专利名称：用于随后通过基于核酸的传感器检测的衍生分析物方法
技术领域：
本发明涉及衍生分析物的方法，其用于随后通过基于核酸的传感器的检测，以及
本发明涉及基于上述的传感器。
背景技术：
自从上世纪80年代晚期的体外进化原理(通过指数富集的配体系统进化，SELEX) 提出以来，已建立了大量模仿针对数量种类繁多的靶分子的具有高特异性和高亲和力的合 成衍生核酸分子。最近，这类分子(即下文的功能核酸，FNAs)已经在一些领域如环境监测 分析、诊断、药物发现和抗疾病的治疗中备受关注。 —般而言，传感器主要由两个主要单元组成信号接收器单元和信号传导单元。化 学接收器单元包含与样品或者分析物相互作用的合成衍生的材料。检测低限是通过分析物 和接收器材料之间强烈而且直接的化学或者物理相互作用来达到。另一方面，包含生物衍 生材料的生物接收器单元，通过生物接收器和分析物分子之间的特定化学或物理相互作用 而表现出特异性识别。接收器材料和分析物之间的相互作用是通过各种物理或化学参数的 变化来衡量的，并且在传导单元内部进行处理。这种变化会被转化成与分析物分子浓度线 性相关的可测量信号。这可通过多种参数如导电率/电阻率、电容、电流、势能、光吸收和荧 光的变化来实现。 像抗体或者酶一样，在生物传感器应用于靶分子如多肽、蛋白质、DNA、 RNA或者有 机、无机分子方面，FNAs已被用作高特异性生物接收器单元。原则上，由于FNA's不存在对 预想的靶分子有关于结构、大小或状态的限制，我们可以发展针对包括那些抗体都难以获 得的分析物(金属离子、毒素或者挥发性化合物)的FNAs。此外，基于FNA的传感器还能够 应用于蛋白接收器无效的需求(高温、非水相或者复杂环境)。 基于FNA的传感器在过去已经显示出非凡的选择性。举例来说，目前已经发现能 够以10， 000倍选择性识别茶碱和咖啡因的适体，其中茶碱和咖啡因之间仅有的区别就是 两个分子中的一个单亚甲基(US5580737)。模块设计的FNA，其中识别结构域是与信号产生 结构域分开的，为传感器的设计提供了更大的自由度。因此，可通过相同的传感原理(电 的、光的、热量测定的或者重量测定的)检测许多靶分子。基于FNA的生物传感器接收器单 元的从头体外设计使得它们在复杂环境中高度特异性的确定和检测物质成分中非常有用。
除它们显著的优势之外，FNAs作为一种天然的材料也表现出一些较大的缺陷。它 们通常在生理环境中受到不可忽视的降解，上述降解可被加帽或者搀入非天然核苷酸例如 spiegelmere、氟化核糖残基和硫代磷酸(phosphorthioate)抑制，这使得它们能够更好的 对抗水解或酶解反应，并在体内和体外传感器应用方面具有潜在的更好的用途。
—般而言，在生物样品的痕量分析方面，信号放大步骤对于提高灵敏度是必须的。 就FNAs作为识别元件来说，DNA核酶已被证明能够显示出多重转化活性，而且还能放大读 出的信号。在通过分析物激活后，它能够持续激活之前处于非活化状态的报告分子(例如 形成茎-环的DNA)。
由于每个分析物分子可产生很多报告分子，这导致了显著的信号增强。
