血清淀粉样蛋白A免疫层析试纸条、试剂盒及其制备方法与流程

本发明涉及检测试纸，特别是涉及血清淀粉样蛋白a免疫层析试纸条及其制备方法。
背景技术：
：血清淀粉样蛋白a(saa)是一种由肝脏分泌的急性时相蛋白，并与血浆中高密度脂蛋白(hdl)结合。当机体处于炎症状态时，saa的浓度会在数小时内迅速升高；同时saa半衰期非常短，随着炎症源的清除，saa的浓度水平又会迅速下降。在兽医学中，saa是一种灵敏的炎症和组织损伤标志物。现有的saa检测方法主要是酶联免疫法，化学发光法，胶体金免疫层析法等。目前tshd的检测方法主要有传统的放射免疫法，酶联免疫吸附方法，化学发光法。其中，放射免疫法和酶联免疫吸附方法的灵敏度不高，检测范围窄，抗干扰能力严重不足，检测时间长，致使临床价值受到很大的限制，已基本退出市场；而化学发光方法的灵敏度高，检测速度快，但是其成本高，血清样本量大，操作复杂，仅适合在大医院进行检测。中国专利201820668071.2用于检测猫血清淀粉样蛋白a的免疫荧光层析检测卡所述试剂盒包括底板，在底板上依次衔接有样品垫、结合垫、硝酸纤维膜和吸水垫，所述结合垫上设有荧光微球标记的saa单克隆抗体和荧光微球标记的羊抗鸡igy，所述的硝酸纤维膜设有一条包被saa单克隆抗体的检测t线，以及一条包被鸡igy的质控c线。但是该试剂盒需要10分钟得出结果，不适用于急诊检测的要求。技术实现要素：基于此，有必要针对传统的saa检测卡无法满足急诊要求的问题，提供一种血清淀粉样蛋白a免疫层析试纸条及其制备方法，不仅能够快速得出结果，而且采样量少，能够满足动物，尤其是身体机能受损的小动物的检测要求。一种血清淀粉样蛋白a免疫层析试纸条，包括样品垫、结合垫、反应膜、吸水垫，所述反应膜上设有相互间隔的检测线及质控线，所述检测线较所述质控线更靠近所述结合垫，所述结合垫上包被有分别用荧光微球标记的第一血清淀粉样蛋白a单克隆抗体和质控抗体，所述检测线包被有与所述第一血清淀粉样蛋白a单克隆抗体配对的第二血清淀粉样蛋白a单克隆抗体，所述质控线包被有能够与所述质控抗体特异性结合的抗原，以所述样品垫的表面面积计算，所述样品垫上包被有浓度为1μg/cm2～16μg/cm2非检测样品种属的抗体、0.2μg/cm2～16μg/cm2凝集素及1μg/cm2～16μg/cm2针对检测样品的异嗜性抗体的阻断剂。在其中一个实施例中，所述非检测样品种属的抗体、所述凝集素及所述阻断剂至少分布在所述样品垫的远离所述结合垫的一端。在其中一个实施例中，所述非检测样品种属的抗体、所述凝集素及所述阻断剂均匀分布在所述样品垫中。在其中一个实施例中，检测样品源为猫源，所述非检测样品种属的抗体选自非猫源igg。在其中一个实施例中，所述质控抗体选自与所述第一血清淀粉样蛋白a单克隆抗体同种属来源的igg。在其中一个实施例中，所述阻断剂选自非针对目标分析物的正常血清及scantibodieshbr中的任意一种或多种。在其中一个实施例中，以所述结合垫的表面面积计算，所述结合垫上包被的荧光微球标记的第一血清淀粉样蛋白a单克隆抗体的浓度为0.5μg/cm2～2μg/cm2，荧光微球标记的质控抗体的浓度为0.05μg/cm2～0.5μg/cm2。在其中一个实施例中，所述荧光微球的直径为350nm～500nm。在其中一个实施例中，所述样品垫、所述结合垫、所述检测线、所述质控线上分别独立地包被有糖、bsa及酪蛋白中的至少一种。在其中一个实施例中，以搭接后的结构计算，所述血清淀粉样蛋白a免疫层析试纸条中所述样品垫、所述结合垫、所述反应膜、所述吸水垫的长度比为1.6cm～2.8cm；所述血清淀粉样蛋白免疫层析试纸条的长度为7cm～8cm，宽度为3mm～4mm，厚度为0.1mm～1mm。一种血清淀粉样蛋白a免疫层析试纸条的制备方法，包括以下步骤：将浓度为1μg/cm2～16μg/cm2非检测样品种属的抗体、0.2μg/cm2～16μg/cm2凝集素及1μg/cm2～16μg/cm2针对检测样品的异嗜性抗体的阻断剂包被在样品垫上；将分别用荧光微球标记的第一血清淀粉样蛋白a单克隆抗体和质控抗体包被在结合垫上；将第二血清淀粉样蛋白a单克隆抗体包被在反应膜上形成检测线；将与所述质控抗体特异性结合的抗原包被在所述反应膜上形成与所述检测线相间隔的质控线；将样品垫、包被有分别用荧光微球标记的第一血清淀粉样蛋白a单克隆抗体和质控抗体的所述结合垫、具有所述检测线和所述质控线的所述反应膜及吸水垫搭接。