一种高纯度低密度脂蛋白的制备方法与流程

本发明属于物质提取技术领域，具体涉及一种高纯度低密度脂蛋白的制备方法。

背景技术：

血脂是血清中胆固醇、甘油三酯和类脂等的总称，血脂不溶于水，必须与载脂蛋白结合形成脂蛋白才能溶于血液，被运输至组织进行代谢。低密度脂蛋白胆固醇(low-densitylipoproteincholesterol，ldl-c)是血液中胆固醇含量(约50％)最多的脂蛋白，故ldl-c浓度基本能反应血液低密度脂蛋白(ldl)总量。另外，ldl能够被氧化为氧化型ldl(oxidizedlow-densitylipoprotein，ox-ldl)。

用于脂蛋白分析的三种常见超速离心法是：分析性超速离心、区带超速离心、制备性超速离心，在超速离心过程中各类脂蛋白因其密度不同而上浮速度各异，各类脂蛋白可通过依次增加血浆密度而分离。目前市场上用于科研的ldl主要分为冻干粉及液体两种保存形式。如实验需要高浓度ldl进行干预，冻干粉往往不能够被溶剂完全溶解，且冻干粉本身就容易造成ldl生物活性减低，而液体ldl的浓缩主要采用风干的方法，也容易影响其生物活性。ldl提取过程中加入大量溴化钾(kbr)调密度，需要透析后才能用于后续实验，但是ldl透析的时间各不相同，尚无统一标准。这与透析时ldl的体积与磷酸缓冲盐溶液(pbs)的体积比，换液时间间隔及次数，透析袋宽度等多个因素有关。并且很多实验室透析袋都是经过洗净、灭菌等步骤后回收利用的，这样对透析袋反复多次处理，会明显影响透析的效率。血浆ldl的常规提取量一般较少，如实验需大量ldl时，单个体单次采血量难以满足要求。但单个体多次采血、多个体单次采血或者多个体多次采血均不能保证ldl活性的批间差异，更无法保证实验结果的稳定性及可重复性。

技术实现要素：

为了克服上述现有技术的不足之处，本发明提供一种高纯度低密度脂蛋白的制备方法。

本发明是通过如下技术方案实现的：一种高纯度低密度脂蛋白的制备方法，采用超速离心机固定角式转头密度梯度离心法，通过溴化钾调整血浆密度，实现各类脂蛋白的逐层分离，利用琼脂糖凝胶电泳鉴定血浆低密度脂蛋白纯度，全自动生化分析仪测定低密度脂蛋白及k⁺浓度，渗透压仪检测透析前后低密度脂蛋白的渗透压，具体包括以下步骤：

根据密度不同离心去除血浆中的乳糜微粒、极低密度脂蛋白，提取剩余的血浆加入溴化钾调密度为1.045g/ml，再进行离心得到位于最上层的常规低密度脂蛋白，使用磷酸缓冲盐溶液透析降低k⁺浓度，低密度脂蛋白透析前后k⁺浓度的全自动生化分析仪所测结果与渗透压仪检测结果相比较，如透析至与磷酸缓冲盐溶液渗透压无明显差异，则认为溴化钾被完全透析，进而获取高纯度低密度脂蛋白。

进一步地，将上述步骤中离心得到位于最上层的常规低密度脂蛋白吸取后，提取第二层并加入溴化钾调密度为1.045g/ml，再次离心得到高浓度低密度脂蛋白。

进一步地，将上述步骤中离心得到位于最上层的常规低密度脂蛋白吸取后，提取第二层和第三层，并混合后加入超纯水调密度为1.045g/ml，再次离心获得纯度较高的低密度脂蛋白。

本发明采用固定角式转头密度梯度离心法，加入kbr调整血浆的密度，实现各类脂蛋白的逐层分离。再利用渗透压仪、全自动生化分析仪、琼脂糖凝胶电泳纯化及鉴定血浆ldl。提取的ldl透析至与pbs缓冲液渗透压无明显差异时，可以认为kbr已被完全去除；将第一次离心去除ldl的第二层调密度后，再次离心得高浓度ldl；混合第二、三两层或仅第二层调密度后，仍可离心得到高纯度ldl，提高了回收率。