通过将这些FNA的特性与使用FNAs作为识别元件的传导原理(电的、光的、热量 测定的或者重量测定的)相结合，多肽、蛋白质、DNA、 RNA或有机和无机分子可从复杂环境 中以高特异性和灵敏度被检测出。 许多的缺陷和不足限制了 FNAs在复杂环境中对小的、带电的或者非极性有机或 无机分子进行传感应用和痕量分析中作为识别元件的使用 FNAs的目标评估通常是通过SELEX过程进行的，在该过程中特定的目标分子被 固定在固相上，并且使用包含大约1014的随机突变分子复杂性的文库来选择特异性的接收 器和目标之间的相互作用。然而，对于目标分子的识别效果会由于目标分析物的分子量和 化学性质而受到严重影响，使得几乎不可能得到针对小的有机或无机化合物的高特异性的 FNAs。 另一个限制是基于FNA在生理条件下可被快速降解的事实。当操作是在RNA/DNA 能够被水解或者受到酶解的条件下中进行时，这种降解限制了 FNAs作为识别单元在生物 传感器中的使用操作时间。为了克服上述缺陷，通常使用非天然核苷酸，例如spiegelmere、 氟化核糖残基和硫代磷酸，这意味着复杂而昂贵的合成方法的使用，而且结果并不满足对 选择性和灵敏性传感器应用所必要的需求。 现有技术中，DNA核酶放大的分子信标信号的读出是通过荧光报告分子实现的。这 需要复杂的照明、光学和检测系统，因而这些系统无法容易地被植入到小型设备中。
发明内容
因此，本发明的一个目的就是提供一种增加基于核酸的传感器灵敏度的改进的方 法，特别是用于小分析物的传感器。 所有这些目标都是通过衍生分析物的方法来实验的，所述方法是为随后对所述分 析物进行检测而进行的，所述检测是通过基于核酸对所述衍生分析物的特异性识别的传感 器进行的，所述方法包括-以任何顺序提供，具有第一官能团的分析物，以及具有第二官能团的衍生试剂， 其中所述第一和第二官能团能够相互反应以在所述分析物和衍生试剂之间形成键，所述的 衍生试剂进一步具有允许在所述衍生试剂和所述核酸之间进行碱基堆积或形成氢键的取 代基，-使所述衍生试剂和所述分析物进行反应以形成衍生分析物。 在一个实施方案中，所述分析物是分子量在l-500Da范围内，优选在10_300Da范
围内，更优选在50-250Da范围内的分子。 在一个实施方案中，所述第一官能团选自苯基、醇、酮、醛、羧酸、羧酸酯、醚、环氧 化物、硫醇、胺、酰胺和卤化物。 在一个实施方案中，所述第二官能团选自醛、异硫氰酸酯、活化酯、马来酰亚胺、碘 乙酰胺、苯汞基团、三嗪、肼、羟胺和二醛。 在一个实施方案中，所述取代基团选自吡啶，嘌呤，芳香胺，酰胺，羧酸，含有酪氨 酸、色氨酸和/或苯丙氨酸的多肽。 在一个实施方案中，所述的衍生分析物的分子量在50-10， OOODa范围内，优选在100-5000Da范围内，更优选在250-2000Da范围内。 在一个实施方案中，本发明的方法进一步包括通过传感器检测所述衍生分析物的 步骤，其中所述传感器基于核酸对所述衍生分析物的特异性识别。 在一个实施方案中，本发明的方法进一步包括在检测前对所述衍生分析物进行排 阻过程，从而将分子量> 10，000Da的分子从所述衍生分析物中分离的步骤，优选利用半透 膜，其中所述半透膜仅允许分子量< 10，000Da的分子从所述膜的第一侧穿过到与所述第 一侧相对的所述膜的第二侧。 本发明的目标也可以通过检测分析物的传感器来实现，分析物优选为根据权利要 求1-8中任一项所述的方法制备的衍生分析物，所述传感器是基于核酸对所述分析物的特 异性识别，所述传感器包含检测室包括，该检测室包括 a)第一核酸，其能够特异性识别并结合分析物，例如衍生分析物，所述的第一核酸 包括-可激活的酶结构域，所述酶结构域处于非活化状态，具有位点特异性的核酸切割 活性，-能特异性识别并结合分析物的分析物结合结构域-连接所述可激活的酶结构域和所述分析物结合结构域的通信结构域，其中所述 可激活的酶结构域在所述分析物结合到所述分析物结合结构域上时被由非活化状态激活 为活化状态。 b) —套可连接到电源上的至少第一和第二电极， c)第二核酸，其具有部分双链结构而且包括能够结合所述第二核酸的嵌入性、氧
