适的标记包括各种酶、荧光分子、放射性标记、化学发光分子等。例如，用于标记抗体的酶包括辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶。荧光标记包括，但不限于，荧光素、若丹明、丹磺酰氯或藻红蛋白。如下文实施例2中所述，两种细胞群的存活力通过将分离的细胞群的等分试样与碘化丙锭混合来测定，所述碘化丙锭只能被非存活细胞的细胞核吸收。染色的细胞通过流式细胞法分析以获得总细胞计数，例如如图2中所示，以及样品群中活细4包和死细胞的比例，如图3中所示。除了宿主细胞的存活力测量外，本发明的方法进一步包括使分离的细胞群与对病毒抗原0RF1和0RF2特异的抗体接触的步骤，同样如下文实施例2中所述。细胞随后进行洗涤并可以与用焚光团例如，但不限于，FITC标记的抗-IgG抗血清接触，之后通过流式细胞仪测量细胞结合的荧光，同样如下文实施例2中所述。图2、3和4显示了在培养基中使用胎牛血清的l升批量培养物中生长的PK-15细胞上的PCV2病毒生长的示例性存活力结果。例如，在孵育5天后的一个实验中，大约50%培养总细胞群位于培养基的上清液中并且主要是死亡的。这与附着至CYT0DEX(AmershamBiosciences,Inc)基质且存活的剩下50%细月包形成对比。包含胎牛血清的批量培养物中的病毒生产测量显示，0RF1在第1和2天时且只在基质附着细胞中暂时表达。例如如图6中所示，0RF1只在第3-5天在悬浮(或非贴壁)细胞中检测到。例如如图6中所示，病毒衣壳抗原0RF2只能在悬浮、非贴壁细胞中检测到，在第1天孵育后随着孵育期过去而持续增加。本发明的方法允许通过检测直到收获点时悬浮(且因此主要是死亡的)细胞中表达的0RF1和0RF2来检测和监控圆环病毒和受感染细胞。这些数据获得的快速性允许经常定期监控细胞培养物的感染进展。随后培养物可以在产生适合于接种大批量宿主细胞培养物的病毒高产量点收获，用于病毒的最终生产，其质和量足以用于在例如疫苗开发和生产中使用。由于使用本发明方法开发的种子培养物可以用于接种100-1000升体积级别的大体积的细胞培养物。在此过程中，在第5天或如通过上文测定的0RF2表达特别指出的其他时间点上收获的种子培养物，接种到包含含有胎牛血清的细胞培养基的大规模细胞培养体系内。宿主细胞如PK-15细胞的存活力随后依据下文实施例2中所述的方法监控。例如如图7中所示，可以是但不限于大约3天的初始孵育期后，细胞培养基可以换成不包括胎牛血清的培养基，并继续孵育，再次使用定期在线取样和测定。因此，本发明的另一方面是通过使用FACS监控0RF1和0RF2的生产来在线监控大规模宿主细胞培养物中的圆环病毒生产。当与基于常规培养的程序比较时，使用如实施例2中所述的本发明方法，可以快速且更频繁地监控细胞培养物，从而使得一旦达到所需病毒产量就可以收获培养物。例如如图7中所示，可以监控培养物的病毒特异性抗原0RF1和0RF2表达。通常，如图7中所示，总0RF1和0RF2抗原的生产模拟如图7中举例说明的宿主细胞生长模式。如下文实施例5中所示，在PK-15细胞上生长的PCV2标记0RF1和0RF2从第4天到第7天线性增长，并显示与附着至基质的贴壁细胞以及培养基上清液中的非贴壁细胞相似的增长模式。从培养基中去除血清减少并延迟病毒抗原表达的开始，特别是如果培养物在第5天时收获。然而，超过第5天的连续培养(从培养物接种时开始计算)可以明显增加0RF2抗原即成熟病毒颗粒的产量(参见图7)。因此，本发明提供了FACS操作，用于在线监控和快速测定被圆环病毒感染的细胞培养物的有效收获点，从而使得可以获得病毒的最佳产量。该方法包括提供被圆环病毒感染的宿主细胞的种子培养物和用其接种批量培养物，孵育种子培养物，取出培养细胞的等分试样，分离悬浮细胞和贴壁细胞，使贴壁细胞脱离基质，测定宿主细胞的存活力，通过FACS测定细胞样品中的0RF1和0RF2百分比，并确定培养物的收获点。本发明的一个方面提供了基于荧光抗体细胞分选(FACS)的方法，用于检测被病毒感染的宿主细胞培养物的圆环病毒抗原的生产，其中圆环病毒抗原的生产与可读框1(0RF1)和可读框2(0RF2)阳性细胞百分比相关，包括从来自被圆环病毒感染的宿主细胞培养物的包含非贴壁宿主细胞群和附着至基质的宿主细胞群的样品中分离(i)非贴壁宿主细胞和(ii)脱离基质的贴壁宿主细胞，并测定在分离的非贴壁宿主细胞和脱离基质的贴壁宿主细胞中存在的(i)可读框l(ORFl)阳性细胞百分比和(ii)可读框2(0RF2)阳性细胞百分比。