具体的操作方法如下：

1、制备高纯度ldl的方法

取血浆(含1mmol/l乙二胺四乙酸)离心，4℃，20000rpm×2h除去cm，将其余部分混合后加入kbr调密度为1.025g/ml离心，4℃，50000rpm×12h除去vldl，收集剩下的血浆加入kbr调密度为1.045g/ml离心，4℃，50000rpm×12h得最上层的常规ldl。由于ldl提取过程中加入大量kbr，致使透析前k⁺浓度较正常高出数十倍，通过pbs缓冲液的反复多次透析后，k⁺浓度明显降低，对于如心肌细胞收缩功能测定、膜片钳钾通道的测定等无明显影响。将ldl透析前后k⁺浓度的全自动生化分析仪所测结果，与对应渗透压相比较发现，如透析至与pbs缓冲液渗透压无明显差异，则可以认为kbr被完全透析。

2、制备高浓度ldl的方法

取血浆(含1mmol/l乙二胺四乙酸)离心，4℃，20000rpm×2h除去cm，将其余部分混合后加入kbr调密度为1.025g/ml离心，4℃，50000rpm×12h除去vldl，收集剩下的血浆加入kbr调密度为1.045g/ml离心，4℃，50000rpm×12h得最上层的常规ldl，将其中的第二层吸出混合加入kbr调密度为1.045g/ml离心，4℃，50000rpm×12h，吸出淡黄色的上层液体，即为高浓度的ldl。对于部分需要高浓度ldl的实验，基本上无需浓缩即可使用。

3、提高ldl回收率的方法

取血浆(含1mmol/l乙二胺四乙酸)离心，4℃，20000rpm×2h除去cm，将其余部分混合后加入kbr调密度为1.025g/ml离心，4℃，50000rpm×12h除去vldl，收集剩下的血浆加入kbr调密度为1.045g/ml离心，4℃，50000rpm×12h得最上层的常规ldl。实验中除第一次加入kbr调密度为1.045g/ml所得常规ldl外，无论混合第二、三两层加入超纯水或仅第二层加入kbr调密度为1.045g/ml，亦可再次获得纯度较高的ldl，只是浓度有所差别。反复多次从血浆中提取ldl，可以明显提高其回收率。

本发明的方法在五个方面做了优化与改良：

一、目前市场上用于科研的ldl主要分为冻干粉及液体两种保存形式。如实验需要高浓度ldl进行干预，冻干粉往往不能够被溶剂完全溶解，且冻干粉本身就容易造成ldl生物活性减低，而液体ldl的浓缩主要采用风干的方法，也容易影响其生物活性。本发明首先离心去除cm与vldl，收集剩下的血浆调密度为1.045g/ml，离心得最上层的ldl，将其中的第二层吸出混合调密度为1.045g/ml，离心后吸出淡黄色的上层液体，即为高浓度的ldl。对于部分需要高浓度ldl的实验，基本上无需浓缩即可使用。

二、本发明采用全自动生化分析仪检测ldl的含量标定提取ldl的浓度。现今国际上通常采用bca试剂盒或lowry法测定ldl的蛋白含量，以蛋白量的大小来反应ldl中相应脂质量的大小。ldl主要是载脂蛋白apob和胆固醇酯组成的，而脂蛋白中胆固醇酯含量较为稳定，细胞吞噬大量脂质才会泡沫化，因此虽然测脂质不如测蛋白方便，但是测定ldl中胆固醇的方法作为脂蛋白的定量依据更为科学、严谨。

三、本发明将提取出的ldl溶液置入再生纤维素透析袋内，然后浸入pbs缓冲液中，通过pbs缓冲液的反复多次透析后，样品溶液中的大分子量的生物大分子被截留在袋内，而盐和小分子物质不断扩散透析到袋外，通过不断更换缓冲液，即可将样品中要除掉的小分子稀释到足够低的浓度。对于影响透析的多个因素本发明没有具体限定，而是就其透析完全的指标加以分析。最终通过全自动生化分析仪与渗透压仪确定透析的程度，以及是否达到后续实验的要求。正常血浆中k⁺浓度为3.5-5.5mmol/l，由于ldl提取过程中加入大量kbr，致使透析前k⁺浓度较正常高出数十倍。正常情况下细胞内的k⁺比细胞外高几十倍，当ldl中的大量kbr没有被完全透析而作为干预因素作用于细胞时，导致细胞内外k⁺浓度差变小，对心肌、骨骼肌、酸碱平衡等都会产生影响，如引起心肌兴奋性先升高后降低，传导性降低，自律性降低，收缩性减弱等。通过pbs缓冲液的反复多次透析后，k⁺浓度明显降低，对于如心肌细胞收缩功能测定、膜片钳钾通道的测定等才能不产生明显影响。