化还原活性的化合物，所述化合物或者是在其非结合状态下电化学可检测并且在结合状态
下电化学无法检测，或者所述化合物是在结合状态下电化学可检测并且在非结合状态下电
化学无法检测，其中所述第二核酸进一步包括能够被所述处于活化状态的第一核酸的所述
酶结构域识别的切割位点，其中在所述的切割位点被切割之后，所述嵌入性氧化还原活性
化合物在结合在所述第二核酸上时，会从所述的第二核酸上被释放出来。 在一个实施方案中，所述第一核酸是DNA核酶，优选选自8-17DNA核酶和10-23DNA
核酶。如本文中所使用的，术语"DNA核酶(DNAzyme)"意指具有催化活性的DNA，该术语
在使用中与"酶性DNA(DNA ezyme)"同义。关于这类DNA核酶(酶性DNA)的综述可在
例如S. W. Santoro， G.F.Joyce, Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 94 (1997) ， 4262中找到。术语
"8-17DNA核酶"和"10-23DNA核酶"，如本文中所使用的，指前述文献中所描述的DNA核酶。
这些术语因此也都是本领域技术人员所熟知的。 在一个实施方案中，所述的第二核酸是形成茎_环的DNA探针，优选选自具有21 个核苷酸的序列并且形成茎_环结构的核酸，例如CCTGAGAGAGrArUGGGTGCAGG其中的切割 位点以粗体强调(r代表核苷酸的来源，这里是指RNA)。 在一个实施方案中，所述嵌入性氧化还原活性的化合物选自亚甲基蓝，菁蓝衍生 物，吖啶衍生物，溴化乙啶，碘化丙啶，羟基脒衍生物，蒽醌衍生物，双苯甲亚胺衍生物比如 Hoechst 34580， 33258， 33342， 二茂铁基萘二酰亚胺，柔红霉素，蒽醌二磺酸，Co (bpy) 33+和 Co (phen)^+，其中bpy是联吡啶，以及其中phen是1， 10-邻菲咯啉。
在一个实施方案中，所述的传感器具有下列结构之一
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a)所述第一核酸结合到至少一个所述电极的表面，所述第二核酸处于覆盖、接触 或者环绕所述表面的溶液中，其中，将被认为包含分析物的样品加入到所述溶液中，用于检 b)所述第二核酸结合到至少一个所述电极的表面，所述第一核酸处于覆盖、接触 或者环绕所述表面的溶液中，其中，将被认为包含分析物的样品加入到所述溶液中，用于检 c)所述第一和第二核酸都处于覆盖、接触或者环绕至少一个所述电极表面的溶液
中，其中，将被认为包含分析物的样品加入到所述溶液中，用于检测，或者 d)所述第一和第二核酸都结合到至少一个所述电极的表面，其中，加入被认为包
含分析物的样品以使其与所述表面接触，用于检测。 在一个实施方案中，本发明的传感器还包括一个位于所述检测室上游的分离室， 所述分离室通过半透膜与所述的检测室分开，所述半透膜仅允许分子量< 10，000Da的分 子从所述分离室通过，进入所述的检测室，所述半透膜是聚合物膜，优选由纤维素、甲基纤 维素、右旋糖苷，特别是交联的右旋糖苷、赛璐玢、聚四氟乙烯、聚酰胺、聚醚砜、聚丙烯或沸 石、氧化铝中的一种或其组合制成的膜。 本发明的另一个目标也是通过检测样品中的分析物的方法来实现的，所述方法包 含以下步骤-以任何顺序提供根据本发明的传感器，以及含有分析物的样品，特别是本发明所 述的衍生的分析物-将所述传感器暴露于所述样品，并且-测量电化学响应，其中所述电化学响应的存在和强度指示所述样品中所述分析 物的存在和含量。 