基于表位抗原肽的抗内皮素受体a抗体酶联免疫检测方法及其在ctd-pah中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及基于表位抗原肽的抗内皮素受体A抗体酶联免疫检测方法，可用于结缔组织病合并肺动脉高压临床检测，通过体外合成4个长度不一的胞外肽段，筛选到与全长ENRA一致性良好的表位肽段，由人工合成该表位肽段作为抗原肽包板，建立基于表位抗原肽的抗内皮素受体A抗体酶联免疫检测方法，所述表位抗原肽为包含如下氨基酸序列的肽段：DNPERYSTNLSNHVDDFTTFRGTELSFLVTTHQPTNLVLPSNGSMHNYCPQQTKIT该方法减低了全长真核表达内皮素受体作为底物的成本，提高其临床检测实用性，成为CTD-PAH（特别是SLE-PAH）的生物标记物，对临床诊断和治疗的决策提供具有价值的信息。
【专利说明】基于表位抗原肽的抗内皮素受体A抗体酶联免疫检测方法及其在CTD-PAH中的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于临床自身抗体检测领域，具体涉及基于表位抗原肽的抗内皮素受体A抗体酶联免疫检测方法及其在结缔组织病合并肺动脉高压中的应用。
【背景技术】
[0002]肺动脉高压(PAH)是不同原因导致的肺循环疾病，最终引起不可逆的肺血管重构和右心衰竭，自然病程的中位数存活时间仅为2~3年。结缔组织病(CTD)所致的PAH是肺动脉高压疾病谱的重要组成部分，国外的报道显示CTD-PAH占所有PAH的10%，而国内的资料该数字接近20% ;西方的数据显示系统性硬化症(SSc)在CTD-PAH中占绝对主导，而我国则是系统性红斑狼疮(SLE)为导致CTD-PAH的首要原因(构成比达40%)。
[0003]在过去10年中，随着以内皮素受体拮抗剂、前列环素类似物、磷酸二酯酶抑制剂为代表肺动脉高压靶向治疗的问世，各种PAH的总体预后确实得到了改善，但CTD-PAH患者的预后仍明显低于特发性PAH患者。以SLE为代表的CTD-PAH显然存在特有的免疫病理机制，而发展其免疫病理特征性的生物标记物，势必有助于早期捕捉、预测PAH的发生和进程，为更有针对性的靶向性干预提供依据。
[0004]内皮素受体通路是PAH公认的致病通路之一，其活化对PAH的肺血管重构起到了关键作用。已有德国学者发现了 SSc中存在抗内皮素受体A抗体，并建立了基于内皮素受体蛋白全长的 ELISA检测方法(Riemekasten G, Philippe A, Nather M, et al.1nvolvementof functional autoantibodies against vascular receptors in systemic sclerosis.Ann Rheum Dis.2011Mar; 70 (3):530-6.) ?其研究结果显示，抗内皮素受体A抗体与SSc的病情严重性存在正相关；体外的功能实验则提示该抗体存在活化内皮素受体通路的致病功能。该发现提出了一系列问题需要进一步解决:(1)抗内皮素受体A抗体(ant1-ENRA)是否存在于其他CTD? (2) ant1-ENRA与CTD-PAH是否存在关联，换言之，其是否能够成为CTD-PAH (特别是未经报道、而在国人当中更为常见的SLE-PAH)的生物标记物？ (3)ant1-ENRA作为可能具有致病功能的自身抗体，其存在是否对内皮素受体拮抗剂的个体化应用提供依据？ (4)从临床检测的技术层面，由于内皮素受体是7次跨膜的G蛋白偶联受体，其全长的真核表达代价昂贵，能否通过表位分析进而合成抗原肽，以优化并低成本化ant1-ENRA的检测方法、提高其临床检测实用性？这些问题急需得到解决。
【发明内容】
[0005]针对已有技术存在的不足，本发明的目的之一是提供基于内皮素受体A表位抗原肽的ant1-ENRA抗体酶联 免疫检测方法，以克服现有技术存在的代价昂贵的缺陷。
[0006]本发明的目的之二是提供该方法在CTD-PAH作为生物标记物检测的应用。
