本发明属于食品检测技术领域，涉及一种利用mil-101磁性颗粒快速富集鉴别食品中菌株水平致病菌的方法，特别适合于液体食品中菌株水平致病菌的检测与鉴别。
背景技术：
面对当前严峻的食品安全问题，食源性菌株水平致病菌的快速分析与鉴别已经成为多学科研究的热点。在食品安全、生物防御以及临床诊断中，能够在“菌株”水平快速检测和鉴定致病菌是非常重要的。快速准确的检测鉴定能够为致病菌在致病性、流行性、变异性以及耐药性等方面提供重要信息，对于快速提出解决方案、控制疾病的传播及病原微生物的扩散具有重要意义，特别是对于追踪大范围食源性感染的来源及源头更是至关重要。面对食源性致病菌污染以及sars、禽流感等新发传染病袭击时，能否积极应对以及有效的控制和预防，与快速准确地检测和鉴别出致病微生物息息相关。
通常对于食源性致病菌的检测与鉴别分型，经典的生物化学方法是采用菌体培养法结合大量生化实验而进行表型鉴定，这种传统方法繁琐费时，且分辨力低，已不能很好地满足细菌感染诊断和流行病学溯源的需要。随着分子生物学技术的发展，16srrna测序在细菌分类鉴定中得到发展和应用，但只能局限于种、属的水平上的鉴别，而且该方法的成本高于经典生化方法，耗时超过24h。遗传病学研究中通常使用的生物分型技术如，脉冲场凝胶电泳(pfge)、扩增片段长度多态性技术(aflp)、重复序列聚合酶链反应(rep-pcr)以及多位点测序(mlst)等技术虽然能够提供准确的分型鉴定，但是这些方法同样具有耗时长、成本高、操作繁琐等弊端，而且还要求具备经验丰富的技术人员。鉴于此，目前迫切地需要一种更为快速、简便、经济的致病菌的检测与鉴别分型方法以便更好地适应食源性致病菌的控制预防、临床诊断和溯源追踪的需要。
由于食源性致病菌的基因序列信息最终会被翻译成相应的蛋白，基于蛋白图谱的细菌分类方法成为一个更好的选择，因此迫切需求一种高通量、高灵敏和高稳定的菌体蛋白检测技术。maldi-tof-ms(基质辅助激光解析电离飞行时间质谱)由于样品制备简单、分析速度和获取数据快、灵敏度高、特异性好以及成本低而成为细菌鉴定和分类领域的研究热点。被称为“微生物鉴定上的一次革命”。
当前，利用maldi-tofms分析微生物主要有两种方法分别是数据库法与生物信息学法。数据库鉴别法就是把待检测微生物与数据库中标准菌质谱图进行比对，满足阈值后来确定待测菌的种属。生物信息学法就是利用标准蛋白数据库对微生物蛋白标志物进行比对，从而对微生物进行分类鉴别。该方法中利用完整核糖体蛋白标志物鉴别微生物已被广泛报道。由于核糖体蛋白序列的保守行，tanigawa利用核糖体蛋白通过搜索核糖体蛋白鉴别数据库对25个乳酸乳球菌菌株进行鉴别。通过蛋白数据库可以快速鉴别菌株水平的细菌，规避了大量细菌鉴定生理生化实验。
另外，由于微生物在食品中浓度低，甚至为痕量。为了提高maldi-tofms检测预处理效率，功能性纳米材料已经被广泛应用于微生物的富集与鉴别，功能性纳米材料的富集可提高质谱检测的检测限与检测效率。这些纳米材料中磁性功能材料应用广泛，主要是通过在纳米fe3o4微粒表面固定靶向作用分析对微生物进行选择性富集，主要包括抗体、核酸适配体、生物蛋白、糖类物质。从而促进微生物的分离鉴别。
近些年来使用微波辅助技术在微生物与蛋白研究中已成为有效的方法。特别是磁性材料的吸波作用，当前，具有磁性的金属-有机骨架材料(metal-organicframeworks,mofs)已成为研究热点，mil-101，它是一种金属-有机骨架材料，是新型的具有孔道结构的多孔材料，其对各种蛋白具有极强的吸附性能。另外，当mil-101晶体加入fe3o4磁性粒子后，不仅带正电可以吸附到带负电的菌体上，而且通过fe3o4磁性粒子吸收微波能量增强微波破壁效果；另外，mil-101晶体具有多孔道可以富集破壁后溶液中的菌体蛋白，所以其具有双吸附功能。从而，可以加快致病菌maldi-tofms检测的预处理过程，并提高质谱的灵敏度和分辨率。最后，质谱的检测结果利用核糖体蛋白数据库快速鉴别菌株水平的致病菌。因此，该方法可以成为一种快速鉴别食品中菌株水平的致病菌的工具与手段。