本发明的另一个目标是通过将本发明所述的衍生方法，或本发明所述的检测方 法，或者本发明所述的传感器用于医药和/或医疗诊断，食品质量检测，农业检测，爆炸物、 毒素或有害化学物质安全检测，职业或环境监测来实现的。 如本文中所使用的，术语"基于核酸对所述分析物特异性识别的传感器"在这里有 时候也是指"基于功能性核酸的传感器"或者"基于FNA的传感器"。 本发明所述的分析物优选"小分子"。这里使用的术语"小分子"是指分子量优选 在l-500Da范围内的，更加优选在10-300Da范围内，最优选在50-250Da范围内的分子。
—旦分析物依据本发明所述被衍生，它的分子量优选在50-10， 000Da范围内，更 优选在100-5000Da范围内，最优选在250-2000Da范围内。尽管这样的衍生过程在抗体制备 方面是已知的，就发明人所知，这样的衍生还没有被用于提高基于核酸的传感器的灵敏度。
在本发明所述的传感器的一个实施方案中，第一核酸能够特异性识别并结合分析 物并且包含分析物可激活的酶结构域，能够特异性识别并结合分析物的分析物结合域，以 及连接所述可激活的酶结构域和所述分析物结合结构域的通信结构域。而且，传感器包含 具有部分双链结构的第二核酸，以及包含与所述第二核酸结合的嵌入性氧化还原活性的化 合物。这类第二核酸优选是形成茎-环的DNA。这里使用的术语"形成茎-环的DNA"是指 能够报告溶液中特定核酸的存在或其活性的核酸，并且它在给定条件下能够形成茎_环结 构。根据本发明，形成茎_环的DNA包含嵌入性、氧化还原活性的化合物和被分析物激活的
7第一核酸的酶结构域特异性识别的切割位点。在切割了切割位点之后，嵌入性、氧化还原活 性的化合物就结合到形成茎_环的DNA上，或者更普遍的是第二核酸释放到溶液中，变成电 化学可检测的，或者失去其可检测性，这取决于设置(参见图4-6)。 第一核酸优选的实例是DNA核酶，更优选的是以下序列5' -GCGTCCTTCAGAGAGAGT GGGTGCTTTTGCACCCAGGCTAGCTACAACGACTCTCTC-3'，其中粗体字母代表了酶活性结构域。
本发明所述第二核酸的优选实例是形成茎_环的DNAs，或者形成 茎-环的DNA探针，其选自具有21个核苷酸并且形成茎-环结构的的序列，例如 CCTGAGAGAGrArUGGGTGCAGG-3'，其中的切割位点以粗体强调(r代表核苷酸的来源，这里指 RNA ;参见例如Tian Y. ， Mao C. ， Talanta 67 (2005) ， 532)。 —般本发明所述的基于FNA的接收器单元可以包括天然或者合成材料，具体如 下 含有天然或非天然核苷的RNA/DNA，适体，核酶，适体酶，DNA核酶，PNA (肽核酸)
本发明还公开了通过衍生试剂将小分子转化成在FNA识别通路中更易感知的分 子的技术方案。其可允许使用带有FNA单元作为中心识别元件的传感器对于多种来源例如 固体、液体、气体和它们的混合物产生或者发出的小分子进行检测。特异性反应可在分析物 分子和衍生试剂之间直接产生，或者也可通过第三类有机/无机分子，多肽、酶、DNA/RNA催 化产生。所述衍生方法也可将目标分子从其自然状态和环境(固体、液体、气体)转化成传 感材料本身(主要是液相)。(参见图1，图示1) 然而，FNA接收器必须特异性地只和衍生分析物反应。它们不能显示对于非衍生 分析物或者衍生分子本身任何或者至少显著降低的敏感性。 令人惊异的是，由于增强的化学和物理作用力，随着衍生后的分子之间的相似性 显著增加，FNAs识别的特异性也显著增加了。而这与传统检测方法中分子之间的相似度实 际上降低识别的特异性相矛盾。
