专利名称：一种抗甲型流感病毒核蛋白单克隆抗体及其制备与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及流感免疫检测领域，特别是涉及一种抗甲型流感病毒核蛋白单克隆抗体及其制备与应用。
背景技术：
流感病毒属正粘病毒科，系RNA病毒。病毒内部的核心由单链核糖核酸及核蛋白(NP)组成，根据核蛋白的抗原性不同可分为A (甲)、B (乙)、C (丙)三型，每型又可区分为不同亚型。甲型变异较快，每2-3年可发生一次，乙型变异较慢。当抗原发生较大的变异时，与前次流行株完全不同，是抗原的质变，称为抗原株变，此时产生了新的亚型。由于人群对新的亚型缺乏抗体，因此常可引起大的流行。引起流行性感冒(简称流感)的主要病毒是甲、乙型流感病毒，通常只有甲型和乙 型流感病毒会引起大流行或局部的暴发流行。传统病毒分离培养和红细胞凝集抑制试验(HI)鉴定方法特异性和敏感性强，但病毒分离培养耗费时间较长，需要有流感病毒型特异性抗血清，对于人群聚集性流感暴发提供病原体诊断依据相对较慢。多重逆转录聚合酶链反应(mRT-PCR)检测耗时4小时，灵敏度也可以，但是需要专用设备，使用不方便，投入也比较大。胶体金法出结果快速，只需20min，操作简便，适于现场检测。病毒的核蛋白(NP)是保守的结构蛋白，在病毒进化过程中变异率很低。同样，对流感病毒NP的研究也已经证明了其结构的保守性。目前多种RNA病毒(如新城疫病毒，狂犬病毒，水疱性口炎病毒，麻疹病毒等)的核蛋白都已作为抗原用于ELISA诊断试剂盒中。单克隆抗体可用于分析抗原的细微结构及检验抗原抗体未知的结构关系生产出针对复杂生物混合物中的特定分子的抗体，可用于分离、分析及纯化该特定分子抗原；其试剂可用于临床诊断和治疗。甲型流感病毒NP结构高度保守，且具有很强的免疫原性，能诱导产生抗体。这一特性也被用来研制甲型流感病毒NP单克隆抗体进行诊断。因此可以使用抗NP的抗体来检测所有亚型的流感病毒。但是NP并非完全保守，因此要保证所制备的单抗是针对其保守性抗原位点的。目前在流感的快速检测领域，目前没有很好的国产试剂盒，而国外试剂盒价格又比较昂贵，所以研究开发适合于快速检测用的抗体具有重要意义。
发明内容
本发明的一个目的是得到一种特异性强的抗甲型流感病毒核蛋白单克隆抗体。本发明的另一个目的是提供一种特异性高、灵敏度高的甲型流感病毒检测试剂盒。为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案本发明公开了一种分泌抗甲型流感病毒核蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株H1N1-2F10，该细胞株已于2011年4月17日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为 CCTCC C201119。
本发明公开了一种由上述保藏号为CCTCC C201119的杂交瘤细胞株分泌的抗甲型流感核蛋白单克隆抗体。本发明同时公开了保藏号为CCTCC C201119的杂交瘤细胞株在制备甲型流感检测试剂或设备中的应用。本发明还公开了上述抗甲型流感核蛋白单克隆抗体在制备甲型流感检测试剂或设备中的应用。本发明提供了一种甲型流感病毒快速检测试纸，包含上述由保藏号为CCTCCC201119的杂交瘤细胞株产生的抗甲型流感病毒核蛋白单克隆抗体。所述甲型流感病毒快速检测试纸，进一步包含上述由保藏号为CCTCCC201119的杂交瘤细胞株产生的抗甲型流感病毒核蛋白单克隆抗体包附胶体金。本发明还提供了一种根据上述甲型流感病毒快速检测试纸组装成的甲型流感病 毒检测试剂盒。本发明同时还提供了上述试剂盒在甲型流感检测中的应用。由于采用以上技术方案，本发明的有益效果在于I、本发明得到的杂交瘤细胞株分泌产量高，其分泌得到的抗甲型流感病毒核蛋白单克隆抗体具有高亲和力、高特异性等优点。2、本发明提供的甲型流感病毒检测试剂盒与现有的流感检测试剂盒相比，在特异性、灵敏度、检出率方面都更具优势。保藏信息培养物名称杂交瘤细胞H1N1-2F10保藏日期2011年4月17日保藏单位湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心，即中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏编号CCTCCNo C201119
