本发明涉及食品安全风险监测领域，具体涉及一种薄层色谱联合高效液相色谱检测动物饲料中氯霉素含量的方法。
背景技术：
氯霉素为酰胺醇类抗菌药物，其具有抗菌谱广、抗菌效果好等优点，广泛用于畜禽呼吸道疾病的治疗。混饲给药是氯霉素在兽医临床上常见用法。毒理学研究表明，氯霉素对造血液系统具有明显的毒性，可引起再生障碍性贫血，因而已被我国禁止使用。然而在实际生产中，出于经济利益的驱使，在饲料中违规添加氯霉素的情况时有发生。非法添加氯霉素可能导致其残留于动物源性食品中，危害消费者健康和养殖业的可持续发展。为防止氯霉素的滥用，建立可靠且适合基层检测机构的定量分析方法很有必要。
采用酶联免疫分析技术、高效液相色谱和液相色谱-质谱联用技术检测动物饲料中氯霉素的定量分析方法已有文献报道。其中，高效液相色谱法具有检测结果可靠和检测成本低的优点，尤其适合基层检测单位。尽管如此，现有的高效液相色谱法缺乏有效的样品净化步骤，且样品前处理过程过于繁琐，有必要进行改良。例如《光谱实验室》2006年公开的《饲料中氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素含量的hplc测定方法》在样品前处理环节采用乙酸乙酯、水、正己烷反复萃取饲料中的氯霉素，样品前处理过于繁琐，且上述液-液萃取方法无法有效去除饲料中共存的氨基酸、色素等杂质，可能干扰随后的色谱分析。又如《analyticachimicaacta》杂志2008年公开的《determinationofoxytetracycline,tetracyclineandchloramphenicolantibioticsinanimalfeedsusingsubcriticalwaterextractionandhighperformanceliquidchromatography》采用亚临界水萃取结合固相萃取技术处理饲料样品，需要特殊的仪器设备，且检测成本较高，不利于向基层检测机构推广。
薄层色谱是一种经典的样品分离技术。与食品安全分析中常用的固相萃取技术相比，薄层色谱具有分离效果好，成本低廉，绿色环保的优点，非常适合用于生物样品和动物饲料等复杂基质中痕量化合物的分离纯化。李春香在《新型分离技术和高效液相色谱联合测定食品中苏丹红新方法的研究》一文中采用了薄层色谱净化复杂生物样品基质；吴文达等也将薄层色谱和高效液相色谱技术联合，用于检测饲料中玉米赤霉烯酮。尽管如此，将薄层色谱用于动物饲料中氯霉素的分析，这在国内外尚无文献报道。
薄层展开条件是薄层色谱分析的关键技术。薄层展开条件取决于目标化合物自身的理化性质和样品基质的特点。药物制剂和化妆品中氯霉素的薄层分析已有文献报道。如莫金娜等在《薄层色谱法检测化妆品中的氯霉素》一文中采用三氯甲烷-甲醇(85:15)的混合溶液作为展开条件；邢丽等在《薄层色谱法鉴别雌氯乳膏中氯霉素和己烯雌酚》中采用二氯甲烷-乙醚-甲醇-氨水(38:5:3:1)分离氯霉素和己烯雌酚；张志芬等在《tlc-uv法测定氯霉素注射液的含量》一文中提到了甲醇-乙醇(9:1)的展开条件；王刚林等在《氯霉素有关物质测定方法的建立》中使用氯仿-甲醇-水(80:20:5)作为展开条件。由于动物饲料组成远比化妆品和药物制剂复杂，上述展开条件并不一定能将饲料中内源性干扰物质和氯霉素分离开。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点与不足，提供一种可靠、简便、快速的薄层色谱联合高效液相色谱检测动物饲料中氯霉素含量的方法。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种薄层色谱联合高效液相色谱检测动物饲料中氯霉素含量的方法，包括以下步骤：
(1)在研磨后的动物饲料中加入乙酸乙酯，涡旋后离心。
(2)移取上清液，空气流吹干，先加入乙睛、涡旋，再加入乙睛饱和的正己烷、涡旋，离心，弃去上层正己烷。其中，上清液、乙睛、乙睛饱和的正己烷的体积比为(1-5):(0.05-0.1):(1-5)。
(3)将下层的乙腈层(饲料提取液)和氯霉素标准品分别点样于同一块gf-254硅胶薄层板的不同位置，于体积比二氯甲烷:丙酮:氨水等于(1-5):(5-9):(0.05-0.25)的混合液中展开至顶端。所述的氨水的浓度优选为25％-28％。