另外，参考附图，其中 图1显示通过核酸(图示1)被衍生试剂("分子辅因子")所衍生的小分子分析 物("小靶标")的特异识别，衍生反应的实施方案(图示2)，以及本发明所述的分子大小 排阻过程(图示3所示的实施方案)； 图2显示本发明所述的第一核酸的实施方案；图2中的"配体"可以是例如按照本 发明所述方法产生的衍生后的分析物； 图3显示使用本发明所述第一和第二核酸的检测反应；第一核酸是在结合到分析 物例如衍生分析物之后，会被激活的DNA核酶；第二核酸是包含氧化还原活性嵌入剂的形 成茎_环的DNA。第二核酸被活化的第一核酸切割，并释放出嵌入剂。 图4-6显示本发明所述的各种结构的传感器的实施方案，其中形成茎_环的DNA 带有嵌入剂并且电极表面既可以具有互相排斥的相互作用也可以具有互相吸引的相互作 用。 另外参考以下实施例，所述实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。
具体实施方式
实施例 a)本发明所述的分析物/小分子是具有低分子量(优选在l-500Da范围内，更加 优选在10-300Da范围内，最优选在50-250Da范围内)的分子且具有以下分类的第一官能
团 脂肪族或者芳族伯胺、仲胺、单胺、二胺、三胺
脂肪族或者芳族单硫醇、二硫醇、三硫醇
脂肪族或者芳族单醇、二醇、三醇
脂肪族或者芳族单酮、二酮、三酮
脂肪族或者芳族单醛、二醛、三醛
脂肪族或者芳族单羧酸、二羧酸、三羧酸
脂肪族或者芳族单羧酸酯、二羧酸酯、三羧酸酯
脂肪族或者芳族单醚、二醚、三醚 脂肪族或者芳族单环氧化物、二环氧化物、三环氧化物 脂肪族或者芳族单卤化物、二卤化物、三卤化物 以及它们的混合物。 衍生试剂可以例如是 取代的醛，异硫氰酸，活化酯 取代的马来酰亚胺，碘乙酰胺，苯基汞化合物 二氯三嗪，肼，羟胺 正二醛 分析物分子衍生反应的典型实例是伯胺和芳香醛之间形成席夫氏碱 (schiffsbase)的反应(参见图1，图示2) 衍生试剂的取代基结构允许其与FNA分子之间发生特异性反应以最大化信号的 传导。这可以通过碱基堆积或氢键形成来实现。
取代基可以例如是 单环或多环芳族化合物和诸如吡啶、嘌呤、嘧啶、苯基呋喃、苯并咪唑、吲哚、苯并
噁唑、喷唑及它们的衍生物的芳香杂环化合物， 芳香胺，酰胺羧酸，禾口 含有酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸的小肽 进一步来说，根据本发明，那些能够快速降解DNA/RNA的酶(DNase， RNase)被排 除在识别单元和分析物分子相互作用的区域之外。例如RNase的分子量在40-80kDa，而指 定的分析物分子量不大于50-10， OOODa。目前已有很多技术可以用于分离包含大分子分散 物的分子混合物，例如薄层多孔聚合物膜(乙基纤维素)已广泛应用于从蛋白质溶液中除 去小分子的蛋白质纯化。与FNA相连的上游包括接收器单元，这些膜必须具有从有酶活性 的分子中分离出分析物，并且阻止基于传感器分子的FNA快速降解的能力(参见图l，图示 3)。 聚合物可以例如由下列材料之一制成
-纤维素，甲基纤维素
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-交联右旋糖苷
-赛璐玢
-聚四氟乙烯