具体实施例方式本发明采用重组甲型流感核蛋白抗原作为免疫原，制备得到杂交瘤细胞系H1N1-2F10。该杂交瘤细胞能高表达的分泌出具有高抗原亲和力、高特异性的抗甲型流感病毒核蛋白单克隆抗体。本发明利用上述杂交瘤细胞系H1N1-2F10制备得到的抗甲型流感病毒核蛋白单克隆抗体，结合抗甲型流感病毒核蛋白兔多克隆抗体构建了一种用于快速检测甲型流感病毒抗原的试剂盒。检测试纸是本发明的试剂盒的核心，它由吸收垫、硝酸纤维素膜、金标垫、样品垫依次粘附在不吸水的支撑薄片上组装而成的。金标垫上涂覆有胶体金标记的本发明制备的单克隆抗体；硝酸纤维素膜上包被有检测线和质控线，其中检测线为亲和纯化的抗甲型流感病毒核蛋白兔多抗，质控线为羊抗鼠IgG抗体。样品稀释为8%盐水。所述硝酸纤维素膜、吸收垫、金标垫、样品垫、不吸水的支撑片均购自Millipore公司。所述亲和层析柱购自 Amersham Biosciences 公司。该试剂盒利用双抗体夹心法来检测被检材料中是否含有甲型流感病毒NP蛋白。检测时，样品中所有的NP蛋白分子先和金标记抗甲型流感病毒NP蛋白单克隆抗体结合，由于毛细管作用，反应复合物沿包被膜向前泳动，若样品中有甲型流感病毒核蛋白，到达检测线时，遇到包被在硝酸纤维素膜上的抗甲型流感病毒NP蛋白的兔多抗，就会形成兔多抗-NP蛋白-金标记单克隆抗体复合物，从而富集在检测线上，形成红色沉淀线；未结合NP蛋白的金标记单克隆抗体则通过检测线，被羊抗鼠IgG抗体捕获，富集在质控线上，形成红色沉淀线。当检测线与质控线上同时有红色沉淀线时判为阳性结果。若样品中不含有甲型流感病毒NP蛋白，反应复合物到达检测线时，遇到捕获多抗就不会形成兔多抗-NP蛋白-金标记单克隆抗体复合物，反应复合物通过检测线，仅富集在质控线上形成红色沉淀线，此时判为阴性结果。本发明所述的单克隆抗体除了应用于上述胶体金检测试剂盒外，还可以用于其他甲型流感检测试剂盒或设备中。本领域技术人员可以理解，将本发明所述的单克隆抗体直接或间接结合其他信号基团(如磁性微球、辣根过氧化酶等)，或将本发明所述的单克隆抗体作为包被抗体(例如ELISA)，则可用于其他形式的甲型流感检测试剂或设备。故本发明所制备得到的杂交瘤细胞及其分泌的抗体可广泛适用于制备甲型流感检测试剂或设备。下面通过具体实施例并结合附图
对本发明作进一步详细说明。以下实施例仅仅对本发明进行进一步的说明，不应理解为对本发明的限制。·实施例I杂交瘤细胞株的建立与抗甲型流感病毒核蛋白单克隆抗体的制备I.抗原免疫将重组甲型流感核蛋白抗原(深圳市菲鹏生物股份有限公司生产，货号BA-IAV0004)等量与弗氏完全佐剂混合，得到油状乳液。将该乳液以0.2毫升的剂量皮下施给BALB/c小鼠(广州省实验动物中心，6周龄雌性，5只)背部位点，第一次免疫14天后腹腔增强免疫(等量抗原与弗氏不完全佐剂混合)，增强免疫到四针后，采尾血进行效价检测，效价达到融合要求。融合前3天，用相同剂量抗原腹腔注射追加免疫。2.杂交瘤细胞系的制备(I)饲养细胞的制备以BALB/c鼠腹腔巨噬细胞作饲养细胞。在融合前I天，BALB/c鼠拉颈处死，75%酒精全身浸泡，超净台内，无菌操作下用剪刀剪开腹部皮肤，暴露腹膜，用注射器腹腔注入RPMI 1640基础培养液5ml，反复冲洗，回收冲洗液，IOOOrpm,离心5分钟，留沉淀，用RPMI1640筛选培养液(含HAT的RPMI 1640完全培养液中)重悬，调整细胞浓度I X IO5个/ml，加入96孔板，150iil/孔，37°C，5% C02培养过夜。