杂交瘤细胞株st03、抗黄曲霉毒素生物合成前体物st单克隆抗体及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及杂交瘤细胞株ST03、黄曲霉毒素生物合成前体物ST单克隆抗体及其应用。本发明提供的杂交瘤细胞株ST03（保藏编号为CCTCCNO.C2013187）可以用于制备高效价抗黄曲霉毒素生物合成前体物ST单克隆抗体，抗黄曲霉毒素生物合成前体物ST鼠腹水抗体酶联免疫吸附分析（ELISA）法测得的效价可达6.4×105。抗黄曲霉毒素生物合成前体物ST单克隆抗体灵敏度高，对黄曲霉毒素生物合成前体物ST的50%抑制浓度IC50为0.36ng/mL，与黄曲霉毒素B1，黄曲霉毒素B2，黄曲霉毒素G1，黄曲霉毒素G2均无交叉反应，可应用于黄曲霉毒素生物合成前体物ST含量测定。
【专利说明】杂交瘤细胞株ST03、抗黄曲霉毒素生物合成前体物ST单克隆抗体及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及杂交瘤细胞株ST03、抗黄曲霉毒素生物合成前体物ST单克隆抗体及其应用。
【背景技术】
[0002]黄曲霉毒素中间体杂色曲霉素即ST是黄曲霉毒素合成的前期中间体，主要是由杂色曲霉、黄曲霉、构巢曲霉、细皱曲霉等真菌产生，可污染大多数粮食和饲草，尤其对小麦、玉米、花生和饲草等污染更为严重。黄曲霉毒素生物合成前体物ST的基本结构是由二呋喃环与氧杂蒽酮连接组成，结构类似于黄曲霉毒素，其毒性仅次于黄曲霉毒素，其具有肝毒性，肾毒性，细胞遗传毒性和强致癌性，它污染食品及饲料后，直接或间接进入人类食品链，威胁人类的健康和生命安全，危害程度与黄曲霉毒素生物合成前体物ST的摄入量成正相关。我国属于黄曲霉毒素生物合成前体物ST污染较重的地区，加强对食品及饲料中黄曲霉毒素生物合成前体物ST的检测是增强食品安全性的一个重要环节。因此，对可能污染黄曲霉毒素生物合成前体物ST的谷物及其制品进行检测是非常必要的。
[0003]目前，黄曲霉毒素生物合成前体物ST的检测方法主要有薄层层析法(TLC)和液相色谱法，其中，TLC方法具有操作简单，不需要复杂精密的仪器设备的优点，但灵敏度较低，准确性不高；黄曲霉毒素生物合成前体物ST的最低检出量是大米、玉米、小麦为25 μ g/kg ；黄豆、花生样品为50yg/kg。近年来，高效液相色谱法(HPLC)在真菌毒素检测中得到广泛应用，对黄曲霉毒素生物合成前体物ST的检测也有报道，但是前处理繁琐、仪器设备昂贵、需要严格的操作环境以及 专业的操作人员等限制了此方法在基层检测中的应用。因此，研究开发新兴的黄曲霉毒素生物合成前体物ST快速检测技术是我国检测市场的迫切需求，对保障我国食品消费安全具有重要意义。
[0004]近些年发展起来的免疫分析技术具有灵敏度高、检测时间短、操作简单等优点，并逐渐成为黄曲霉毒素等污染物快速检测技术研究的热点，但针对黄曲霉毒素生物合成前体物ST的快速检测技术还鲜为报道。抗原和抗体是免疫分析技术的核心试剂和技术源头。黄曲霉毒素生物合成前体物ST分子量为324，属小分子化合物(< 1000)，不能直接刺激动物产生抗体，只有和牛血清蛋白(BSA)、卵清白蛋白(0VA)、多聚赖氨酸等载体蛋白质共价偶联后，才能转化为既具有反应原性又具有免疫原性的的人工抗原，刺激动物产生抗体。目前，黄曲霉毒素生物合成前体物ST人工抗原主要由硼氢化钠还原法制备获得，其合成的抗原制备得到的抗体灵敏度往往不高。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供杂交瘤细胞株ST03、抗黄曲霉毒素生物合成前体物ST单克隆抗体及其应用。