(4)将gf-254硅胶薄层板取出，待溶剂挥干后于254-360nm下检视，根据氯霉素标准品的展开距离标记饲料提取液中氯霉素的大致位置，刮取对应位置的硅胶。
(5)于刮取的硅胶中加入乙腈-水混合溶液，涡旋，离心，取上清，通过滤膜过滤。其中，乙腈-水混合溶液中乙腈与水的体积比为30:70-70:30。
(6)将过滤后的样品通过高效液相色谱检测氯霉素含量。其中，高效液相色谱流动相为乙腈与水按体积比为30:70-70:30组成的混合液。
优选的，步骤(1)中：动物饲料与乙酸乙酯的质量体积比为2-5g:20-100ml；研磨后的动物饲料的粒径为1-10mm；涡旋的时间为1-5min，离心的条件为3000-8000g离心2-5min。
优选的，步骤(2)中：空气流吹干的温度为45-60℃；两次涡旋的时间均为1-2min；离心的条件为3000-8000g离心2-5min。
优选的，步骤(5)中：涡旋的时间为1-3min；离心的条件为3000-8000g离心5-10min，滤膜为0.22μm有机滤膜。
优选的，步骤(6)中高效液相色谱的条件为：色谱分离在waterssymmetryc18色谱柱(250mm×4.6mmi.d，5μm)内完成，柱温为32-40℃，流动相流速为0.5-1ml/min，检测波长为250-280nm。
更优选的，所述的薄层色谱联合高效液相色谱检测动物饲料中氯霉素含量的方法，包括以下步骤：
(1)动物饲料经过研磨，过1-10mm筛；称取研磨、过筛的动物饲料样品2-5g，加入乙酸乙酯20-100ml，涡旋1-5min，3000-8000g离心2-5min。
(2)移取上清液1-5ml，45-60℃空气流吹干；加入乙睛50-100μl，涡旋1-2min；加入乙睛饱和的正己烷1-5ml，涡旋1-2min，3000-8000g离心2-5min，弃去上层正己烷。
(3)将下层乙睛层(饲料提取液)和氯霉素标准品点样于gf-254硅胶薄层板(10cm×10cm)的不同位置，于体积比二氯甲烷:丙酮:氨水(25％-28％)等于(1-5):(5-9):(0.05-0.25)的混合液中展开至顶端。
(4)将gf-254硅胶薄层板取出，待溶剂挥干后于254-360nm下检视，根据氯霉素标准品的展开距离标记饲料提取液中氯霉素的大致位置，刮取对应位置的硅胶。
(5)于刮取的硅胶中加入体积比乙睛:水等于30:70-70:30的混合液1-2ml，涡旋1-3min，3000-8000g离心5-10min，取上清，用0.22μm有机滤膜过滤。
(6)过滤后的样品通过高效液相色谱检测氯霉素含量。
一种薄层色谱分离动物饲料中氯霉素的方法，包括上述方法的步骤(1)-(4)。
上述方法中，动物饲料中的氯霉素采用标准曲线进行定量，具体为：称取含适量氯霉素的标准品加到10ml容量瓶中，用乙睛溶解、定容、摇匀，过0.22μm有机滤膜，备供试标品溶液用；其中“适量”氯霉素是指5-20mg。取供试标品，以流动相逐级稀释成系列浓度，每浓度标品以10-50μl进样，重复三次，以氯霉素浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，得到回归方程y＝278919x-1526.4，其中x为氯霉素浓度，y为峰面积；将所测样品经高效液相色谱检测到的氯霉素峰面积带入所述回归方程，经计算即可得到饲料中氯霉素含量。
本发明具有如下优点和有益效果：本发明以体积比二氯甲烷:丙酮:氨水(25％-28％)等于(1-5):(5-9):(0.05-0.25)的混合液作为展开液采用薄层色谱净化样品，显著提高了检测方法对动物饲料中其他物质的抗干扰能力，同时降低了检测成本，减少了有机溶剂的用量，定量分析结果可靠，适用于基层检测单位对饲料中的氯霉素进行日常监控。
附图说明
图1是展开液为体积比三氯甲烷:甲醇等于85:15的混合液时空白饲料与氯霉素标准物质的色谱图。
图2是展开液为体积比二氯甲烷:乙醚:甲醇:氨水(25％-28％)等于38.5:3:3:1的混合液时空白饲料与氯霉素标准物质的色谱图。
图3是展开液为体积比三氯甲烷:甲醇:乙酸乙酯:水等于15:6:15:1的混合液时空白饲料与氯霉素标准物质的色谱图。