一种血清淀粉样蛋白a免疫层析试剂盒，包括所述的血清淀粉样蛋白a免疫层析试纸条，还包括样品稀释液。上述血清淀粉样蛋白a免疫层析试纸条，将分别用荧光微球标记的第一血清淀粉样蛋白a单克隆抗体和质控抗体包被在结合垫上，能将反应体系的信号量放大，从而大大提高了灵敏度和准确性。血浆中的内源性异嗜性抗体，可结合其他种属的免疫球蛋白，包括作为免疫分析试剂的异源抗体，这些抗体会干扰免疫检验体系，造成与实际分析物浓度无关的虚高检测值，可能导致误诊，发明人发现，在样品垫上包被合适的浓度的非检测样品种属的抗体、凝集素及针对检测样品的异嗜性抗体的阻断剂，非检测样品种属的抗体起到被动阻断作用，以确保优先于分析物结合异嗜性抗体，能排除异嗜性干扰的一部分，而针对检测样品的异嗜性抗体的阻断剂是针对异嗜性抗体的主动阻断作用，有效中和其干扰，两种阻断作用的结合更加有效防止非分析物介导的抗体桥连。经实验发现，在样品垫上包被合适的浓度的非检测样品种属的抗体、凝集素及针对检测样品的异嗜性抗体的阻断剂能够明显提高检测效率，实现操作安全、简单、取样量少(低至10μl)、快速(低至3min)、灵敏度高的检测效果。特别适用于急诊检测，能快速判断病情，缩短治愈时间，真正实现即时检测。附图说明图1为本发明一实施例的血清淀粉样蛋白a免疫层析试纸条结构示意图；图2为本发明一实施例的血清淀粉样蛋白a免疫层析试纸条反应时间示意图；图3为本发明一实施例的血清淀粉样蛋白a免疫层析试纸条样本量选择示意图；图4为本发明一实施例的血清淀粉样蛋白a免疫层析试纸条检测线性拟合曲线示意图；图5为本发明一实施例的血清淀粉样蛋白a免疫层析试纸条检测相关性示意图。具体实施方式为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的
技术领域：
的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。“非检测样品种属的抗体”指的是与待检测样品种属来源不同的抗体。非检测样品种属的抗体能够与待检测样品中的内源性异嗜性抗体结合。“异嗜性抗体(heterophilantibody，ha)”是由已知的或未知的抗原物质刺激机体产生的一类具有足够滴度、能与多个物种的免疫球蛋白发生相对弱的结合的多重特异性的免疫球蛋白。这种抗体能和原抗原毫无关系的抗原起反应，这种与被检物质化学结构不同但活性相似的物质称为异嗜性抗体。异嗜性抗体可以与许多动物免疫球蛋白的片段结合，干扰试验，使测定结果与临床表现不符，导致错误结果出现。请参阅图1，本发明实施例提供一种血清淀粉样蛋白a免疫层析试纸条，包括样品垫1、结合垫2、反应膜4、吸水垫6，所述反应膜4上设有相互间隔的检测线3及质控线5，所述检测线3较所述质控线5更靠近所述结合垫2，所述结合垫2上包被有分别用荧光微球标记的第一血清淀粉样蛋白a单克隆抗体和质控抗体，所述检测线3包被有第二血清淀粉样蛋白a单克隆抗体，第一血清淀粉样蛋白a单克隆抗体、第二血清淀粉样蛋白a单克隆抗体分别与血清淀粉样蛋白a的不同表位结合，所述质控线5包被有能够与所述质控抗体特异性结合的与所述质控抗体特异性结合的抗原。以所述样品垫的表面面积计算，所述样品垫上包被有浓度为1μg/cm2～16μg/cm2非检测样品种属的抗体、0.2μg/cm2～16μg/cm2凝集素及1μg/cm2～16μg/cm2针对检测样品的异嗜性抗体的阻断剂。表面面积上述血清淀粉样蛋白a免疫层析试纸条，分别用荧光微球标记的血清淀粉样蛋白a单克隆抗体和质控抗体包被在结合垫2上，能将反应体系的信号量放大，从而大大提高了灵敏度和准确性。血浆中的内源性异嗜性抗体，可结合其他种属的免疫球蛋白，包括作为免疫分析试剂的异源抗体，这些抗体会干扰免疫检验体系，造成与实际分析物浓度无关的虚高检测值，可能导致误诊，发明人发现，在样品垫1上包被合适的浓度的非检测样品种属的抗体、凝集素及针对检测样品的异嗜性抗体的阻断剂，非检测样品种属的抗体起到被动阻断作用，以确保优先于分析物结合异嗜性抗体，能排除异嗜性干扰的一部分，而针对检测样品的异嗜性抗体的阻断剂是针对异嗜性抗体的主动阻断作用，有效中和其干扰，两种阻断作用的结合更加有效防止非分析物介导的抗体桥连。经实验发现，在样品垫1上包被合适的浓度的非检测样品种属的抗体、凝集素及针对检测样品的异嗜性抗体的阻断剂能够明显提高检测效率，实现操作安全、简单、取样量少(低至10μl)、快速(低至3min)、灵敏度高的检测效果。