专利名称：一种两相整体柱及其制备和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及毛细管整体柱，具体地说是一种应用于微柱液相色谱Oi-LC) 在线多维分离的毛细管整体柱及其制备。
背景技术：
微柱液相色谱(li-LC)是色谱微型化的一个重要方向，指内径为10 pm到 1 mm的色谱柱的液相色谱分析方法。与常规液相色谱法相比具有柱效高、 流动相试样消耗低、柱通透性好、易于实现多级色谱分离及易与质谱联用 而提高分析灵敏度等优点，广泛应用于生物类样品的分离分析，特别适用 是蛋白组学方面的分析(Ivanov， A. R.， ect, Anal. Chem.， 2003, 75， 5306)。
1999年，Yates等人提出了在一根拉伸了喷雾尖端的毛细管中依次填充 两种不同分离机理的颗粒填料，毛细管前端填充反相分离C18硅胶颗粒填 料，而在后端填充强阳离子交换硅胶颗粒填料。该两相毛细管填充柱被应 用于微柱液相色谱在线多维分离与电喷雾质谱的联用，分析对象为酵母蛋 白的胰蛋白酶酶解产物，应用NH4AC溶液从0mM到500mM分15个盐洗 梯度将强阳离子交换填料上的肽段按等电点的升高逐步洗脱到C18填料部 分，每次洗脱后都紧跟着一个反相的梯度分离。该两相填充柱表现出了卓 越的分离性能，具有无样品污染，样品用量少，无样品丢失与稀释，灵敏 度高登诸多优点(Yates, J. R., ect, Nat. Biotechnol.， 1999, 17, 676; Nat. Biotechnol. 2001， 19, 242; Anal. Chem. 2001, 73， 5683)。由于使用的是填充 的毛细管两相柱，如果要提高该柱的分离能力及上样量的话就必须在毛细 管内部填充更大长度的C18反相分离材料和强阳离子交换材料。而填充的 操作压力也随着柱的长度的增加而增大，只有在超高压的液相色谱仪器上 面才能操作更长的两相毛细管整体柱。但是要想在常规的仪器上面实现超 高压分离是十分困难的，而商品化仪器又什么昂贵，这成为制约提高两相 整体柱分离能力的最大限制。
毛细管整体柱被人们广泛的应用于微柱液相色谱的分离中，由于它具有 很高的渗透性，操作压力比填充柱小很多。而且毛细管整体柱还具有多孔 结构，传质速度快，可进行快速分析，具有在酸碱中的稳定性，生物分子 兼容性，易于制作等诸多优点(Zou, H. F., ect, J. Chromatogr. A, 2002, 954)。 吴仁安等人制作了一种强疏水性的毛细管整体柱，应用的功能单体为十二 烷基甲基丙烯酸酯(LMA)，这种整体柱被成功的应用与毛细管电色谱中 分离离子性化合物(Wu,R.A.，ect,Anal. Chem. 2001,73,4918)。董靖等人
制作了一种基于磷酸根的强阳离子交换整体柱。这种整体柱被证明能应用 于多维色谱分离，且与商品化的C18硅胶填料具有很好的正交性(Wang, F.J.,ect,Anal. Chem. 2007, 79， 6599)。迄今为止，还没有人报到过在同一根 毛细管中合成前后两种不同的整体材料。
发明内容
本发明旨在制作一根含有两段不同分离机理材料的毛细管整体柱，而 且在两种材料的中间基本消除死体积，真正实现两种分离介质的"零死体积" 连接。并将这种两相整体柱应用于多维微柱液相色谱分离。本发明的这种 两相毛细管整体柱是国内外首次报道的两相整体柱，它既具有两相填充柱 的特点，可以方便应用于在线多维分离，又具有通透性好，可以在常规液 相色谱中实现长柱分离，大大提高了两相柱的分离能力，并且具有容易制 作，可以在小内径柱中实现等诸多优势。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为