-聚酰胺
_聚醚砜
_聚丙烯
-沸石
-氧化铝， 此外，本发明使用电化学信号读出的方式来克服荧光检测所必需的复杂系统设置 问题。基于这个原因，带有嵌入性氧化还原活性的化合物，并且具有DNA核酶介导的酶切所 针对的特定限制性酶切位点的形成茎-环的DNA与带有负电荷的电极共同使用。在未被切 割的状态下，带有负电荷并且载有氧化还原活性化合物的形成茎-环的DNA受到电极带有 负电荷的表面的排斥，因而无法检测到信号。分析物激活的DNA核酶的切割作用会释放出 具有氧化还原活性嵌入剂，并在电极表面发生氧化还原反应，所述氧化还原反应将产生可 读出的信号(参见图3，图示5)。由于DNA核酶具有多重转化活性，许多带有嵌入剂的形成 茎-环的DNAs可以被由单个分析物激活的DNA核酶切割(参见图2，图示4)。这通过放大
作用显著增加了读出信号，并最终提高了传感器的灵敏度。
可用的DNA核酶的实例有8-17DNA核酶10-23DNA核酶嵌入性氧化还原活性的化合物的实例有亚甲基蓝菁蓝衍生物吖啶衍生物溴化乙啶碘化丙啶羟基脒衍生物蒽醌衍生物双苯甲亚胺衍生物比如Hoechst 34580,33258,33342，二茂铁基萘二酰亚胺，柔红霉素蒽醌二磺酸Co (bpy) 33+Co (phen) 33+可用的电极材料的实例有金属氧化物(Zn0，Sn02，Ti02…)，金属(Au， Ag， Pt， Pd...)，导电性聚合物(碳糊，
聚苯胺，多吡咯，聚噻吩)
根据本发明所述的可能的传感器结构实施例的实例有
:0119] 出于信号传导的目的，传感器元件有4种可能的结构(参见图4-6，图示6)。其中的两个具有"信号打开"构造，另两个具有"信号关闭"构造。 -FNA结合在电极表面。衍生分析物和载有氧化还原活性嵌入剂的形成茎_环的 DNA都在溶液中。由于电极和茎_环结构DNA之间的空间位阻或电学阻碍，来自嵌入剂的信 号受到抑制。在FNA激活后，具有氧化还原活性嵌入剂就会被释放出来，而且由于嵌入剂分 子通过化学或物理吸附作用吸附到电极上，使得信号的增强可被检测(信号打开)(1)(图 5)。-载有氧化还原活性嵌入剂的形成茎_环的DNA结合在电极表面(通过化学或物 理吸附)。衍生分析物和FNA都在溶液中，在FNA被激活后，具有氧化还原活性嵌入剂就会 被释放出来，信号的减弱在电极上可被检测(信号关闭)(2)(图5)。 -FNA，衍生分析物和载有氧化还原活性嵌入剂的形成茎_环的DNA都处于溶液中。
由于电极和形成茎-环的DNA之间的空间位阻或电学阻碍，来自嵌入剂的信号受到抑制。在
FNA被激活后，具有氧化还原活性嵌入剂就会被释放出来，而且由于嵌入剂分子通过化学或
物理吸附作用吸附到电极上，使得信号的增强可被检测(信号打开)(3)(图6)。 -FNA和载有氧化还原活性嵌入剂的形成茎-环的DNA都通过化学或物理吸附作用
吸附到电极上。在FNA被激活后，具有氧化还原活性嵌入剂就会被释放出来，信号的减弱在
电极上可被检测(信号关闭)(4)(图6)。 本发明所述的方法和传感器对于使小分子可用基于核酸的传感器进行检测提供 了一种独特的方法学。其也为利用基于核酸的传感器以高度特异性和选择性在复杂环境中 (气相，液相)追踪小分子提供了可能。另外，本发明允许设计可适用于许多分析物的传感 器策略。其通过包含分子大小排阻步骤进一步抑制核酸降解。本发明所述信号的增强通过 使用特定的衍生技术和使用形成茎-环的DNA样的第二核酸的放大手段以及随后的电化学 检测来实现。 本发明的说明书、权利要求书和/或随后的附图中公开的技术特征，既可以分开， 也可以以任意方式组合，用作以多种方式实现本发明的材料。