(2)免疫脾细胞的制备小鼠末次免疫后三天，在无菌条件下取出脾脏，置于平皿中，RPMI 1640基础培养液冲洗一次，放于小烧杯的尼龙网上磨碎过滤，制成细胞悬液。离心，弃上清RPMI 1640基础培养液重悬,如此重复三次,计数。(3)骨髓瘤细胞的制备小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0经8-氮鸟嘌呤筛选后，培养至对数生长期，取两大瓶制成细胞悬液，离心，弃上清，用RPMI 1640基础培养液重悬，如些重复三次，计数。(4)细胞融合及HAT选择杂交瘤将骨髓瘤细胞与免疫脾细胞按I : 10比例混合，在50ml塑胶离心管内用RPMI1640基础培养液洗I次，I, 200rpm,离心8分钟。弃上清，将细胞混匀，缓慢加入Iml50%的PEG1500融合，融合I分钟后加入15ml的RPMI 1640基础培养液终止细胞融合。I, OOOrpm,离心5分钟。弃上清，用50ml的RPMI 1640筛选培养液轻轻混悬，平分于10块96孔板，50 u I/孔，370C ,5% C02培养。培养至第六天，换HT培养液(含HT的RPMI 1640完全培养液)两次。(5)抗体的检测用0. 06M pH9. 6碳酸缓冲溶液稀释重组甲型流感核蛋白抗原(深圳市菲鹏生物股份有限公司生产，货号BA-IAV0004)，使其终浓度为5iig/ml。每孔0. Iml加入96孔聚苯乙烯板，37°C 2小时或4°C过夜。次日，用含10%小牛血清或I %脱脂奶粉的0. 02M pH7. 2PBS，0. 15ml/孔，37°C 2小时，用于检测。重组融合后第七天，取细胞上清0. Iml于上述96孔检测板中，37°C 30分钟，水洗六次后加入2000倍稀释的辣根过氧化酶标记的羊抗鼠IgG (深圳市菲鹏生物股份有限公司生产，货号BA-PAB-MU0001)，37°C 30分钟同上洗后，每孔加入IOOiU含0. 1% (M/V)邻苯二胺，0. 1% (V/V)双氧水，pH5.0柠檬酸磷酸缓冲液，37°C 15分钟，加入稀硫酸溶液，每孔50iU，测450nm吸收值。RPMI 1640完全培养液作为阴性对照， 以测定值与对照值得比彡2. 0为阳性细胞孔。分泌抗体阳性细胞孔以I个细胞/孔在96孔培养板上用有限稀释法克隆，筛选阳性孔依上法连续克隆三次，扩大培养后，用含10% DMSO的培养液冻存，细胞密度为IO6个/ml。细胞融合一次共获得I株能稳定分泌抗体的细胞株，命名为H1N1-2F10(CCTCCC201119)细胞系。3.单克隆抗体的制备选6-8周健壮的BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射0. 5ml的降植烷；10天后腹腔注射IX IO6个杂交瘤细胞。接种细胞7 10天后可产生腹水，密切观察动物的健康状况与腹水征象，待腹水尽可能多，而小鼠频于死亡之前，处死小鼠，用滴管将腹水吸入试管中，一般一只小鼠可获5 IOml腹水。收集腹水，离心取上清，放于_20°C冰箱保存。取腹水上清，用3倍体积的PBS稀释后滤纸过滤。将所得的滤液在lml/min的流速下加到一个已用PBS平衡的蛋白G亲和层析柱(购自Amersham Biosciences公司)。然后用PBS以lml/min的流速洗涤未被蛋白G吸附的物质直至在0D280nm下的吸附值达到基线为止。再用0. IM的甘氨酸洗脱液(pH2. 5)洗脱并回收该抗体。所回收的溶液用0. IMTRIS(pH8. 8)中和，通过超滤将抗体浓度调节到一个合适的浓度，_20°C分装冻存。4.效价测定以间接ELISA法检测，CCTCC C201119杂交瘤细胞培养上清效价2. 