一种两相整体柱，在同一根柱管内存在有不同分离机理的两种固定相， 两相以前后两段的形式存在。
.所述两相整体柱的制备方法，在同一根柱管内制备具有不同分离机理 的两种固定相，分两步制作两相整体柱，先在柱管的一端合成所需长度的 第一种整体材料，然后在柱管剩余部分合成第二种与第一种材料具有不同 分离机理的整体材料。两种整体材料的长度可以根据需要而控制。
如在毛细管一端先合成一段基于磷酸基的强阳离子交换的整体材料， 然后再在另一端合成基于十二烷基链的强疏水性材料，从而制备得到强阳 离子交换(SCX)-反相(RP)两相整体柱。在微柱液相色谱在线多维分离与质谱
联用分析中，这种整体柱被应用于分离复杂的酵母提取全蛋白的胰蛋白酶
酶解液。酶解肽段首先上样到两相整体柱的强阳离子(SCX)材料部分， 当用不同的盐梯度降肽段逐步洗脱到强疏水性(RP)材料部分后，应用反 相梯度分离反相材料上的肽段，从而大大提高了分离鉴定蛋白肽段的能力。 但该两相整体柱的分离作用并不局限于蛋白酶解液，对其它复杂的混合物 同样具有良好的多维分离能力。
整体柱制备前应先对毛细管内壁表面进行接双键活化，然后再分两步 在毛细管中合成具有不同分离机理的两种整体材料。
所述两相毛细管整体柱可应用于微柱液相色谱在线多维分离并与质谱 联用的系统中，可对复杂样品进行分离分析。所述复杂样品为蛋白酶解混 合物；应用时，可进行大规模蛋白鉴定。
本发明具有以下优点
1. 基本消除了同一根整体柱中不同两相之间的死体积，实现了两种 不同分离机理整体柱的"零死体"积连接；
2. 可以直接与质谱相联用，进行在线多维分离质谱鉴定分析；
3. 具有优良的渗透性，可以很容易的增加柱长，从而实现高效分离；
4. 容易制作，可以在小内径的毛细管中实现。
图l为两相整体柱示意图；图中A:毛细管；B:强阳离子交换材料 部分；C:强疏水性材料部分。
图2为两相毛细管整体柱制作过程的工艺框图； 图3为两相毛细管整体柱两相交界处的实物照片；
图4为两相毛细管整体柱应用在微柱液相色谱在线多维分离电喷雾质 谱联用分析中所得到的谱图。
具体实施例方式
由于整体柱中的聚合物材料具有优良的渗透性，申请可以分两步在同一 根柱管中合成具有完全不同分离机理的两种材料。根据两相柱的需要设计 不同两相的长度，然后先合成较短的一相，合成的长度可以由虹吸等方法 控制，然后在第一相合成好后再把第二相的聚合液压入柱管空的部分，制 备第二相。以下实施实例以制备基于磷酸基团的SCX和基于C12基团的两 相柱为例，但本发明并不局限于此，本发明的特征是同一根柱管内制备具 有不同分离机理的两种固定相，两相以前后两段的形式存在。
实施例l
一.两相毛细管整体柱的制备
如图2所示，在100微米内径，75厘米长的毛细管内先后依次合成了10 厘米长的强阳离子交换材料和65厘米长的强疏水性材料。
1. 毛细管预处理
首先用O.l MNaOH溶液冲洗毛细管空柱1 h,再用去离子水冲洗毛细管 至流出液体pH值为7.0,接着用0.1 M HC1溶液冲洗毛细管4 h，再用去离子水 冲洗毛细管至流出液体pH值为7.0,然后用甲醇溶液冲洗毛细管柱IO min,用 氮气吹干。往毛细管中注入甲醇与甲基丙烯酰氧丙基一三甲氧基硅烷的混 合物。在20度至70度温度下反应5—24小时。然后用甲醇及水冲洗。最后用 氮气吹干待用。