序列表〈110〉索尼公司〈120〉用于随后通过基于核酸的传感器检测的分析物衍生方法〈130>FB20740〈160>2〈170>PatentIn version 3.3〈210>1〈211>57〈212>DNA〈213〉Artificial〈220〉〈223>DNA核酶〈400>1gcgtccttca gagagagtgg gtgcttttgc acccaggcta gctacaacga ctctctc 57〈210>2
〈211>21〈212>DNA〈213〉人工〈220〉<223>形成茎-环的DNA〈220〉〈221〉misc feature〈222>(11). (12)〈223>RNA残基〈400>2CCtgElg卿g augggtgc3g g
权利要求
衍生分析物用于随后通过传感器对所述分析物进行检测的方法，所述传感器基于核酸对所述衍生分析物的特异性识别，所述方法包括-以任何顺序提供，具有第一官能团的分析物，以及具有第二官能团的衍生试剂，其中所述第一和第二官能团能够相互反应以在所述分析物和衍生试剂之间形成键，所述衍生试剂进一步具有允许在所述衍生试剂和所述核酸之间进行碱基堆积或形成氢键的取代基，-使所述衍生试剂和所述分析物进行反应以生成衍生分析物。
2. 根据权利要求1所述的方法，其中所述分析物是分子量在l-500Da范围内，优选在 10-300Da范围内，更加优选在50-250Da范围内的分子。
3. 根据权利要求1-2中任一项所述方法，其中所述第一官能团选自苯基、醇、酮、醛、羧 酸、羧酸酯、醚、环氧化物、硫醇、胺、酰胺和卤化物。
4. 根据权利要求1-3中任一项所述方法，其中所述第二官能团选自醛、异硫氰酸酯、活 化酯、马来酰亚胺、碘乙酰胺、苯汞基团、三嗪、肼、羟胺和二醛。
5. 根据权利要求1-4中任一项所述方法，其中所述取代基选自吡啶，嘌呤，芳香胺，酰 胺，羧酸，含有色氨酸、酪氨酸和/或苯丙氨酸的多肽。
6. 根据前述任一项权利要求所述的方法，其中所述衍生分析物的分子量在 50-10， 000Da范围内，优选在100-5000Da范围内，更加优选在250-2000Da范围内。
7. 根据前述任一项权利要求所述的方法，其进一步包括通过传感器检测所述衍生分析 物的步骤，其中所述传感器基于核酸对所述衍生分析物的特异性识别。
8. 根据前述任一项权利要求所述的方法，其进一步包括在检测前对所述衍生分析物进 行排阻过程，从而将分子量> 10，000Da的分子从所述衍生分析物中分离的步骤，优选利用 半透膜，其中所述半透膜仅允许分子量< 10，000Da的分子从所述膜的第一侧穿过到与所 述第一侧相对的所述膜的第二侧。
9. 用于检测分析物的传感器，所述分析物优选为根据权利要求1-8中任一项所述的方 法制备的衍生分析物，所述传感器是基于核酸对所述分析物的特异性识别，所述传感器包 含检测室，该检测室包括a) 第一核酸，其能够特异性识别并结合分析物，例如衍生分析物，所述第一核酸包括 -可激活的酶结构域，所述酶结构域处于活化状态，具有对核酸的位点特异性切割活性，_能够特异性识别并结合分析物的分析物结合结构域，-连接所述可激活的酶结构域和所述分析物结合结构域的通信结构域，其中所述可激 活的酶结构域在所述分析物结合到所述分析物结合结构域上后，被由非活化状态激活为活 化状态，b) —套可连接到电源上的至少第一和第二电极，c) 第二核酸，其具有部分双链结构而且包括能够结合所述第二核酸的嵌入性氧化还原 活性的化合物，所述化合物或者在其非结合状态下电化学可检测并且在结合状态下电化学 无法检测，或者所述化合物在结合状态下电化学可检测并且在非结合状态下电化学无法检 测，其中所述第二核酸进一步包括能够被所述处于活化状态的第一核苷酸的所述酶结构域 识别的切割位点，其中在所述切割位点被切割之后，所述嵌入性氧化还原活性化合物在结 合在所述第二核酸上时，会从所述第二核酸上释放出来。