[0006]本发明提供了杂交瘤细胞株ST03，该细胞株已于2013年11月13日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是:中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC N0.C2013187 ;其具有序列表中SEQ ID No:1所示的抗黄曲霉毒素生物合成前体物ST单克隆抗体重链可变区编码基因序列和序列表中SEQ ID No:2所示的抗黄曲霉毒素生物合成前体物ST单克隆抗体轻链可变区编码基因序列。
[0007]抗黄曲霉毒素生物合成前体物ST单克隆抗体，它是由保藏编号为CCTCC N0.C2013187的杂交瘤细胞株ST03分泌产生；其重链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ IDNo:3所示；轻链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No:4所示；该抗黄曲霉毒素生物合成前体物ST单克隆抗体可以识别黄曲霉毒素生物合成前体物ST，对黄曲霉毒素生物合成前体物ST的50%抑制浓度IC50为0.36 ng/mL。
[0008]抗黄曲霉毒素生物合成前体物ST单克隆抗体在黄曲霉毒素生物合成前体物ST含量测定中的应用。
[0009]本发明提供的杂交瘤细胞株ST03是采用两步筛选法获得的，其具体步骤为:将Balb/c小鼠经黄曲霉毒素生物合成前体物ST的人工抗原(黄曲霉毒素生物合成前体物ST-BSA)免疫4-6次后，用2倍于前一次免疫剂量的黄曲霉毒素生物合成前体物ST的人工抗原作最后一次加强免疫，3天后进行细胞融合，采用ELISA方法分两步进行筛选融合细胞:第一步采用间接ELISA法筛选出抗黄曲霉毒素生物合成前体物ST而不抗载体蛋白BSA的阳性孔；第二步采用间接竞争ELISA法对第一步筛选出的阳性孔培养液进行检测，用黄曲霉毒素生物合成前体物ST作为竞争原，选择吸光值和灵敏度均较高的孔，采用有限稀释法进行亚克隆，亚克隆后采用同样的两步筛选法进行检测，如此重复亚克隆2-3次后，最终筛选获得杂交瘤细胞株ST03。
[0010]本发明提供 的抗黄曲霉毒素生物合成前体物ST单克隆抗体的制备方法，步骤如下:将获得的杂交瘤细胞株ST03注射到预先用福氏不完全佐剂处理过的Balb/c小鼠的腹部，收集该小鼠的腹水，纯化后得到抗黄曲霉毒素生物合成前体物ST单克隆抗体。
[0011]按上述方案，所述的纯化为辛酸-硫酸铵纯化法，具体操作为:用双层滤纸过滤小鼠腹水，4°c，12000r/min离心15min以上，吸取上清，将所得腹水上清与4倍体积的醋酸盐缓冲液混合，搅拌下缓慢加入正辛酸，每毫升腹水所需的正辛酸体积为33 μ L，室温混合30~60min，4°C静置2h以上，然后4°C，12000r/min离心30min以上，弃沉淀，将得到的上清液用双层滤纸过滤后，加入1/10滤液体积的摩尔浓度为0.lmol/L和pH值为7.4的磷酸盐缓冲液，用2 mol/L的氢氧化钠溶液调节该混合液的pH值至7.4，4 °C预冷，缓慢加入硫酸铵至硫酸铵终浓度为0.277g/mL，4°C静置2h以上，然后4°C，12000r/min离心30min以上，弃上清，将所得沉淀用原腹水体积1/10的0.01mol/L磷酸盐缓冲液重悬，装入透析袋，用纯水透析，将充分透析好的蛋白溶液置_70°C冰箱冷冻，之后用冷冻干燥机冻干，收集冻干粉，即得纯化好的抗黄曲霉毒素生物合成前体物ST单克隆抗体，将抗体置_20°C冰箱中备用；