2. 强阳离子交换整体材料在毛细管中的合成
合成该材料所采用的原料及配比来自于董靖等人发明的基于磷酸根的 强阳离子交换整体材料(Wang,F. J., ect， Anal. Chem. 2007, 79， 6599)。
(2.1) 以2— (甲基丙烯酰氧)乙基磷酸酯为功能单体，亚甲基双丙烯 酰胺为交联剂，十二醇，二甲基亚砜和N,N-二甲基甲酰胺为致孔剂，单体、 交联剂、致孔剂按质量百分比分别为13%、 10%和77%均匀混合，所加引 发剂的用量为聚合物单体用量的1%，将混合液用超声振荡15min。
(2.2) 将(2.1)中配制的聚合溶液通过虹吸进入毛细管，进入的长度 可以根据该两项整体柱在实际要求中的上样量决定；
(2.3) 将毛细管两端用硅橡胶封口，然后放入6(TC水浴反应12个小时；
(2.4) 取出毛细管，接在高效液相色谱泵上，以甲醇为流动相冲去未 反应完全的聚合单体和制孔剂。冲洗在衡压模式下进行，压力控制在10兆 帕；(2.5)用氮气在2兆帕压力下吹干毛细管及其中的强阳离子交换整体材
料，吹干时间为半小时。
3. 强疏水性整体材料在毛细管中的合成
合成该材料所采用的原料及配比来自于吴仁安等人合成的基于十二烷 基甲基丙烯酸酯(LMA)的强疏水性整体柱材料(Wu， R. A., ect, Anal. Chem. 2001， 73,4918)，并且为了提高其在反相梯度分离中的分离能力，我们对 该配比进行了优化，在制作两相毛细管整体柱中所用的就是优化后的配比。
(3.1) 以十二烷基甲基丙烯酸酯为功能单体，二甲基丙烯酸乙二酯为 交联剂，正丙醇，1， 4-丁二醇为制孔剂，单体、交联剂、致孔剂按体积百 分比分别为24%、 24%和52%均匀混合，所加引发剂的用量为聚合物单体 用量的1%，将混合液用超声振荡15min。
(3.2) 将(3.1)中所配制的聚合液用氮气压入(2.5)中干燥后的毛细 管，聚合液从没有整体材料的一端压入，氮气的压力控制在0.03-0.1兆帕。 在压入聚合液的过程中在显微镜下观察液流的流动，控制液流到达强阳离 子交换材料后再让它进入2-5厘米；
(3.3) 将毛细管两端用硅橡胶封口，然后放入6(TC水浴反应12个小
时；
(3.4) 取出毛细管，接在高效液相色谱泵上，以甲醇为流动相冲去未 反应完全的聚合单体和制孔剂。冲洗在衡压模式下进行，压力控制在20兆 帕；
(3.5) 用氮气在2兆帕压力下吹干两相毛细管整体柱，吹干时间为1小时。
4. 在线电喷雾喷针的拉制
为了实现在线多维分离与电喷雾质谱的联用，最后还需要在两相毛细 管整体柱的强疏水材料端拉出一个电喷雾的喷针。在整体柱上拉电喷雾喷 针的方法为谢传辉等人提出(Xie， C. H.， ect， Mol. Cell. Proteomics, 2006， 5, 454)，即在用水溶液冲过毛细管整体的情况下用丁烷焰将整体柱末端l-2 厘米烧软，然后用一根空的毛细管在火焰烧结下与整体柱联在一起后平稳 拉出，控制拉出尖端内径为5微米左右。至此，两相毛细管整体柱制作完成。 这样所得到的两相毛细管整体柱在两相交界的地方所产生的死体积几乎可 以忽略，如图2所示。
二.两相毛细管整体柱在微柱液相色谱在线多维分离质谱联用分析中 的应用
该两相毛细管整体柱可以应用到在线多维分离复杂样品，在本例中分析 对象为酵母提取蛋白的胰蛋白酶酶解液。 1.样品溶液的制备