[0007]本发明目的之三是提供内皮素受体A表位抗原多肽片段用于制备诊断和评估结缔组织病合并肺动脉高压以及定性和定量检测人血清中抗内皮素受体A抗体的试剂和试剂盒。
[0008]本发明的发明目的是通过如下技术方案实现的:
[0009]在前期首先在CTD-PAH的血清中证实存在抗内皮素受体A (而非内皮素受体B)的自身抗体，建立了基于ENRA全长重组蛋白的ant1-ENRA的ELISA方法。进而聚焦于独立样本的SLE-PAH，确证了超过40%的患者存在ant1-ENRA (如图1所示)。
[0010]一种基于表位抗原肽的抗内皮素受体A抗体酶联免疫检测方法，内皮素受体A是一个7次跨膜的G蛋白偶联受体，由347个氨基酸序列构成，除一段信号肽外，共有4个长度不一的胞外肽段。循环中的自身抗体应与其胞外肽段构成的抗原表位结合。本发明就是通过合成了上述4条胞外肽段，筛选到了与全长ENRA —致性良好的表位肽段(如图2所示)，由人工合成该表位肽段作为抗原肽包板，并就此建立了基于内皮素受体A表位抗原肽的ant1-ENRA抗体酶联免疫检测方法。所述肽段为内皮素受体A的氨基酸序列为(是内皮素受体A的2广76位的56个氨基酸序列):
[0011 ] DNPERYSTNLSNHVDDFTTFRGTELSFLVTTHQPTNLVLPSNGSMHNYCPQQTKIT。
[0012]所述表位抗原肽包括所有氨基酸序列，及其排列顺序。
[0013]基于表位抗原肽的抗内皮素受体A抗体酶联免疫检测方法，具体步骤如下:
[0014]I)、包被缓冲液(PH9.60.05M 碳酸盐缓冲液)，由 NaHC03 1.59 克，NaHC03 2.93克加蒸懼水至IOOOml ；
[0015]2)、5ug/ml的抗原肽在碳酸缓冲液中包被96孔板过夜后，PBS-T (IOOOmL PBS加入0.5mL吐温20)洗涤三次；
[0016]3)、3%的牛血清白蛋白(或0.3%明胶、10%胎牛血清)封闭2小时，PBS-T洗涤三次；
[0017]4)、患者血清1:100-1:300稀释后，加入酶标板室温下反应I小时，PBS-T洗涤三次；
[0018]5)、加入适当比例稀释的辣根过氧化物酶-抗人IgG 二抗，室温反应I小时；
[0019]6)、加入TMB (Tetramethyl benzidine)底物反应10分钟后，用2M硫酸终止反应；
[0020]7)、酶标仪吸光度450nM读板测吸光度值。
[0021]所述内皮素受体A表位抗原多肽片段用于制备诊断和评估结缔组织病合并肺动脉高压以及定性和定量检测人血清中抗内皮素受体A抗体的试剂和试剂盒。
[0022]基于表位抗原肽的抗内皮素受体A抗体酶联免疫检测方法用于CTD-PAH中的生物标记物检测。
[0023]其中CTD包括系统性红斑狼疮、硬皮病、混合性结缔组织病、炎症性肌病、干燥综合征、类风湿关节炎、系统性血管炎、抗磷脂抗体综合征。
[0024]本发明基于表位抗原肽的ant1-ENRA酶联免疫检测方法，大幅度减低了全长真核表达内皮素受体作为底物的成本，提高其临床检测实用性。本发明可成为CTD-PAH(特别是SLE-PAH)的生物标记物，对临床诊断和治疗的决策提供具有参考价值的信息。
【专利附图】
【附图说明】
[0025]图1在CTD-PAH和SLE-PAH中ENRA全长重组蛋白的ant1-ENRA的ELISA检测。[0026]图2ENRA结构模建显示的4条胞外片段。
[0027]图3以2广76位表位肽段为底物的ant1-ENRA的ELISA检测结果，以及和ENRA全长方法的一致性对照。(计量资料一致性分析用Intraclass correlation coefficient(ICC)，alpha 系数 >0.7 认为一致性比较高。SLE-PAH 组 alpha 系数:0.821 ；SLE 组 alpha系数:0.803 ；NormaI 组 alpha 系数:0.831)
[0028]图4SLE-PAH阳性血清亲和层析获得ant1-ENRA IgG可刺激血管平滑肌细胞增殖，并可增强内皮素-1 (ET-1)对血管平滑肌细胞的增殖效应。
[0029]图5R0C 曲线。
【具体实施方式】
[0030]实施例1