特别适用于急诊检测，能快速判断病情，缩短治愈时间，真正实现即时检测。在一些实施例中，该试纸条还包括底板7，所述样品垫1、所述结合垫2、所述反应膜4及所述吸水垫6设于所述底板7上，所述结合垫2的两端分别与所述样品垫1及所述反应膜4搭接，所述反应膜4远离所述结合垫2的一端与所述吸水垫6搭接。上述血清淀粉样蛋白a免疫层析试纸条工作时，待测样品与样品垫1接触，通过层析作用，依次层析至结合垫2和反应膜4。若待检测样品中含有血清淀粉样蛋白a，则样品中的血清淀粉样蛋白a先与结合垫2上的用荧光微球标记的第一血清淀粉样蛋白a单克隆抗结合形成反应复合物，然后在层析作用下，反应复合物沿着反应膜4向前移动，被反应膜4中的检测线3上包被的第二血清淀粉样蛋白a单克隆抗体所捕获。待检测样品中的血清淀粉样蛋白a越多，检测线3上积聚的结合后的复合物越多，显色就更加明显。例如标记微球选自荧光微球时，荧光信号的强度则反应了被捕获的血清淀粉样蛋白a的数量。反应复合物和用微球标记的质控抗体继续层析至质控线5，结合垫2上的质控抗体与质控线5中的与所述质控抗体特异性结合的抗原结合显色。若待检测样品中不含有血清淀粉样蛋白a，则结合垫2上的用荧光微球标记的第一血清淀粉样蛋白a单克隆抗体和检测线3包被的第二血清淀粉样蛋白a单克隆抗体均未与血清淀粉样蛋白a结合，因此检测线3不显色，用微球标记的质控抗体继续层析至质控线5，结合垫2上的质控抗体与质控线5中的与所述质控抗体特异性结合的抗原结合显色。若质控线5不显色，则说明血清淀粉样蛋白a免疫层析试纸条失效。在一些实施例中，所述非检测样品种属的抗体、所述凝集素及所述针对检测样品的异嗜性抗体的阻断剂至少分布在所述样品垫1的远离所述结合垫2的一端。在进行工作时，优选将待检测样品施加在该试纸条的样品垫1的起始端。因此，当待检测样品一施加到样品垫1上，凝集素拦截红细胞膜，非检测样品种属的抗体、针对检测样品的异嗜性抗体的阻断剂减少非特异性结合，能够对检测样品中的干扰物质进行拦截，避免干扰物的假阳性干扰。在一些实施例中，所述非检测样品种属的抗体、所述凝集素及所述针对检测样品的异嗜性抗体的阻断剂仅分布在所述样品垫1的远离所述结合垫2的一端，例如分布在所述样品垫1的前半段(远离结合垫2的一端)。在另一些实施例中，所述非检测样品种属的抗体、所述凝集素及所述针对检测样品的异嗜性抗体的阻断剂均匀分布在所述样品垫1中。样品垫1上包被的非检测样品种属的抗体的浓度可以为1μg/cm2、2μg/cm2、5μg/cm2、8μg/cm2、10μg/cm2、12μg/cm2、14μg/cm2或16μg/cm2。样品垫1上包被的凝集素的浓度可以为0.2μg/cm2、0.5μg/cm2、0.8μg/cm2、1μg/cm2、2μg/cm2、5μg/cm2、8μg/cm2、10μg/cm2、12μg/cm2、14μg/cm2或16μg/cm2。样品垫1上包被的针对检测样品的异嗜性抗体的阻断剂的浓度可以为1μg/cm2、2μg/cm2、5μg/cm2、8μg/cm2、10μg/cm2、12μg/cm2、14μg/cm2或16μg/cm2。样品垫1上包被的非检测样品种属的抗体、凝集素、针对检测样品的异嗜性抗体的阻断剂的浓度可以相同或不同。在一具体实施例中，检测样品源为猫源，所述非检测样品种属的抗体选自非猫源igg，例如鼠igg。非检测样品种属的抗体为非特异性抗体，仅限定该抗体的种属源为非检测样品种属。在一具体实施例中，所述质控抗体选自与所述第一血清淀粉样蛋白a单克隆抗体同种属来源的igg。在一具体实施例中，所述非检测样品种属的抗体选自鼠源igg，所述质控抗体选自羊抗兔igg，所述与所述质控抗体特异性结合的抗原选自兔igg。具体的，兔igg可选自兔抗鼠igg。在一些实施例中，所述针对检测样品的异嗜性抗体的阻断剂可选自非针对目标分析物的正常血清、正常igg、单克隆抗体及scantibodieshbr中的任意一种或多种。在一些实施例中，以所述结合垫2的表面面积计算，所述结合垫2上包被的荧光微球标记的血清淀粉样蛋白a单克隆抗体的浓度为0.5μg/cm2～2μg/cm2，荧光微球标记的质控抗体的浓度为0.05μg/cm2～0.5μg/cm2。在一些实施例中，所述荧光微球的直径为350nm～500nm。具体直径可以为350nm、380nm、400nm、450nm、500nm。