在该方法的这个方面的各个实施方案中，圆环病毒可以是PCV2。在各个实施方案中，宿主细胞抹可以是PK-15。然而，预期本发明的方法可以有效地应用于检测和在线监控在分离的哺乳动物宿主细胞上培养的任何圆环病毒生产，并且对于该圆环病毒存在可用的病毒抗原特异性抗体。本发明另一方面提供了基于荧光抗体细胞分选(FACS)的方法，用于在线监控来自培养的宿主细胞的圆环病毒生产，其中对存活力、0RF1和0RF2水平中的变化作图确定宿主细胞培养物中的圆环病毒生产的时间过程，其包括从来自被圆环病毒感染的宿主细胞培养物的、包含非贴壁宿主细胞群和附着至基质的宿主细胞群的样品中分离(i)非贴壁宿主细胞和Ui)脱离基质的贴壁宿主细胞，测定非贴壁宿主细月包和贴壁宿主细月包的存活力，并测定在分离的非贴壁宿主细l包和脱离基质的贴壁宿主细胞中存在的(i)可读框l(0RF1)阳性细胞百分比和(ii)可读框2(0RF2)阳性细胞百分比。在本发明的这种方法的一个实施方案中，细胞存活力通过使用流式细胞法测量碘化丙锭摄取来测定。在本发明的这种方法的各个实施方案中，圆环病毒可以是PCV2并且宿主细胞株可以是PK-15,虽然该方法不应解释为只能应用于这种圆环病毒毒林/宿主细胞组合。例如本发明的方法一般可以应用于鸡贫血病毒或味习习病病毒(beakandfeatherdiseasevirus)和宿主细胞如合适的禽类宿主细胞等。本发明再一方面是在无血清条件下生产圆环病毒的方法，并且因此可用于制备疫苗，其包括下列步骤通过在线监控ORFl的表达制备圓环病毒种子培养物并且用圆环病毒种子培养物接种宿主细胞培养物，在不存在胎牛血清的情况下孵育宿主细胞培养物，监控(i)宿主细胞存活力，和(ii)由宿主细胞表达的ORFl和0RF2，并当宿主细胞培养物的非贴壁细胞和贴壁细胞中0RF2表达几乎相同时，从宿主细胞培养物中收获圆环病毒。本发明的这个方面的各个实施方案中，种子培养物中的圆环病毒产量可以通过使用基于荧光抗体细胞分选(FACS)的方法监控悬浮宿主细^^中的圆环病毒0RF1和0RF2抗原表达来测定，并且其中当0RF2由非贴壁细胞表达时收获种子培养物。在本发明的这个方面的各个实施方案中，细胞存活力可以通过使用流式细胞法测量碘化丙锭摄取来测定。在本发明的这种方法的各个实施方案中，被病毒感染的宿主细胞培养物中的ORFl和0RF2抗原表达可以使用基于荧光抗体细胞分选(FACS)的方法来监控，其中圆环病毒抗原的生产与可读框1(ORFl)和可读框2(0RF2)阳性细胞百分比相关。在本发明的这种方法的各个实施方案中，圆环病毒可以是PCV2并且宿主细胞林可以是PK-15,虽然该方法不应解释为只能应用于这种圆环病毒毒株/宿主细胞组合。然而，预期本发明的方法可以有效地应用于检测和在线监控在分离的哺乳动物宿主细胞上培养的任何圆环病毒生产，并且对于该圆环病毒存在可用的病毒抗原特异性抗体。应当理解本发明并不限于本文描述的具体组合物、设备或方法，围内。用于测定细胞培养物中受感染细胞的百分比的方法步骤仅是示例性的，以便使得本领域普通技术人员能够根据所述过程及其等价过程制备并使用组合物。还应当理解尽管本文显示和描述的本发明形式构成本发明的有利的实施方案，但它并不意味着举例说明了本发明的所有可能形式。措辞是说明性而不是限制性的措辞。可以对本发明进行各种变化和改变而不背离本发明的精神和范围。本发明通过下列非限制性实施例进一步描述。实施例实施例1:圆环病毒PCV2的ORFs名称之间的相互关系下表1显示了整体引入本文作为参考的圆环病毒PCV2的ORF、其等价名称、及其分别的来源。如Meehan等人(1997;1998)所述，0RF1和0RF2已分别可替代地命名为ORF4和13。表i;<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>实施例2:存活力、检测被PCV2感染的PK-15细胞中的0RF1和0RF2的测定法"J浙定细應^炎和勿^存话力使用碘化丙锭来评估质膜的完整性。碘化丙锭是染色核酸的荧光活体染料。