56X 103，腹水抗体效价2. 18 X IO6。5.单克隆抗体鉴定亲和力CCTCC C201119杂交瘤细胞系分泌的单克隆抗体以ELISA法检测，相对亲和常数I. 24X 108。实施例2甲型流感病毒胶体金快速检测试纸的制备I.硝酸纤维素膜的制备包被缓冲液的配制含6%甲醇0. OlM PH7. 2PBS缓冲液为包被缓冲液，0. 22 U膜滤过，置4°C备用，有效期一周。IOOOml 6%甲醇的0. OlM PH 7. 2PBS缓冲液配方NaCL 8g，KCL 0. 2g, Na2HPO4. 12H20 2. 9g, KH2PO4 0. 2g,甲醇 60ml，双蒸去离子水定容至 1000ml。硝酸纤维素膜的制备用包被缓冲液将抗甲型流感病毒核蛋白兔多克隆抗体(深圳市菲鹏生物股份有限公司生产，货号BA-PAB-NP0003)稀释到I 5mg/ml，调整机器，划线为T线，即为检测线，T线靠近金标垫端，距金标垫端约5mm ;用包被缓冲液将羊抗鼠IgG抗体(深圳市菲鹏生物股份有限公司生产，货号BA-PAB-MU0001)稀释到I 5mg/ml，调整机器，划线为C线，即为控制线，C线靠近吸收垫，距吸收垫约3mm。两线距离5 8mm，均匀。37 °C烘干，封装备用。2.胶体金、金标记单克隆抗体的制备(I)溶液的配制①氯金酸的配制用双蒸去离子水溶解氯金酸，配成1%溶液，置4°C备用，有效期四个月。IOOOml I %氯金酸溶液配方IOg氯金酸双蒸去离子水定容至1000ml。
②柠檬酸三钠的配制用双蒸去离子水溶解柠檬酸钠，配成1%溶液，，0.22U膜滤过，置4度备用，有效期容至1000ml。③0. IM碳酸钾的配制用双蒸去离子水配制，0.22 y膜滤过，置4度备用，有效期四个月。IOOOmlO. IM碳酸钾溶液配方13. 8g碳酸钾；双蒸去离子水定容至1000ml。④2% PEG-20000的配制用双蒸去离子水配制，0. 22 ii膜滤过，置4度备用，有效期四个月。1000ml 2% PEG-20000溶液配方20g PEG-20000 ;双蒸去离子水定容至1000ml。⑤标记洗涤保存液的配制2%牛血清白蛋白(BSA)，0. 05%叠氮钠(NaN3)，0. OlMPH7.2PBS溶液，0.22 ii膜滤过，置4度备用，有效期四个月。IOOOml标记洗涤保存液配方20g BSA, 0. 5g NaN3、0. OlM pH7. 2 PBS 溶液定容至 1000ml。(2)胶体金的制备用双蒸去离子水将1%氯金酸稀释成0.01%，置电炉煮沸，按每IOOml 0.01%氯金酸加入2ml I %柠檬酸三钠，继续煮沸，直到液体呈亮红色即停止加热，冷却至室温后补足失水。制备好的胶体金外观应纯净、透亮、无沉淀和漂浮物，有效期一周。(3)胶体金标记单克隆抗体的制备用0. IM碳酸钾调胶体金的PH值至8. 2，按8 10 ii g抗体/ml胶体金加入实施例I中制备得到的抗甲型流感病毒NP蛋白单克隆抗体，磁力搅拌器混匀30min，搅拌下加入BSA至终浓度为I %静置I小时。13000印111、41离心301^11，弃上清，沉淀用标记洗涤保存液洗涤两次，用十分之一初始胶体金体积的标记洗涤保存液将沉淀重悬，置4°C备用，有
效期一周。3.金标垫的制备(I)封闭液的配制2% BSA, 0. 1% TritonX-100,0. 05% NaN3,0. OlM pH7. 2 PBS 溶液，0.22 y 膜滤过，置4度备用，有效期四个月。IOOOml封闭液配方20g BSA,0. 5g NaN3Uml TritonX-100、0. OlM PH7. 2 PBS 溶液定容至 IOOOml0(2)金标垫的制备将金标垫浸泡于封闭液中30min后，于37°C烘干。然后将制备好的金标记抗体均匀的铺在金标垫上，每毫升溶液铺20平方厘米，冷冻干燥，封装，置4°C备用。4.试纸条样品垫的制备