在一些实施例中，所述样品垫1、所述结合垫2、所述检测线3、所述质控线5上分别独立地包被有糖、bsa及酪蛋白中的至少一种。试纸条上含有糖、大分子蛋白bsa、酪蛋白，它们均具有保护蛋白的作用，其次对于抗原抗体来说，这些试剂是小分子物质，小分子物质包裹着抗原抗体，不被易氧化，本发明的试纸条保存温度是4-30℃，可常温保存，大大降低了运输成本，使用方便。在一具体实施例中，底板7可选自pvc板。在一些实施例中，以搭接后的结构计算，血清淀粉样蛋白a免疫层析试纸条中所述样品垫1、所述结合垫2、所述反应膜4、所述吸水垫6的长度比为1.6cm～2.8cm。在一些具体实施例中，所述血清淀粉样蛋白免疫层析试纸条的长度为7cm～8cm，宽度为3mm～4mm，厚度为0.1mm～1mm。本发明的血清淀粉样蛋白免疫层析试纸条可减少非特异性干扰，检测样本类型可支持全血、血浆或血清，为用户提供多种选择。能定量检测样本中淀粉样蛋白a的含量，只需要使用小型仪器(干式免疫荧光检测仪)，灵敏度高，线性范围广，准确度高，与韩国安捷试剂的临床样本相关性r2在0.98，适合在中小型宠物医院普及。本发明实施例还提供一种血清淀粉样蛋白a免疫层析试剂盒，包括所述的血清淀粉样蛋白a免疫层析试纸条，还包括样品稀释液。在一具体实施例中，样本稀释液中包括表面活性剂s9、nacl、曲拉通、pc300和pb。表面活性剂s9质量浓度可以为0.5％～2％，nacl摩尔浓度可以为0.2m～0.5m，曲拉通质量浓度可以为0.5％～2％，pc300质量浓度可以为0.2％～0.5％，pb摩尔浓度可以为0.015m～0.025m。该血清淀粉样蛋白a免疫层析试剂盒可包括卡壳，用于盛置该血清淀粉样蛋白a免疫层析试纸条。本发明实施例还提供一种血清淀粉样蛋白免疫层析试纸条的制备方法，包括以下步骤：将浓度为1μg/cm2～16μg/cm2非检测样品种属的抗体、0.2μg/cm2～16μg/cm2凝集素及1μg/cm2～16μg/cm2针对检测样品的异嗜性抗体的阻断剂包被在样品垫1上；将分别用荧光微球标记的第一血清淀粉样蛋白a单克隆抗体和质控抗体包被在结合垫2上；将第二血清淀粉样蛋白a单克隆抗体包被在反应膜4上形成检测线3；将与所述质控抗体特异性结合的抗原包被在所述反应膜4上形成与所述检测线3相间隔的质控线5，所述与所述质控抗体特异性结合的抗原能够与所述质控抗体特异性结合；将样品垫1、吸水垫6、包被有分别用微球标记的第一血清淀粉样蛋白a单克隆抗体和质控抗体的所述结合垫2及具有所述检测线3和所述质控线5的所述反应膜4设于底板7上，得到所述血清淀粉样蛋白a检测免疫试纸，所述结合垫2的两端分别与所述样品垫1及所述反应膜4搭接，所述反应膜4远离所述结合垫2的一端与所述吸水垫6搭接，所述检测线3较所述质控线5更靠近所述结合垫2。在其中一些实施例中，样品垫1可采用如下方法制备：配制样品垫1处理液：含0.5mg/ml～2mg/ml非检测样品种属的抗体、0.1mg/ml～2mg/ml凝集素及0.5mg/ml～2mg/ml针对检测样品的异嗜性抗体的阻断剂。将样品垫1处理液喷涂于玻璃纤维上，制得。进一步，样品垫1处理液中包括体积分数为0.5％～1％的伊文斯兰。进一步，所述样品垫1处理液含有体积分数为0.5％～3％的吐温-20,0.5％～3％酪蛋白钠盐，2％～5％的bsa，0.2％～0.5％pc300，0.015m～0.025mpb。其中，包被有分别用荧光微球标记的第一血清淀粉样蛋白a单克隆抗体和质控抗体的结合垫2是采用如下方法形成的：将分别用荧光微球标记的第一血清淀粉样蛋白a单克隆抗体和质控抗体包被在结合垫2上。在其中一些实施例中，具体步骤包括：将第一血清淀粉样蛋白a单克隆抗体或质控抗体分别加入荧光微球溶液混合，分离取沉淀，进行封闭处理。进一步地，封闭处理的封闭液为0.5％-2％bsa的0.01mtris缓冲液。在一些示例中，荧光微球在与第一血清淀粉样蛋白a单克隆抗体或质控抗体混合前，包括对荧光微球清洗、活化和活化终止的步骤。具体地，清洗步骤采用的清洗液为tris缓冲液，进一步地，其浓度为0.01m。更进一步地，清洗步骤采用超声清洗。具体地，活化步骤所采用的试剂有5-10mg/ml活化剂a和5-10mg/ml活化剂b，其中活化剂a为的n-羟基琥珀酰亚胺，活化剂b为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐。具体地，活化终止步骤所采用的终止液为0.1-0.5％甲醇的0.1mmes缓冲液。荧光微球溶液的制备为：将荧光微球与微球稀释液混合。具体地，微球稀释液含有体积分数为0.5％-3％的吐温-20，2％-5％的bsa，5-20％蔗糖，0.5-2％酪蛋白钠盐，0.2％-0.5％pc300，0.02mpb缓冲液。相比于胶体金纳米颗粒，采用荧光乳胶颗粒作为标记物，能够借助于定量分析仪实现定量检测猫血清淀粉样蛋白a，不仅填补了目前市场上没有荧光免疫层析定量检测猫血清淀粉样蛋白a的空白，同时也提高了检测灵敏度和准确度，并且将定量检测时间大大缩短，具有快速、简单、现场、干扰小等优点。其中，具有检测线3和质控线5的反应膜4可采用如下方法制得：将第二血清淀粉样蛋白a单克隆抗体包被在反应膜4上形成检测线3；将与所述质控抗体特异性结合的抗原包被在反应膜4上形成与检测相间隔的质控线5。在一些实施例中，吸水垫6的制备：将吸水纸裁剪至每条的规格为30cm*2.4cm。在一些实施例中，将上述反应膜4、吸水垫6、样品垫1及结合垫2粘贴在底板7上，组装形成血清淀粉样蛋白a的荧光免疫层析试纸条。以下为具体实施例(％均指的是质量分数)。本实施例提供一种用于定量检测猫血清淀粉样蛋白a的荧光免疫层析试剂盒，包括卡壳、试剂条、样本稀释液，卡壳内设有用于检测猫血清淀粉样蛋白a的免疫层析试纸条，参阅图1，试纸条由下至上一次设有：pvc板、样品垫1、标记物结合垫2、反应膜4和吸水垫6，其中标记物结合垫2上吸附有荧光微球标记的猫血清淀粉样蛋白a单克隆抗体(第一血清淀粉样蛋白a单克隆抗体)以及羊抗兔igg，荧光微球的直径为400nm；反应膜4上设有一条包被猫血清淀粉样蛋白a(第二血清淀粉样蛋白a单克隆抗体)的检测线3(t线)，以及一条包被兔igg的质控线5(c线)。样本稀释液为含0.5％s9，0.5mnacl，1％曲拉通，0.5％pc300，0.02mpb缓冲液。反应膜4的包被处理：用含5％海藻糖的0.01mpb(ph＝7.4)将猫血清淀粉样蛋白a单克隆抗体稀释到0.5mg/ml，为检测线3(t线)的工作液；用含5％海藻糖的0.01mpb(ph＝7.4)将兔igg稀释到0.5mg/ml，为质控线5(c线)的工作液；将反应膜4贴在pvc板上，在膜上划检测线3和质控线5，划膜的出液量为0.5-2ul/cm，放置于50℃烘干24h。样品垫1的制备：a、配制样品垫1稀释液：鼠igg1mg/ml、伊文斯兰1％、凝集素1mg/ml、1mg/ml针对检测样品的异嗜性抗体的阻断剂、1％的吐温-20，3％的bsa，0.4％pc300，0.02mpb缓冲液；b、将步骤a中的样品垫1稀释液均匀喷在玻璃纤维上，过夜烘干。结合垫2的制备：配置含有15％荧光微球标记的猫血清淀粉样蛋白a单克隆抗体以及羊抗兔igg的荧光微球稀释液，以8ul/cm的速度喷在玻璃纤维上，荧光微球稀释液含有2％的吐温-20，5％的bsa，10％蔗糖，1％酪蛋白钠盐，0.4％pc300，0.02mpb缓冲液，过夜烘干。上述荧光微球标记的猫血清淀粉样蛋白a单克隆抗体和羊抗兔igg的制备方法为：1.清洗荧光微球：用移液枪吸取1ml荧光微球，12000rpm离心15min,弃上清，加入1ml清洗缓冲液，超声混匀。2.活化荧光微球：在步骤1离心管中加入1ml活化缓冲液，在旋转混匀仪上混匀20min。3.活化终止：将步骤2中的荧光微球15000rpm离心15min，弃上清，加入1ml终止液，超声混匀。4.标记抗体：将步骤3中的荧光微球加入0.5mg的抗猫血清淀粉样蛋白a单克隆抗体和羊抗兔igg，在旋转混匀仪上混匀80min。5.封闭：将步骤4中的荧光微球加入1ml封闭液，超声混匀，在旋转混匀仪上混匀30min。6.终洗：将步骤4中的荧光微球15000rpm离心15min，弃上清，加入1ml荧光微球稀释液，超声混匀。上述荧光微球直径是400nm，所述的荧光微球包裹荧光素。上述的清洗缓冲液为0.01mtris缓冲液；活化缓冲液是含5-10mg/ml活化剂a和5-10mg/ml的活化剂b的0.01mtris缓冲液，活化剂a是n-羟基琥珀酰亚胺，活化剂b是1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；终止液是含0.4％甲醇的0.1mmes缓冲液；封闭液是含1％bsa的0.01mtris缓冲液；荧光微球稀释液含有2％的吐温-20，5％的bsa，10％蔗糖，1％酪蛋白钠盐，0.4％pc300，0.02mpb缓冲液。