[0031]本发明基于表位抗原肽的抗内皮素受体A抗体酶联免疫检测方法的建立:
[0032]1.15ug/ml的抗原在碳酸缓冲液中包被96孔板过夜后，PBS-T洗涤三次。
[0033]1.23%的牛血清白蛋白(或0.3%明胶、10%胎牛血清)封闭2小时，PBS-T洗涤三次。
[0034]1.3患者血清1:100-1:300稀释后，加入酶标板室温下反应I小时，PBS-T洗涤三次。
[0035]1.4加入适当比例稀释的辣根过氧化物酶-抗人IgG 二抗，室温反应I小时。
[0036]1.5加入TMB (Tetramethyl benzidine)底物反应10分钟后，用2M硫酸终止反应。
[0037]1.6酶标仪吸光度450读板。
[0038]实施例2
[0039]本发明获得的ant1-ENRA IgG对血管平滑肌细胞增殖的影响
[0040]2.1对检测筛选到的SLE-PAH阳性血清，通过IgG亲和层析获得ant1-ENRA IgG
[0041]I)取出上一步中含有细胞上清的肽铰连的蛋白磁珠的EP管，放至EP管架上；
[0042]2)将含有200ul细胞上清的G蛋白磁珠，置于磁力架上；
[0043]3)待磁珠汇集于EP管的一侧后，吸取弃去清液；
[0044]4)吸取干净后，取出EP管后置于EP管板上；
[0045]5)向上述EP管中加入IOOul PBS缓冲液洗涤固定磁珠-1gG蛋白复合物2遍；
[0046]6)在第3次洗涤时，按照非变性方式洗脱；
[0047]7)非变性洗脱液:加入50ul Tris-甘氨酸(pH=2.5)到EP管磁珠样品中，然后轻轻混匀2分钟，
[0048]8)待磁珠汇集于一侧后，吸取一侧清液(已经含有IgG)到一新的EP管(已经加入5ul Tris-HCl pH=8.0)；
[0049]9)非变性洗脱液IgG含量采用BCA试剂盒测定。
[0050]2.2Xcelligence实时监测ant1-ENRA IgG对血管平滑肌细胞的增殖效应
[0051]I)每孔加入90U1F-12K培养基，放入仪器卡座，检测孔板与仪器接触是否良好，
[0052]2)根据确定的细胞密度，每孔加入IOOul细胞悬液，
[0053]3)放入培养箱内静置半小时后，再放回仪器卡座，[0054]4)待24小时细胞全部贴壁后，更换无血清培养基让细胞饥饿过夜，使得细胞同步化，
[0055]5)次日清晨加入20%胎牛血清刺激细胞6小时，各组相应加入培养液，或内皮素
0.25ug/ml和(或)抗内皮素抗体0.02ug/ml。
[0056]6)仪器每15分钟自动扫描一次,96小时后读取结果。
[0057]通过对检测筛选到的SLE-PAH阳性血清，通过IgG亲和层析获得ant1-ENRA IgG。体外实验显示，ant1-ENRA抗体可刺激血管平滑肌细胞增殖，并可增强内皮素_1 (ET-1)对血管平滑肌细胞的增殖效应(如图4所示)。
[0058]实施例3
[0059]抗DT-56多肽抗体检测的试剂盒制备
[0060]如无特殊说明均为常规方法
[0061]试剂盒制备所需的试剂
[0062]1.DT-56多肽，偶联KLH后，以5ug/ml包被高亲合力酶标板；
[0063]2.辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG工作液浓度为1:10000,12mL/瓶，I瓶。含有1%的小牛血清，0.1%的硫柳汞。
[0064]3.显色液为四甲基乙二胺(TMB)溶液，IOmL/瓶。
[0065]4.洗涤液为 10XPBS-T，含有 0.1% 叠氮钠(NaN3)，100mL。
[0066]5.终止液为2M的硫酸，IOmL/瓶。
[0067]6.包被缓冲液(PH9.60.05M 碳酸盐缓冲液)，由 NaHC03 1.59 克，NaHC03 2.93克加蒸懼水至IOOOml ；
[0068]7.封闭液为0.5%牛血清白蛋白PBS溶液。
[0069]酶标板制备
[0070]1.DT-56多肽由公司合成，并用戊二醛法绞连KLH，纯度〉99%，
[0071]2.包被抗原浓度为5ug/mL的碳酸缓冲液，
[0072]3.抗原液IOOul每孔包被4度过夜，弃去包被液后，PBS-T洗涤三次；