四、本发明将ldl透析前后k⁺浓度的全自动生化分析仪所测结果，与渗透压仪检测结果相比较发现，如透析至与pbs缓冲液渗透压无明显差异，则可以认为kbr被完全透析，ldl可以作为一种干预因素用于后续实验。与渗透压仪相比，全自动生化分析仪的检测成本高，耗时长，需要的样本量大。以pbs缓冲液渗透压为参照，采用渗透压仪测定ldl透析液的渗透压值就能便捷的反映ldl纯度。

五、本发明中除第一次加入kbr调密度为1.045g/ml所得ldl外，混合第二、三两层加入超纯水或仅第二层再次加入kbr调密度为1.045g/ml离心后，亦可再次获得纯度较高的ldl。序贯漂浮超速离心法虽然能够处理较大的血浆样本量，但是耗时很长。常规的密度梯度超速离心法主要优点就是大大缩短离心时间，但是它所能处理的血浆样本量较序贯漂浮超速离心法少得多，无法一次性制备大量脂蛋白样本，故脂蛋白的回收率较低。本发明采用超速离心机固定角式转头密度梯度离心法，反复多次从血浆中提取ldl，可以明显提高其回收率，为分离制备大量实验所用的脂蛋白样本成功地探索出一条新的途径。

本发明的有益效果是：1、ldl纯度高：通过pbs缓冲液的反复多次透析后，以pbs缓冲液渗透压为参照，采用渗透压仪测定ldl透析液的渗透压值可以便捷的反映ldl纯度。

2、ldl浓度高：将常规超速离心第一次所得ldl吸出后，第二层再次加入kbr调整密度后提取的ldl浓度显著高于之前第一次提取的ldl。

3、ldl回收率高：除常规超速离心第一次所得ldl，混合第二、三两层再次加入超纯水调密度后仍能离心得到高纯度的ldl。反复多次从血浆中提取ldl，可以明显提高ldl回收率。

附图说明

图1ldl苏丹黑b染色琼脂糖电泳图[1为正常血浆，2、3、4分别为c组、a组、b组提取的ldl]

图2ldl及ox-ldl苏丹黑b染色琼脂糖电泳图[1为正常血浆，2为b组提取的ldl，3、4、5分别为a组、b组、c组提取ldl氧化后的ox-ldl]

具体实施方式

下面根据附图和实施例对本发明进一步说明。

1、血浆分离：

在血浆中加入乙二胺四乙酸(edta)，终浓度为1mmol/l，3000rpm×20min，沉淀为血细胞，上清血浆待用。

2、cm分离：

离心机：beckmanavantij-e高速冷冻离心机；

转头，离心管：ja-20：20000rpm，18400×g，8×50ml；

离心参数：4℃，20000rpm×2h；

离心结果：cm呈白色上浮于液体的表面，或紧贴于离心管壁，小心吸出。

3、血浆脂蛋白的分离：

离心机：hitachicp-80wx超速离心机；

转头，离心管：p70at：70000rpm，505000×g，8×40ml，40pa管。

3.1、vldl分离：

血浆处理：将去除cm后的血浆混合，加入超纯水或kbr，调密度至1.025g/ml；

离心参数：4℃，50000rpm×12h；

离心结果：vldl浮于离心管的上层呈奶油状，约占上面无色透明层的1/2，用巴氏吸管仔细吸出。若血浆含有大量甘油三脂(＞1000mg/ml)，vldl则在管顶部形成淡黄色透明的胶状层。

3.2、ldl分离：

血浆处理：将去除vldl后的血浆混合，加入kbr，使最终密度为1.045g/ml；

离心参数：4℃，50000rpm×12h；

离心结果：大致可以分为三层：ldl形成一层淡黄色带浮于顶部为最上层(a组)，用巴氏吸管仔细吸出。第二层与第三层之间存在一条白色颗粒漂浮带。将上步离心吸出ldl后的剩余液体，分为两种不同方法处理：