1、检测试剂盒反应时间的选择：采用上述方法制备的试剂盒，测定saa参考品0mg/l，5mg/l,160mg/l,320mg/l四个浓度，分别在2、3、5、10、15分钟时，对同一浓度进行测试，并比较t/c与浓度的灵敏度以及线性，选择最佳测试时间，其中，检测值用比值t/c表示如下表1和图2。表1浓度mg/l05160320测试时间t/ct/ct/ct/c2min0.02210.03451.72313.23113min0.04380.12642.44104.86555min0.04410.11212.34134.507910min0.04310.12892.46114.713915min0.04010.12572.96434.0490结果显示：根据灵敏度以及线性范围5-300mg/l，该试剂在2min，3min，5min，10min，15min测试时，相比较灵敏度，3min即可达到灵敏度的要求，无需延长到10min。2、检测试剂盒样本量的选择：采用上述方法制备的试剂盒，测定saa参考品0mg/l，5mg/l，160mg/l，320mg/l四个浓度，分别在5ul、10ul、20ul、40ul，对同一浓度进行测试，并比较t/c与浓度的灵敏度以及线性，选择最佳测试时间3min，其中，检测值用比值t/c表示如下表2和图3。表2浓度mg/l05160320测试样本量t/ct/ct/ct/c5ul0.04210.13452.82313.231110ul0.04380.12642.44104.865520ul0.03510.03132.34524.555140ul0.03330.32892.46114.7139结果显示：根据灵敏度以及线性范围5-300mg/l，样本量选择为10ul即可达到高灵敏度要求。3、拟合线性方程：采用上述方法制备的试剂盒，将猫血清淀粉样蛋白a参考品用阴性稀释液配制成不同浓度，分别稀释为0mg/l,5mg/l,15mg/l,40mg/l,70mg/l,120mg/l,160mg/l,320mg/l，对各个校准品分别取10微升，加入400微升的稀释液中混匀，用移液枪取75微升滴加到加样孔进行测定，猫血清淀粉样蛋白a参考品的浓度以及对应的检测限信号值和质控线5信号值如表1所示，其中，检测限信号值和质控线5信号值分别用t和c表示，并计算每个浓度的t/c的平均值，以t/c的平均值为纵坐标，猫血清淀粉样蛋白a参考品为横坐标，建立方程并拟合线性回归曲线，线性回归曲线如下表3和图4。表3猫血清淀粉样蛋白a校准品不同浓度对应的检测限信号值和质控线5信号值线性拟合方程结果显示：试剂在检测范围5-300mg/l，saa线性拟合相关系数r大于0.99。4、精密度：随机抽取同一批号的试剂盒，取15mg/l、70mg/l两个水平的的参考品，每个浓度测试10张试剂卡计算样本测定结果均值和批内精密度变异系数(cv)，如表4。表4结果显示：本试剂盒的批内精密度较好，检测两个浓度的参考品的批内精密度变异系数(cv)小于15％。5、准确度：对浓度为8mg/l、70mg/l、160mg/l的saa参考品进行测定，每个浓度各检测3次计算样本测定结果均值和相对偏差，如表5。表5结果显示：本试剂盒的准确度较好，检测3个浓度的参考品的相对偏差bias％在±15％内。6、在不同时间内，常温保存的试剂盒进行检测的数据：将试剂盒常温保存3个月、6个月、12个月、18个月、24个月，分别检测校准品8mg/l、40mg/l、160mg/l，稳定性检测结果如表6。表6小结：试剂盒常温保存24个月后，相对偏差bias％在±15％内，试剂盒可以常温保存2年。7、可靠性：在相同的测试条件下，用本发明实施例试剂盒与配套仪器(干式荧光免疫试剂盒)进行样本测试，并与韩国安捷vcheck试剂进行相关性比较(vcheck的fsaa试剂盒是宠物行业界的知名检测试剂盒，其精密度和结果公认可靠)，如表7和图5。