死细胞掺入硪化丙锭，这通过流式细胞法使用Galaxy细胞计数器(可以使用其他类似功能型号的流式细胞仪)检测为红色染色。这种细胞计数器能够区别、检测并计数未染色(活的)或碘化丙锭染色(死的)细胞。根据关于所用细胞计数器的具体型号的制造商说明书测定200m1体积中的细胞数目。在Galaxy细胞计数器专用的试管中在PBS中制备1ml细胞悬浮液。细胞悬浮液的稀释度调整至大约2xl(T-约1x106细胞/ml(对应细胞计数器计数的线性值)。向细胞悬浮液中加5pi碘化丙锭(50Hg/ml)。悬浮液随后漩涡混合数秒并立即在细胞计数器上分析。细胞计数器的一般设置为FSC-谱系范围上的阈值；FL3对数范围上检测到的细胞荧光(对应碘化丙锭通道)。如图2和3中所示，细胞计数器软件自动产生作为散点图的计数结果。广69遞过^/量Mi^和/威M尸2^^/定憂惑染细^的^"为^化。单次测定需要大约3xl(T细胞，等分为lxl()6用于阴性对照、1x106用于0RF1检测和1x106用于0RF2检测。对于不同的细胞量，相应地调整反应物体积。(""使用BDCytofixCytoperm(BDBiosciences,ref.554714)。依据固定剂制造商的建议进行固定。简言之，3x106细胞在15ml或50ml的圆锥管中在400g下离心6分钟。弃去上清液，用750^1的Cytofix重悬浮细胞并在水上孵育20分钟。细胞用lml含1。/。BSA的PBS洗涤2次并重悬浮于lml的PBS/1%BSA中。染色之前样品储存于5'C至多15天。f//>^f和g;固定细胞在400g下离心6分钟，弃去上清液并加入300jalIXBDPerm/Wash溶液。100jul固定细胞分配到96微孔板的3个孔中并在400g下离心6分钟。弃去上清液并加入IOOpiIXBDPerm/Wash溶液。向每个孔中加入5抗体(1mg/ml)。通常，5jug单克隆抗体-纯化的Mab抗-PCV2(0RF1)编号1991D3GA，初始浓度-lmg/ml或者纯化的Mab抗-PCV2(0RF2)编号1903A8BC，初始浓度-lmg/ml足够用于每次染色。纯化的Mab抗-梭菌N。101B9B或等价物，初始浓度-lmg/ml，用作阴性对照。孔在水上孵育30分钟。细胞用IXBDPermWash溶液(200^1/次洗涤/孔)洗涤2次。随后每孔加入10(^1含VI抗小鼠FITC(与FITC缀合的抗小鼠IgG(例如，Beckman，参考号115-095-146)或其等价物)的IXBDPermWash溶液并将孔在冰上再孵育30分钟。细胞用IXBDPermWash溶液(200jnl/次洗涤/孔)洗涤2次并重悬浮于20(^1PBS/1。/。BSA/孔中。遞3关于细胞计数器的参数设定，如GalaxyCytometer(Partec)，一般为FSC-镨系范围上的阈值；FL1对数范围上检测到的细胞荧光(对应FITC通道)。图3中显示的代表性柱状图显示了与阴性对照细胞群比较，由于受感染PK-15宿主细胞群中的0RF1检测的荧光活性。为了计算受感染细胞的百分比，从ORF细胞的百分比中减去阴性细胞的百分比。在左侧的柱状图中，受感染细胞为0%，而在图3右侧的例子中，88%的细胞纟皮感染。图2中显示了通过粒度测量测定的活细胞和死细胞的一般分布，并且图4中显示了由于受感染的宿主细胞群死亡的碘化丙锭荧光信号中的变化。在这种情况中，80%的宿主细胞是死细胞。实施例3:在批量种子培养物接种PCV2后PK-15计数和存活力如图3中所示，在PK-15细胞上生长的PCV2病毒的批量种子培养孵育期的第5天时，50%的宿主细胞位于上清液中且大多数是死的(73%)。相反，50%的宿主细胞位于CYTODEXTM(AmershamBiosciences,Inc)基质支持物上且几乎全部是活细胞群(96%)。被PCV2感染的PK-15细胞在第5天培养结束时检测到，但只在悬浮细胞中(使用流式细胞法检测ORFl和ORF2)。例如如图6中所示，病毒特异性抗原形成的动力学取决于0RF:0RF1在早期产生且水平低，而ORF在孵育周期中较晚产生且水平渐增。实施例4:0RF1和0RF2总染色如图6中所示，对于0RF1，在培养物孵育期的晚期在细胞膜上没有信号。