图4是展开液为体积比甲醇:乙醇等于9:1的混合液时空白饲料与氯霉素标准物质的色谱图。
图5是展开液为体积比二氯甲烷:丙酮:氨水(25％-28％)等于1:9:0.25的混合液时空白饲料与氯霉素标准物质的色谱图。
图6是展开液为体积比二氯甲烷:丙酮:氨水(25％-28％)等于2:8:0.25的混合液时空白饲料与氯霉素标准物质的色谱图。
图7是展开液为体积比二氯甲烷:丙酮等于2:8的混合液时空白饲料与氯霉素标准物质的色谱图。
图8是展开液体积比二氯甲烷:丙酮:氨水(25％-28％)等于3:7:0.25的混合液时空白饲料与氯霉素标准物质的色谱图。
图9是展开液为体积比二氯甲烷:丙酮:氨水(25％-28％)等于4:6:0.25的混合液时空白饲料与氯霉素标准物质的色谱图。
图10是展开液为体积比二氯甲烷:丙酮:氨水(25％-28％)等于5:5:0.25的混合液时空白饲料与氯霉素标准物质的色谱图。
图11是实施例2-4不同样品的色谱图，其中，(a)为氯霉素标准物质(0.05μg/ml)，(b)为空白鸡饲料，(c)为添加氯霉素0.1mg/kg的鸡饲料，(d)为空白猪饲料，(e)为添加氯霉素0.1mg/kg的猪饲料，(f)为空白鱼饲料，(g)为添加氯霉素0.1mg/kg的鱼饲料。
具体实施方式
以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1不同薄层展开条件对本发明方法特异性的影响研究
一、方法
(1)动物饲料经过研磨，过10mm筛；称取研磨、过筛的动物饲料样品5g，加入乙酸乙酯50ml，涡旋2min，3000g离心5min。其中，动物饲料是包括猪、鸡、鱼饲料。猪饲料组成包括玉米63.4％(质量百分含量，下同)、豆粕25％、麦麸4.9％、鱼粉1.9％、豆油2％、食盐0.3％、矿物质(2.5％)；鸡饲料组成包括玉米56.8％、豆粕25％、鱼粉11.5％、豆油3.5％、食盐0.2％、石粉0.5％、矿物质2.5％；鱼饲料组成包括菜籽粉38％、豆粕15％、花生粕10％、小麦13.5％、棉籽粉10％、米糠12％、大豆油1.5％。
(2)移取上清液5ml，45℃空气流吹干；加入乙睛50μl，涡旋1min；加入乙睛饱和的正己烷5ml，涡旋1min，3000g离心2min，弃去上层正己烷。
(3)将下层乙睛层(饲料提取液)和氯霉素标准品点样于gf-254硅胶薄层板(10cm×10cm)的不同位置，于10种不同的展开液中展开至顶端。
(4)将gf-254硅胶薄层板取出，待溶剂挥干后于254nm下检视，根据氯霉素标准物质的展开距离标记饲料提取液中氯霉素的大致位置，刮取对应位置的硅胶。
(5)于硅胶中加入体积比乙睛:水等于33:67的混合液1ml，涡旋2min，8000g离心5min，取上清，用0.22μm有机滤膜过滤。
(6)过滤后的样品通过高效液相色谱检测氯霉素含量。检测在waters1525hplc系统中完成，该系统包括1525二元泵、2489uv检测器和2707自动进样器。色谱分离在waterssymmetryc18色谱柱(250mm×4.6mmi.d，5μm)内完成，柱温为32℃；流动相为乙腈与水按体积比为33:67组成的混合液，流速为0.6ml/min，流动相中的乙睛为色谱纯、水为纯化水；检测波长为278nm。
氯霉素采用标准曲线进行定量，通过高效液相色谱检测系列浓度氯霉素标品，以氯霉素浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，得到回归方程y＝278919x-1526.4，其中x为氯霉素浓度，y为峰面积；将所测样品经高效液相色谱检测到的氯霉素峰面积带入所述回归方程，经计算即可得到饲料中氯霉素含量。
二、结果
(1)展开液为体积比三氯甲烷:甲醇等于85:15的混合液时，空白饲料与氯霉素标准物质的色谱图如图1所示，由图1可知此展开条件下氯霉素保留时间附近存在强烈干扰。
(2)展开液为体积比二氯甲烷:乙醚:甲醇:氨水(25％-28％)等于38.5:3:3:1的混合液时，空白饲料与氯霉素标准物质的色谱图如图2所示，由图2可知此展开条件下氯霉素保留时间附近存在干扰。
(3)展开液为体积比三氯甲烷:甲醇:乙酸乙酯:水等于15:6:15:1的混合液时，空白饲料与氯霉素标准物质的色谱图如图3所示，由图3可知此展开条件下氯霉素保留时间附近存在强烈干扰。