表7样本编号vcheck(ug/ml)本试剂测试值mg/l156.5213.4823.7355.4450.4758.59557.5611.525.8712.4822.58110.48120.45915.6525.471050.4855.0111108.78118.591250.2655.8913511.51468.9165.4815117.912016200224.181792.1591.07181341421956.142057.82155.6969.152255.182356.52455.52599.4795.4826178.48201.227108.15111.45286.515.2295.911.48305.153185.1489.593265.4855.183344.543.653455.535110.5123.4736200230.1437200198.17382001953914.5826.144055.2小结：本发明的试剂盒测定结果与韩国安捷vcheck仪器及配套试剂盒测定的结果，相关系数为r2＝0.9839，相关性较好，可用于临床诊断。对照例1对照例1与实施例基本相同，区别仅在于将样品垫1稀释液不喷在样品垫1上，均匀喷在结合垫2上。即，结合垫2的制备方法：配置含有15％荧光微球标记的猫血清淀粉样蛋白a单克隆抗体以及羊抗兔igg的荧光微球稀释液，以8ul/cm的速度喷在玻璃纤维上干燥后形成结合垫2；然后将样品垫1稀释液均匀喷在结合垫2上，随后干燥。检测试剂盒反应时间的选择结果和样本量选择结果分别如表8、表9所示。表8浓度mg/l05160320测试时间t/ct/ct/ct/c2min0.02110.02150.92411.52513min0.02380.02040.95401.15805min0.02100.02021.34131.907910min0.03310.12382.36114.513915min0.04010.12572.56434.5490表9浓度mg/l05160320测试样本量t/ct/ct/ct/c5ul0.01280.01040.82411.125110ul0.02990.02001.97542.058020ul0.03000.12192.52304.507940ul0.04010.12892.45614.8139对照例1试验结果：表8根据灵敏度以及线性范围5-300mg/l，该试剂在2min，3min，5min，10min，15min测试时，测试时间至少10min才可达到灵敏度的要求；表9根据灵敏度以及线性范围5-300mg/l，样本量选择至少20ul才可达到高灵敏度要求。对照例2对照例2与实施例基本相同，区别仅在于将样品垫1稀释液不喷在样品垫1上，样品垫1和结合垫2之间设置增强垫，样品垫1稀释液以8ul/cm的速度均匀喷在玻璃纤维上并经干燥形成该增强垫。检测试剂盒反应时间的选择结果和样本量选择结果分别如表10、表11所示。表10浓度mg/l05160320测试时间t/ct/ct/ct/c2min0.01010.02340.84510.82513min0.02920.02051.56501.85805min0.02510.02001.45301.502910min0.02420.12381.46111.712215min0.03610.12012.56434.5249表11浓度mg/l05160320测试样本量t/ct/ct/ct/c5ul0.021080.02101.82411.925110ul0.023020.02002.17542.535820ul0.03180.13122.44454.517940ul0.04580.13982.55614.7139对照例2试验结果：表10根据灵敏度以及线性范围5-300mg/l，该试剂在2min，3min，5min，10min，15min测试时，测试时间至少15min才可达到灵敏度的要求；表11根据灵敏度以及线性范围5-300mg/l，样本量选择至少20ul才可达到高灵敏度要求。对照例3对照例3与实施例基本相同，区别仅在于将样品垫1稀释液不喷在样品垫1上，结合垫2和反应膜4之间设置增强垫，样品垫1稀释液以8ul/cm的速度均匀喷在玻璃纤维上并经干燥形成该增强垫。检测试剂盒反应时间的选择结果和样本量选择结果分别如表12、表13所示。表12浓度mg/l05160320测试时间t/ct/ct/ct/c2min0.01010.02341.14511.17813min0.02920.02051.56501.45985min0.02510.05001.4531.478410min0.02420.080891.86111.912215min0.04610.126452.56434.5490表13浓度mg/l05160320测试样本量t/ct/ct/ct/c5ul0.02280.021351.12811.125110ul0.02220.020211.84541.575820ul0.01100.010302.14453.517940ul0.03560.12852.54614.5139对照例3试验结果：表12根据灵敏度以及线性范围5-300mg/l，该试剂在2min，3min，5min，10min，15min测试时，测试时间至少15min才可达到灵敏度的要求；表13根据灵敏度以及线性范围5-300mg/l，样本量选择至少40ul才可达到高灵敏度要求。