下表2显示在附着至CYT0DEXTM(AmershamBiosciences,Inc)的细胞上检测不到膜信号。主要ORF-特异性信号存在于来自培养物上清液中的细胞上并且从第2天到第5天渐增。活细胞或死细胞的结果相似，在第4天为最大值60%。<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>实施例5:3天后去除血清的大规模批量培养物中PK-15细胞上的PCV2圓环病毒培养依据本文引用的文件，用预先与PCV2病毒一起孵育5天的PK-15细胞培养物接种300升发酵罐。培养3天后，培养基换成缺乏胎牛血清的生长培养基。如上文实施例中所述测试每天获取样品中的PK-15存活力以及0RF1和0RF2的表达。图7中举例说明了病毒抗原ORF1和ORF2表达的时间过程。**鉴于此处详细描述的本发明的优选实施方案，应当理解由所附权背离其精神或范围即可进行其许多显而易见的变化。权利要求1.一种基于荧光抗体细胞分选(FACS)的用于检测被病毒感染的宿主细胞培养物的圆环病毒抗原生产的方法，其中所述圆环病毒抗原的生产与可读框1(ORF1)和可读框2(ORF2)阳性细胞百分比相关，其包括从来自被圆环病毒感染的宿主细胞培养物的、包含非贴壁宿主细胞群和附着至基质的宿主细胞群的样品中分离(i)非贴壁宿主细胞和(ii)脱离基质的贴壁宿主细胞，和测定在所述分离的非贴壁宿主细胞和所述脱离基质的贴壁宿主细胞中存在的(i)可读框1(ORF1)阳性细胞的百分比和(ii)可读框2(ORF2)阳性细胞的百分比。2.—种基于荧光抗体细胞分选(FACS)的用于在线监控来自培养的宿主细胞的圆环病毒生产的方法，其中对存活力、0RF1和0RF2水平中的变化作图确定了宿主细胞培养物中的圆环病毒生产的时间过程，其包括..从来自被圆环病毒感染的宿主细胞培养物的、包含非贴壁宿主细胞群和附着至基质的宿主细胞群的样品中分离(i)非贴壁宿主细胞和(ii)脱离基质的贴壁宿主细胞；测定所述非贴壁宿主细胞和贴壁宿主细胞的存活力；和测定在所述分离的非贴壁宿主细胞和所述脱离基质的贴壁宿主细胞中存在的(i)可读框l(ORFl)阳性细胞百分比和(ii)可读框2(ORF2)阳性细胞百分比。3.根据权利要求2的方法，其中所述细胞存活力通过使用流式细胞法测量碘化丙锭摄取来测定。4.一种用于生产圆环病毒的方法，其包括使用圆环病毒种子培养物接种宿主细胞培养物；在不存在胎牛血清的情况下孵育所述宿主细胞培养物；监控(i)所述宿主细胞存活力，和(ii)所述宿主细胞的0RF1和0RF2表达；和当所述宿主细胞培养物的非贴壁细胞和贴壁细胞中0RF2的表达几乎相同时，从所述宿主细胞培养物中收获所述圆环病毒。5.根据权利要求4的方法，其中所述种子培养物中的圆环病毒产量通过使用基于荧光抗体细胞分选(FACS)的方法监控悬浮宿主细胞中的圆环病毒0RF1和0RF2抗原表达来测定，并且其中当0RF2由非贴壁细胞表达时收获所述种子培养物。6.根据权利要求4的方法，其中所述细胞存活力通过使用流式细胞法测量碘化丙锭摄取来测定。7.根据权利要求4的方法，其中被病毒感染的宿主细胞培养物中的0RF1和0RF2抗原表达使用基于焚光抗体细胞分选(FACS)的方法来监控，并且其中所述圆环病毒抗原的生产与可读框1(0RF1)和可读框2(0RF2)阳性细胞的百分比相关。8.根据权利要求4的方法，其中所述圆环病毒为PCV2。9.根据权利要求4的方法，其中所述宿主细胞为PK-15。全文摘要本发明提供了用于测定被圆环病毒感染的宿主动物宿主细胞培养物的病毒滴度的方法。本发明的基于FACS的方法可以包括测定细胞培养基上清液中的宿主细胞和保持附着至固体支持物的那些细胞的存活力。检测和测量表达病毒抗原ORF1和ORF2的细胞百分比可以确定培养的宿主细胞的病毒载量。病毒产量可以通过检测和测量悬浮细胞中的两种抗原来确定，例如从宿主细胞转移至无血清培养基起5-7天。本发明的方法可以快速地产生定量数据。这允许在整个孵育过程中反复监控病毒生产并为选择最合适收获点作准备。文档编号G01N33/569GK101194165SQ200680020513公开日2008年6月4日申请日期2006年4月13日优先权日2005年4月13日发明者J·雷耶斯,L·P·丘皮尔拉德,P·埃利伯特申请人:梅瑞尔有限公司