(I)封闭液的配制2% BSA, 0. 1% TrtionX-100,0. 05% NaN3,0. OlM pH7. 2 PBS 溶液，0.22 y 膜滤过，置4度备用，有效期四个月。IOOOml封闭液配方20g BSA,0. 5g NaN3Uml TrtionX-100、0. OlM PH7. 2 PBS 溶液定容至 IOOOml0(2)样品垫的制备将样品垫浸泡于封闭液中30min后，于37°C烘干，封装，置4°C备用。5.试纸条的组装将硝酸纤维素膜、玻璃纤维、吸收垫、样品垫按图依次层叠起来，切成3mm宽的小条。每十小条一包，加入干燥剂，真空封装。4 30°C保存，有效期2年。实施例3快速检测甲型流感病毒NP蛋白的试剂盒I.快速检测甲型流感病毒NP蛋白的试剂盒包括①试纸条一包(10条/包)②样品稀释液一瓶(IOml/瓶)相关溶液的配制样品稀释液样品稀释液为8% NaCL溶液。配制方法80gNaCL，加蒸馏水定容至IOOOml02.胶体金法甲型流感病毒NP蛋白的检测(I)直接将采集好的鼻咽部拭子置于含有300 Ul稀释液的塑料试管中，充分挤压，使鼻腔分泌物完全溶解于稀释液，取120 Ul溶解好的样品加入到试纸卡加样孔，等待15min后即可观察结果。(2)结果判定当试纸条出现肉眼可见的紫红色质控线，没有出现肉眼可见的紫红色检测线，结果判为阴性；当试纸条出现肉眼可见的紫红色质控线，同时也出现肉眼可见的紫红色检测线，结果判为阳性；检测线颜色越深说明被检测样品的抗体水平越高；当试纸条没有出现肉眼可见的紫红色质控线，不管有没有出现肉眼可见的紫红色检测线。结果都判为检测试纸条失效，应废弃。实施例4快速诊断甲型流感病毒试剂盒的应用82例鼻咽拭子标本经甲型流感病毒核酸检测阳性样本，500例检出阴性样本。分另IJ采用目前市售的甲型流感病毒试剂盒A与本发明的试剂盒B进行检测，20分钟内观察结果。结果见表I。结果表明，试剂盒A的灵敏度为79. 27%，试剂盒B灵敏度为89. 02%，特异性试剂盒A为87. 60%，试剂盒B为92. 2%。灵敏度和特异性两项指标上均优于现有的产品，说明本发明的检测试剂盒完全可以用于常规的甲型流感快速诊断。表I快速诊断甲型流感病毒试剂盒的比较
权利要求
1.保藏号为CCTCCC201119的杂交瘤细胞株。
2.一种抗甲型流感病毒核蛋白单克隆抗体，其特征在于所述抗体由保藏号CCTCCC201119的杂交瘤细胞株产生。
3.根据权利要求I所述的杂交瘤细胞株在制备甲型流感检测试剂或设备中的应用。
4.根据权利要求2所述的抗甲型流感病毒核蛋白单克隆抗体在制备甲型流感检测试剂或设备中的应用。
5.一种甲型流感病毒快速检测试纸，其特征在于其包含权利要求2所述的抗甲型流感病毒核蛋白单克隆抗体。
6.根据权利要求5所述的甲型流感病毒快速检测试纸，其特征在于所述的抗甲型流感病毒核蛋白单克隆抗体包附胶体金。
7.一种甲型流感病毒检测试剂盒，其特征在于该试剂盒由权利要求5或6中所述的甲型流感病毒快速检测试纸组装而成。
8.根据权利要求7所述的试剂盒在甲型流感检测中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种高亲和力、高特异性的抗甲型流感病毒核蛋白单克隆抗体，及其制备与应用。该抗甲型流感病毒核蛋白单克隆抗体由杂交瘤细胞株H1N1-2F10分泌，其细胞株的保藏号为CCTCC C201119。本发明还提供了一种由该单克隆抗体制备的快速检测甲型流感的试剂盒，该试剂盒操作简单，具有特异性强，灵敏度高等特点。
文档编号G01N33/569GK102747040SQ20111010072
公开日2012年10月24日 申请日期2011年4月21日 优先权日2011年4月21日
发明者何志强, 崔鹏, 彭亮, 李泓彦, 胡鹏, 范凌云 申请人:深圳市菲鹏生物股份有限公司