所述的醋酸盐缓冲液为0.29g醋酸钠，0.141mL醋酸加水定容到IOOmL所得；所述的
0.lmol/L的磷酸盐缓冲液为0.8g氯化钠，0.29g十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化钾，磷酸二氢钾0.02g，加水定容到IOOmL所得。
[0012]本发明的有益效果在于:
(I)本发明提供的杂交瘤细胞株ST03可以用于制备高效价抗黄曲霉毒素生物合成前体物ST单克隆抗体，抗黄曲霉毒素生物合成前体物ST鼠腹水抗体酶联免疫吸附分析(ELISA)法测得的效价可达6.4X IO5 ;
(2)该抗黄曲霉毒素生物合成前体物ST单克隆抗体灵敏度高，对黄曲霉毒素生物合成前体物ST的50%抑制浓度IC5tl为0.36 ng/mL，与黄曲霉毒素BI，黄曲霉毒素B2，黄曲霉毒素Gl，黄曲霉毒素G2均无交叉反应；
(3)本发明提供的抗黄曲霉毒素生物合成前体物ST单克隆抗体可应用于黄曲霉毒素生物合成前体物ST含量的测定。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]图1为实施例1中的紫外-可见光谱连续扫描图谱，图中:ST为黄曲霉毒素生物合成前体物ST紫外-可见光谱连续扫描图谱曲线；BSA为牛血清白蛋白紫外-可见光谱连续扫描图谱曲线；ST-BSA为黄曲霉毒素生物合成前体物ST的人工抗原紫外-可见光谱连续扫描图谱曲线。
[0014]图2为本发明的快速检测黄曲霉毒素生物合成前体物ST的免疫层析试纸的正视图，图中:1纸板；2吸水垫；3检测垫；4金标垫；5样品垫；6质控线；7检测线。
[0015]图3为本发明的快速检测黄曲霉毒素生物合成前体物ST的免疫层析试纸的左视图，图中:1纸板；2吸水垫；3检测垫；4金标垫；5样品垫。
[0016]图4为实施例5中应用本发明提供的抗黄曲霉毒素生物合成前体物ST单克隆抗体制备的试纸条检测样品的结果判定图，图中:6质控线；7检测线；8对照试纸条；9检测试纸条。 【具体实施方式】
[0017]实施例1黄曲霉毒素生物合成前体物ST的人工抗原的合成
(1)取市售的羟基乙酸(水分~1%)0.1克溶于0.4 mL三氟乙酸；称取I mg黄曲霉毒素生物合成前体物ST溶于0.4 mL乙腈中；用注射器吸取黄曲霉毒素生物合成前体物ST乙腈溶液轻轻吹打入羟基乙酸/三氟乙酸的混合物中，室温(20°C~30°C)条件下磁力搅拌反应4 h ;将反应溶液旋转蒸发溶剂，得到淡黄绿色油状物即黄曲霉毒素生物合成前体物ST半抗原；
(2)取Img黄曲霉毒素生物合成前体物ST半抗原、4mg N-羟基琥珀酰亚胺置于反应瓶中，室温条件下磁力搅拌反应Ih ;称取7mg碳二亚胺溶于0.2mL的1，4- 二氧六烷中；将碳二亚胺的1，4-二氧六烷溶液缓慢滴加于反应瓶中，室温条件磁力搅拌4h，直至反应瓶中有白色沉淀生成；反应结束后，将反应物室温静置过夜，次日，在8000 r/min条件下离心5min,取上清；称取4 mg牛血清白蛋白(BSA)溶于5 mL PBS溶液中(0.2 mol/L, pH 8.0);将上述上清逐滴加入BSA的PBS溶液中，加样结束后计时，反应4 h，得到水相的黄曲霉毒素生物合成前体物ST完全抗原；