技术实现要素：
本发明目的是解决现有技术在菌株水平致病菌的鉴别中耗时费力、检测步骤多的问题，提供一种利用双吸附快速鉴别食品中菌株水平致病菌的方法。本发明通过开发一种集破壁、富集、检测与鉴别为一体快速鉴别致病菌的方法，其利用带正电的mil-101磁性颗粒，对食源性菌株水平致病菌进行快速菌体富集、微波破壁和蛋白富集，然后利用maldi-tofms对其进行快速检测，再利用核糖体蛋白库对菌株水平致病菌进行鉴别，主要流程见图1。
本发明的技术方案
一种利用双吸附快速鉴别食品中菌株水平致病菌的方法，该方法的主要步骤包括：
1)利用mil-101磁性颗粒快速富集液体食品中致病菌，并辅助微波破壁。
2)致病菌破壁后，mil-101磁性颗粒快速富集致病菌蛋白。
3)maldi/tofms采集菌株水平致病菌蛋白质谱谱图。
4)tagident搜索工具(http://web.expasy.org/tagident/)对致病菌蛋白分子量进行数据库检索(uniprotkb/swiss-prot和uniprotkb/trembl)确定蛋白归属；并选取核糖体蛋白作为蛋白标志物。
5)利用得到的核糖体蛋白搜索微生物快速鉴别数据库(rapidmicroorganismidentificationdatabase；http://rmidb.org)确定致病菌菌株水平的归属。
本发明方法的具体操作内容主要如下：
第1、致病菌的破壁与蛋白富集
mil-101磁性颗粒与pbs缓冲液用量比为100mg：10-50ml配制的悬浊液20μl到1ml含有致病菌的待鉴别液体食品的离心管中，涡旋振荡3-10min，使mil-101磁性颗粒吸附到菌体表面，超纯水清洗，然后把离心管放入微波炉中，微波辐射10-100s破壁，振荡10-40min富集蛋白，磁性分离3-10min，去除上清，加入20μl的乙腈与0.1％三氟乙酸(体积比1-2：0.5-1)，涡旋震荡3-10min洗脱菌体蛋白，磁性分离3-10min，把1μl上清移到maldims靶盘待测；
第2、maldi/tofms检测
洗脱的菌体蛋白采用maldi/tofms线性模式进行分析，确定洗脱蛋白的分子量；
第3、致病菌菌株水平鉴别
第3.1、利用flexanalysis软件(version3.0；brukerdaltonics)对maldi/tofms的质谱图进行基线校正、平滑和标峰；
第3.2、然后利用tagident搜索工具(http://web.expasy.org/tagident/)对质谱峰进行数据库检索(uniprotkb/swiss-prot和uniprotkb/trembl)确定蛋白；并选取核糖体蛋白分子量；因为核糖体蛋白序列具有种属的保守性，不同菌株其核糖体蛋白不同，因此可作为致病菌的蛋白标志物；
第3.3、然后，利用得到的核糖体蛋白分子量搜索微生物快速鉴别数据库(rapidmicroorganismidentificationdatabase；http://rmidb.org)确定致病菌菌株水平归属。
本发明的优点和有益效果：
本发明利用带正电的mil-101磁性颗粒吸附带负电的细菌菌体，富集食品中致病菌，另外，mil-101磁性颗粒吸收微波，继而加强微波破壁的效果，辅助微波破壁，细菌破壁后，mil-101磁性颗粒能利用mil-101晶体的孔道富集蛋白，以提高质谱检测蛋白分辨率。