10. 根据权利要求9所述的传感器，其中所述第一核酸是DNA核酶，优选选自8-17DNA核酶和10-23DNA核酶。
11. 根据权利要求9-10中任一项所述的传感器，其中所述第二核酸是形成茎-环的DNA探针，优选选自具有21个核苷酸并且形成茎环结构的核酸，例如CCTGAGAGAGrArUGGGTGCAGG 。
12. 根据权利要求9-11中任一项所述的传感器，其中所述嵌入性氧化还原活性的化合 物选自亚甲蓝，菁蓝衍生物，吖啶衍生物，溴化乙啶，碘化丙啶，羟基脒衍生物，蒽醌衍生物，双苯甲亚胺衍生物比如Hoechst 34580， 33258， 33342， 二茂铁基萘二酰亚胺，柔红霉素，蒽醌二磺酸，Co (bpy) 33+和Co (phen) 33+，其中bpy是联吡啶，以及其中phen是1， 10-邻菲咯啉。
13. 根据权利要求9-12中任一项所述的传感器，其中所述传感器具有下列之一的结构a) 所述第一核酸结合到至少一个所述电极的表面，所述第二核酸处于覆盖、接触或者环绕所述表面的溶液中，其中，将被认为包含分析物的样品加入到所述溶液中，用于检测；b) 所述第二核酸结合到至少一个所述电极的表面，所述第一核酸处于覆盖、接触或者环绕所述表面的溶液中，其中，将被认为包含分析物的样品加入到所述溶液中，用于检测；c) 所述第一和第二核酸都处于覆盖、接触或者环绕至少一个所述电极表面的溶液中，其中，将被认为包含分析物的样品加入到所述溶液中，用于检测；或者d) 所述第一和第二核酸都结合到至少一个所述电极的表面，其中，加入被认为包含分析物的样品以使其与所述表面接触，用于检测。
14. 根据权利要求9-13中任一项所述的传感器，其进一步包括位于所述检测室上游的分离室，所述分离室通过半透膜与所述检测室分开，所述半透膜仅允许分子量< 10， 000Da的分子从所述分离室通过，进入所述检测室，所述半透膜是聚合物膜，优选由纤维素、甲基纤维素、右旋糖苷，特别是交联右旋糖苷、赛璐玢、聚四氟乙烯、聚酰胺、聚醚砜、聚丙烯或沸石、氧化铝中的一种或其组合制成的膜。
15. 检测样品中的分析物的方法，其包括以下步骤_以任何顺序提供根据权利要求9-14中任一项所述的传感器，以及含有分析物的样品，特别是根据权利要求1-8中任一项的衍生分析物，_将所述传感器暴露于所述样品，并且-测量电化学响应，-其中所述电化学响应的存在和强度指示所述样品中所述分析物的存在和含量。
16. 权利要求9-14中任一项所述的传感器或者权利要求1-8或14中任一项所述的方 法在医药和/或医疗诊断，食品质量检测，农业检测，爆炸物、毒素或有害化学物质安全检测，职业或环境监测中的应用。
全文摘要
用于随后通过基于核酸的传感器检测的衍生分析物方法。本发明涉及衍生分析物的方法，其用于随后通过基于核酸的传感器的检测，以及本发明涉及基于上述的传感器。
文档编号G01N27/00GK101724695SQ200910211650
公开日2010年6月9日 申请日期2009年9月30日 优先权日2008年10月6日
发明者G·内尔斯, I·霍斯帕克, J·厄尔默, M·休尔科 申请人:索尼株式会社