(3)将上述步骤(2)中水相的黄曲霉毒素生物合成前体物ST完全抗原密闭于透析袋中，以0.01 mol/L pH 8.0的磷酸盐缓冲液作为透析液，共透析3天，每间隔12小时更换I次透析液；最后I次透析结束后，将透析袋中的溶液分装于离心管中，经冷冻干燥，即得到黄曲霉毒素生物合成前体物ST的人工抗原:黄曲霉毒素生物合成前体物ST-牛血清白蛋白。[0018]上述合成的黄曲霉毒素生物合成前体物ST的人工抗原的鉴定:
1、通过紫外-可见光谱扫描图谱鉴定黄曲霉毒素生物合成前体物ST的人工抗原，结果见图1，从图1中可以看出黄曲霉毒素生物合成前体物ST与载体牛血清白蛋白偶联成功。由偶联物在特征紫外吸收波长413 nm处的吸光度值及消光系数可以算出黄曲霉毒素生物合成前体物ST-牛血清白蛋白的偶联率为3.4:1。
[0019]2、免疫动物证明产生了抗黄曲霉毒素生物合成前体物ST的抗体:
(O小鼠免疫试验:用0.85%的生理盐水将上述合成的黄曲霉毒素生物合成前体物ST-牛血清白蛋白配成0.67毫克每毫升的溶液，第一次免疫用0.45毫升完全弗氏佐剂与上述配好的黄曲霉毒素生物合成前体物ST-牛血清白蛋白等体积混合，充分乳化后，每只6-8周龄的Balb/c小鼠皮下注射0.3毫升,相当于100微克蛋白质。每隔3周加强免疫I次，加强免疫中将佐剂换用不完全弗氏佐剂，其他方法与第一次免疫方法相同。每次加强免疫后第7-10天从小鼠尾部取血,制备抗血清。
[0020](2)非竞争ELISA检测抗体效价试验:以pH 9.6的碳酸盐缓冲液将包被抗原黄曲霉毒素生物合成前体物ST-牛血清白蛋白稀释成0.5微克每毫升，酶标板每孔加入100微升，4 °C过夜，倾去包被液，用常规磷酸盐-吐温洗涤液每孔洗涤三次，扣干；每孔加入200微升1.5%脱脂奶粉，37 °C封闭2小时，倾去封闭液，每孔洗涤三次，扣干；从500倍开始倍比稀释抗血清，每孔加入100微升，并平行设置对照孔，以阴性血清为阴性对照，以0.15摩尔每升PH 7.4的磷酸盐缓冲液作空白对照，37°C保温保湿2小时，洗涤三次，扣干；每孔加入100微升用0.15摩尔每升pH 7.4的磷酸盐缓冲液稀释5000倍的羊抗鼠IgG = HRP酶标二抗，37°C保温保湿2小时，每孔洗涤六次，扣干；每孔加反应底物液100微升，37 °C避光反应10-15分钟后，每孔加入50微升2摩尔每升硫酸溶液终止反应，5分钟后以空白对照孔调零，450 nm测吸光值；以两倍于阴性血清吸光值的抗血清测定值对应的抗血清稀释倍数为抗血清效价，结果如表1:` 表1黄曲霉毒素生物合成前体物ST抗血清效价测定结果
【权利要求】
1.杂交瘤细胞株ST03，其特征在于:它保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为 CCTCC N0.C2013187。
2.抗黄曲霉毒素生物合成前体物ST单克隆抗体，其特征在于:它是权利要求1所述的保藏编号为CCTCC N0.C2013187的杂交瘤细胞株ST03分泌产生。
3.权利要求2所述的抗黄曲霉毒素生物合成前体物ST单克隆抗体在黄曲霉毒素生物合成前体物ST含量测定中的应用。`
【文档编号】G01N33/577GK103849604SQ201410115952
【公开日】2014年6月11日 申请日期:2014年3月26日 优先权日:2014年3月26日
【发明者】李培武, 李敏, 张奇, 张兆威, 丁小霞 申请人:中国农业科学院油料作物研究所