[0073]4.37度烘干后，置于真空袋内，4度长期保存。
[0074]抗内皮素抗体生物标记物检测
[0075]1.收集年龄、性别匹配的体检健康正常人例，红斑狼疮患者和结缔组织病合并肺动脉高压的患者，设定临界值(平均值+3标准差)，即A值。
[0076]2.按实施例1步骤检测抗DT-56抗CTD-PAH体。
[0077]计算阳性率，患者检测值(P)，除以阴性检测值(N)，P/N>2.1为阳性。
[0078]检测结果分析
[0079]使用DT-56-KLH包被的间接ELISA检测和使用ENDRA全长重组蛋白包被的抗ENDRA抗体检测方法检测了患者和正常对照患者血清中的抗体，图3结果显示，抗DT-56抗体对结缔组织病合并肺动脉高压的患者诊断的阳性率为45.8%,特异性为87.5%。与以全长内皮素受体A包被的抗内皮素抗体检出率和特异性相似阳性率40.8%,特异性96.3%。通过对数据分析，图5显示ROC曲线比较无差异，p>0.05。说明两种检测方法结果一致性高，抗DT-56抗体检测法可以替代全长ENDRA包被的间接ELISA法。
[0080]ant1-ENRA抗体存在于包括系统性红斑狼疮、系统性硬化症、混合性结缔组织病、干燥综合征、炎性肌病和类风湿性关节炎等多种结缔组织病，并与CTD-PAH存在关联，可能成为CTD-PAH (特别是SLE-PAH)的生物标记物。ant1-ENRA作为可能具有致病功能的自身抗体，参与PAH的内皮素受体通路活化和血管平滑肌细胞增殖。因此，对内皮素受体拮抗剂的个体化应用提供可能的临床依据。具有较强的临床应用推广价值。
[0081]本专利覆盖了上述表位肽段所包括的所有氨基酸序列，用于检测ant1-ENRA抗体。本专利涉及该抗体检测在所有CTD-PAH的应用。
【权利要求】
1.一种基于表位抗原肽的抗内皮素受体A抗体酶联免疫检测方法，其特征在于，通过体外合成4个长度不一的胞外肽段，筛选到与全长ENRA —致性良好的表位肽段，由人工合成该表位肽段作为抗原肽包板,建立基于表位抗原肽的抗内皮素受体A抗体酶联免疫检测方法，所述表位抗原肽为包含如下氨基酸序列的肽段:
DNPERYSTNLSNHVDDFTTFRGTELSFLVTTHQPTNLVLPSNGSMHNYCPQQTKIT。
2.根据权利要求1所述的一种基于表位抗原肽的抗内皮素受体A抗体酶联免疫检测方法，其特征在于，具体步骤如下: 1)、将5ug/ml的抗原肽在碳酸缓冲液中包被96孔板过夜后，PBS-T洗涤三次； 2)、3%的牛血清白蛋白或0.3%明胶和10%胎牛血清封闭2小时，PBS-T洗涤三次； 3)、患者血清1:100-1:300稀释后，加入酶标板室温下反应I小时，PBS-T洗涤三次； 4)、加入适当比例稀释的辣根过氧化物酶-抗人IgG二抗，室温反应I小时； 5)、加入TMB底物反应10分钟后，用2M硫酸终止反应； 6)、酶标仪吸光度450nM读板测吸光度值。
3.根据权利要求1或2所述的一种基于表位抗原肽的抗内皮素受体A抗体酶联免疫检测方法，其特征在于，所述表位抗原肽包括所有氨基酸序列，及其排列顺序。
4.根据权利要求1或2所述的一种基于表位抗原肽的抗内皮素受体A抗体酶联免疫检测方法，其特征在于，所述内皮素受体A表位抗原多肽片段用于制备诊断和评估结缔组织病合并肺动脉高压以及定性和定量检测人血清中抗内皮素受体A抗体的试剂和试剂盒。
5.根据权利要求1或2所述的基于表位抗原肽的抗内皮素受体A抗体酶联免疫检测方法，其特征在于，该方法在CTD-PAH作为生物标记物检测的应用。
6.根据权利要求5所述的基于表位抗原肽的抗内皮素受体A抗体酶联免疫检测方法，其特征在于，其中CTD包括系统性红斑狼疮、硬皮病、混合性结缔组织病、炎症性肌病、干燥综合征、类风湿关节炎、系统性血管炎和抗磷脂抗体综合症。
【文档编号】G01N33/68GK103728454SQ201210381023
【公开日】2014年4月16日 申请日期:2012年10月10日 优先权日:2012年10月10日
【发明者】陈晓翔, 叶霜, 吴庄民, 张瑱 申请人:上海博戍生物科技有限公司