(4)展开液为体积比甲醇:乙醇等于9:1的混合液时，空白饲料与氯霉素标准物质的色谱图如图4所示，由图4可知此展开条件下氯霉素保留时间附近存在强烈干扰。
(5)展开液为体积比二氯甲烷:丙酮:氨水(25％-28％)等于1:9:0.25的混合液时，空白饲料与氯霉素标准物质的色谱图如图5所示，由图5可知此展开条件下氯霉素保留时间附近无明显干扰，可作为候选条件。
(6)展开液为体积比二氯甲烷:丙酮:氨水(25％-28％)等于2:8:0.25的混合液时，空白饲料与氯霉素标准物质的色谱图如图6所示，由图6可知此展开条件下氯霉素保留时间附近无干扰，为最佳条件。
(7)展开液为体积比二氯甲烷:丙酮等于2:8的混合液时，空白饲料与氯霉素标准物质的色谱图如图7所示，由图7可知此展开条件下氯霉素保留时间附近存在强烈干扰，表明氨水的加入能增强饲料中弱酸性杂质的保留，显著提高方法的特异性。
(8)展开液为体积比二氯甲烷:丙酮:氨水(25％-28％)等于3:7:0.25的混合液时，空白饲料与氯霉素标准物质的色谱图如图8所示，由图8可知此展开条件下氯霉素保留时间附近无明显干扰，可作为候选条件。
(9)展开液为体积比二氯甲烷:丙酮:氨水(25％-28％)等于4:6:0.25的混合液时，空白饲料与氯霉素标准物质的色谱图如图9所示，由图9可知此展开条件下氯霉素保留时间附近无明显干扰，可作为候选条件。
(10)展开液为体积比二氯甲烷:丙酮:氨水(25％-28％)等于5:5:0.25的混合液时，空白饲料与氯霉素标准物质的色谱图如图10所示，由图10可知此展开条件下氯霉素保留时间附近无明显干扰，可作为候选条件。
实施例2鸡饲料中氯霉素的准确度和精确度试验
于15份空白鸡饲料(鸡饲料组成包括玉米56.8％(质量百分含量，下同)、豆粕25％、鱼粉11.5％、豆油3.5％、食盐0.2％、石粉0.5％、矿物质2.5％)中添加氯霉素标品，使成浓度为0.1、1.0、10.0mg/kg的添加样品，每个浓度重复操作3批，每批重复5个样品。按照实施例1中的最佳展开条件进行检测(色谱图见图11)，测得氯霉素的平均回收率为80.5-99.2％，日内相对标准偏差小于6.5％，日间相对标准偏差小于5.7％。准确度和精确度试验结果如表1所示。
表1鸡饲料中方法的准确度和精确度结果
以上结果表明，本发明的检测方法具有较高的准确度和精确度，可用于鸡饲料中氯霉素含量的测定。
实施例3猪饲料中氯霉素的准确度和精确度试验
于15份空白猪饲料(猪饲料组成包括玉米63.4％(质量百分含量，下同)、豆粕25％、麦麸4.9％、鱼粉1.9％、豆油2％、食盐0.3％、矿物质2.5％)中添加氯霉素标品，使成浓度为0.1、1.0、10.0mg/kg的添加样品，每个浓度重复操作3批，每批重复5个样品。按照实施例1中的最佳展开条件进行检测(色谱图见图11)，测得氯霉素的回收率为81.4-99.8％，日内相对标准偏差小于7.2％，日间相对标准偏差小于6.0％。准确度和精确度试验结果如表2所示。
表2猪饲料中方法的准确度和精确度结果
以上结果表明，本发明的检测方法具有较高的准确度和精确度，可用于猪饲料中氯霉素含量的测定。
实施例4鱼饲料中氯霉素的准确度和精确度试验
于15份空白鱼饲料(鱼饲料组成包括菜籽粉38％(质量百分含量，下同)、豆粕15％、花生粕10％、小麦13.5％、棉籽粉10％、米糠12％、大豆油1.5％)中添加氯霉素标品，使成浓度为0.1、1.0、10.0mg/kg的添加样品，每个浓度重复操作3批，每批重复5个样品。按照实施例1中的最佳展开条件进行检测(色谱图见图11)，测得氯霉素的平均回收率为82.0-100.2％，日内相对标准偏差小于7.0％，日间相对标准偏差小于6.2％。准确度和精确度试验结果如表3所示。
表3鱼饲料中方法的准确度和精确度结果
以上结果表明，本发明的检测方法具有较高的准确度和精确度，可用于鱼饲料中氯霉素含量的测定。
以上所述的实施例对本发明的技术方案和有益效果进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充和等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。