同时，maldi/tofms蛋白检测简单快速，可以迅速获取蛋白分子量。其中，核糖体蛋白具有种属的保守性，可作为致病菌的蛋白标志物，利于致病菌鉴别。
最后，利用核糖体蛋白数据库可以快速的确定致病菌的菌株水平的归属。
本发明提供的菌株水平致病菌的鉴别主要是利用mil-101磁性颗粒双吸附性能，并利用蛋白数据库对致病菌进行菌株水平的鉴别，克服了现有方法耗时费力、检测步骤多的问题，达到对致病菌菌株水平进行快速鉴别的目的，因此该方法开发和利用对于致病菌检测与食品安全具有重要意义。
附图说明
图1是mil-101磁性颗粒双吸附快速鉴别菌株水平致病菌流程图。
图2是mil-101磁性颗粒(fe3o4-cooh@mil-101)透射电镜图。
图3是maldi/tofms对mil-100磁性颗粒富集前后，碳酸饮料中大肠杆菌o157:h7效果的对比(菌浓为5×105cfuml-1)，其中，a：mil-101磁性颗粒未富集，b：mil-101磁性颗粒富集后。
图4是maldi/tofms对mil-101磁性颗粒富集后，碳酸饮料中大肠杆菌o157:h7(菌浓为5×103cfuml-1)检测，质谱图仅标注核糖体蛋白质谱峰。
图5是大肠杆菌o157:h7(菌浓分别为5×105cfuml-1与5×103cfuml-1)核糖体蛋白数据库鉴别结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1：
在37℃下，大肠杆菌o157:h7接种于25ml灭菌tsb培养基中，摇床120r·min-1培养16h后，1ml细菌菌悬液离心(12000r·min-1)5min，倒出上清，并用pbs缓冲液清洗两次，然后，把大肠杆菌稀释不同浓度，利用活菌计数法对其进行计数。同时，mil-101磁性颗粒(fe3o4-cooh@mil-101)可以独自合成也可市场购买(图2为mil-101磁性颗粒的透射电镜图)。
利用碳酸饮料，加入活菌计数完毕的不同浓度(5×105cfuml-1)的大肠杆菌o157:h7的菌悬液，然后利用fe3o4-cooh@mil-101富集与辅助微波破壁，maldi/tofms检测，并利用核糖体蛋白数据库进行菌株水平鉴别。图3是碳酸饮料中大肠杆菌fe3o4-cooh@mil-101富集效果的对比图，从图3可以看出，富集前后，maldi/tofms对蛋白的质谱峰的数量和强度检测效果非常明显。所得质谱峰用tagident搜索uniprotkb/swiss-prot和uniprotkb/trembl蛋白数据库，确认核糖体蛋白，再通过核糖体蛋白数据库(rapidmicroorganismidentificationdatabase；http://rmidb.org)对大肠杆菌o157:h7进行菌株水平鉴别，图5显示其鉴别结果。
实施例2：
利用碳酸饮料，加入活菌计数完毕的不同浓度(5×103cfuml-1)的大肠杆菌o157:h7的菌悬液，经过fe3o4-cooh@mil-101富集与辅助微波破壁，maldi/tofms检测，并利用核糖体蛋白数据库进行菌株水平鉴别。有9个核糖体蛋白被tagident搜索得到(见表1)，通过核糖体蛋白数据库(rapidmicroorganismidentificationdatabase；http://rmidb.org)可以对大肠杆菌o157:h7进行鉴别，图5为大肠杆菌o157:h7(菌浓为5×103cfuml-1)核糖体蛋白数据库鉴别结果。
表1大肠杆菌o157:h7蛋白swiss-prot/trembl数据库核糖体蛋白搜索结果a
a蛋白数据库检索匹配误差为±3da。