1 mg的酵母提取蛋白溶解在lmL， 50 mM的Tris,8 M的尿素溶液中 (pH8.2)，然后用DTT将蛋白中二硫键还原，再加入IAA将游离巯基烷基化，然后将溶液稀释8倍，按照与胰蛋白酶的质量比25:1的比例加入胰蛋白酶进 行酶解反应，反应时间为16h,酶解温度控制在37"C。获得的蛋白酶解溶液 置于-3(TC冰箱中保存备用。 2.在线多维分离
将10 )ig酵母蛋白的酶解产物用560 psi的压力使其通过两相毛细管整体 柱，酶解肽段通过静电相互作用上样到两相毛细管整体柱的强阳离子交换 材料部分。然后将两相毛细管整体柱接入液相色谱-质谱联用系统，流速为 通过分流控制在300纳升每分钟，整个体统操作压力约为900psi。实验中用 到三种流动相，分别为(A) 0.1%甲酸水溶液；(B) 0.1%甲酸乙腈溶液； (C) 1000mMNH4AC溶液，pH用甲酸调节在2-3之间。
由溶液A和B产生分离梯度，0-35%乙腈梯度为92分钟；由溶液A和C产 生盐溶液梯度，将强阳离子交换材料上的肽段分五次冲洗到强疏水性材料 部分，每次冲洗10min,然后用溶液A平衡系统10min，然后开始分离。五个 盐梯度冲洗所用的浓度为1， OmM; 2， 100 mM; 3， 200 mM; 4， 300 mM; 5， 500 mM。所得到的质谱谱图如图3所示。
将所得到的质谱谱图通过数据库检索匹配，得到的结果再用ACn 0.35,Xcorr,1.9, 2.2, 3.75分别对带电荷为+1， +2， +3的肽段进行筛选，然后 得到的结果肽段假阳性率为0.85%。总共鉴定得到780个蛋白，1253个不同 肽段。
权利要求
1. 一种两相整体柱，其特征在于在同一根柱管内存在有不同分离机理的两种固定相，两相以前后两段的形式存在。
2. —种权利要求1所述两相整体柱的制备方法，其特征在于在同一 根柱管内制备具有不同分离机理的两种固定相，分两步制作两相整体柱， 先在柱管的一端合成所需长度的第一种整体材料，然后在柱管剩余部分合 成第二种与第一种材料具有不同分离机理的整体材料。
3. 按照权利要求2所述两相整体柱的制备方法，其特征在于所述第 一种材料为基于磷酸根的强阳离子交换整体材料，第二种整体材料为基于 十二烷基的强疏水性材料。
4. 按照权利要求2所述两相整体柱的制备方法，其特征在于整体柱 制备前应先对毛细管内壁表面进行接双键活化，然后再分两步在毛细管中 合成具有不同分离机理的两种整体材料。
5. —种权利要求l所述两相整体柱的应用，其特征在于所述两相毛 细管整体柱可应用于微柱液相色谱在线多维分离并与质谱联用的系统中， 可对复杂样品进行分离分析。
6. 按照权利要求5所述两相整体柱的应用，其特征在于所述复杂样 品为蛋白酶解混合物；应用时，可进行大规模蛋白鉴定。
全文摘要
本发明涉及毛细管整体柱，具体地说是一种两相整体柱，其特征在于在同一根柱管内存在有不同分离机理的两种固定相，两相以前后两段的形式存在。本发明的主要优点是基本消除了微柱液相色谱分离系统中连接两根不同分离机理的整体柱时产生的死体积，可以进行自动的在线多维分离，具有很强的分离复杂样品如蛋白质酶解物的能力。另外，该整体柱渗透性好，操作压力低，易于在常规液相色谱仪器上操作而得到高效的分离结果。
文档编号G01N30/00GK101413932SQ200710157520
公开日2009年4月22日 申请日期2007年10月17日 优先权日2007年10月17日
发明者叶明亮, 王方军, 靖 董, 邹汉法 申请人:中国科学院大连化学物理研究所