(1)将第二层的液体吸出混合后，加入kbr，调密度至1.045g/ml。

离心参数：4℃，50000rpm×12h；

离心结果：大致分为两层：ldl浮于最上层为淡黄色(b组)，用巴氏吸管仔细吸出。第二层液体的黄色较ldl层稍深。

(2)将第二、三层的液体混合后，加超纯水，调密度至1.045g/ml。

离心参数：4℃，50000rpm×12h；

离心结果：大致可以分为三层：ldl浮于最上层为无色透明(c组)，用巴氏吸管仔细吸出。第二层与第三层之间仍存在一条白色颗粒漂浮带。

4、将上述所得ldl移入再生纤维素透析袋，两端用透析袋夹夹紧，放入0.01mol/l的pbs缓冲液(nacl138mm，kcl2.7mm，na2hpo410.14mm，kh2po41.76mm，ph＝7.4)中4℃透析5-8h，以除去离心过程中所加的抗氧化剂和大量的kbr。

5、经过上述处理后，根据是否进行后续氧化，可以对ldl做以下两种不同处理：

5.1、如不需氧化，将ldl以0.22μm滤膜过滤除菌后，保存于tris缓冲液(tris-hcl50mm，nacl0.15m，edta2mm，ph＝7.4)，4℃备用。

5.2、如需氧化，用pbs缓冲液将ldl稀释至蛋白浓度0.5mg/ml，加入终浓度为5μmol/l的新鲜配制的cuso4溶液，37℃孵育24小时后，放入0.01mol/l的pbs中4℃透析5-8h，以终止氧化反应。氧化前的ldl为淡黄色，氧化后一般黄色消失甚至出现乳白色，这是肉眼判断氧化成功的标准。将制备好的ox-ldl以0.22μm滤膜过滤除菌后，保存于tris缓冲液，4℃备用。

6、实验中测定ldl浓度(全自动生化分析仪)、渗透压(渗透压仪wescor5520，美国)及ox-ldl氧化修饰程度(琼脂糖凝胶电泳以及mda试剂盒，南京建成生物公司)。

7、统计学方法：

采用spss23.0统计分析软件进行统计学分析，定量资料以均数±标准差(mean±sd)表示，三组样本均数间比较采用单因素方差分析。p＜0.05为差异有统计学意义。

8、结果：

8.1、琼脂糖凝胶电泳结果：

三组不同方法提取的ldl经苏丹黑b染色后，均呈单条色带，证明三组不同方法提取的ldl纯度均较高(图1)。琼脂糖电泳时，apob中的赖氨酸残基与醛反应使ox-ldl相对带负电荷，其向阳极迁移，根据ox-ldl电泳距离和非氧化ldl的电泳距离之比的变化即相对电泳迁移率，判断其氧化修饰的程度。三组不同方法提取的ldl经氧化后，ox-ldl的相对电泳迁移率均加快，但是三组之间无明显差异(图2)。

8.2、硫代巴比妥酸反应物(tbars)测定：

脂质过氧化物(lpo)的分解产物丙二醛(mda)，在酸性环境下能与硫代巴比妥酸(tba)形成红色物质，可在532nm比色测定。测mda的含量与ox-ldl浓度之间没有关系，它主要说明ldl已经氧化以及氧化的程度，它的值不能代表ox-ldl的含量。我们实验中ox-ldl是ldltbars值的5-8倍，结合ox-ldl相对电泳迁移率的增加，说明ldl已经被氧化。

8.3、提取ldl浓度的全自动生化分析仪检测(表1)：

第一次调密度为1.045g/ml，离心后大致分为三层，通过琼脂糖凝胶电泳的结果，发现第一层为较纯的ldl，第二层以ldl为主及少量hdl，第三层以hdl为主及少量ldl，根据此线索又对上述样品进行了全自动生化分析仪的检测，结论与前面一致。按照方案中三种不同提取方法得到的ldl，分别进行全自动生化分析仪检测，结果发现三组之间ldl浓度有显著差异(p＜0.05)，b组＞a组＞c组(p＜0.05)。

表1ldl检测结果(mean±sd，n＝6)

8.4、提取ldl透析前后渗透压的改变(表2)：

ldl透析后渗透压较透析前明显降低(p＜0.05)，但是和pbs缓冲液相比无明显差异。与透析前及pbs缓冲液相比较，ldl透析后的k⁺浓度均明显减少(p＜0.05)。将ldl中含k⁺浓度的全自动生化分析仪所测结果，与对应渗透压相比较发现，如透析至与pbs缓冲液渗透压无明显差异，则可以认为kbr被完全透析，ldl可以作为一种干预因素用于后续实验。

表2ldl透析前后渗透压与k⁺浓度的改变(mean±sd，n＝6)