对照例4对照例4与实施例基本相同，区别仅在于样品垫1稀释液中不含有针对检测样品的异嗜性抗体的阻断剂。检测试剂盒反应时间的选择结果和样本量选择结果分别如表14、表15所示。表14浓度mg/l05160320测试时间t/ct/ct/ct/c2min0.53210.51553.72313.87113min0.53380.53543.51114.86555min0.50610.51473.34134.980710min0.54530.53623.36414.799315min0.52010.50253.16434.519表15浓度mg/l05160320测试样本量t/ct/ct/ct/c5ul0.50160.52143.12313.231110ul0.53420.55803.34103.865520ul0.50050.51213.27523.555140ul0.51480.52853.32113.7139对照例4试验结果：该试剂样品垫溶液中在不含针对检测样品的异嗜性抗体的阻断剂的情况下，血浆中的内源性异嗜性抗体，可结合其他种属的免疫球蛋白，包括作为免疫分析试剂的异源抗体，这些抗体会干扰免疫检验体系，造成与实际分析物浓度无关的虚高检测值，表14在测试时间2min～15min的线性范围为均无法达到试剂的线性范围5-300mg/l；表15样本量5ul～40ul均无法达到试剂的线性范围5-300mg/l。对照例5对照例5与实施例基本相同，区别仅在于样品垫1稀释液中不含有鼠igg。检测试剂盒反应时间的选择结果和样本量选择结果分别如表16、表17所示。表16浓度mg/l05160320测试时间t/ct/ct/ct/c2min0.64210.62153.62093.79903min0.63380.62544.51484.86515min0.62610.61214.3654.807010min0.61130.62894.354114.899315min0.61010.61254.36434.799表17浓度mg/l05160320测试样本量t/ct/ct/ct/c5ul0.62160.61453.62313.939010ul0.63790.63484.45414.765520ul0.65150.62214.57524.555140ul0.64580.659954.52114.7139对照例4试验结果：该试剂样品垫溶液中在不含有鼠igg的情况下，血浆中的内源性异嗜性抗体，可结合其他种属的免疫球蛋白，包括作为免疫分析试剂的异源抗体，这些抗体会干扰免疫检验体系，造成与实际分析物浓度无关的虚高检测值，表16在测试时间2min～15min的线性范围为均无法达到试剂的线性范围5-300mg/l；表17样本量5ul～40ul均无法达到试剂的线性范围5-300mg/l。对照例6对照例6与实施例基本相同，区别仅在于样品垫1稀释液中不含有凝集素。检测试剂盒反应时间的选择结果和样本量选择结果分别如表18、表19所示。表18浓度mg/l05160320测试时间t/ct/ct/ct/c2min0.73210.73052.69912.97113min0.73380.73543.48254.96555min0.75610.70213.340134.888010min0.74530.73893.360014.874915min0.76010.70253..36434.6541表19浓度mg/l05160320测试样本量t/ct/ct/ct/c5ul0.70160.71052.22312.229110ul0.73420.73083.44104.555520ul0.71480.71213.35504.655140ul0.71580.72853.34514.7852对照例4试验结果：该试剂样品垫溶液中在不含凝集素的情况下，血浆中的内源性异嗜性抗体，可结合其他种属的免疫球蛋白，包括作为免疫分析试剂的异源抗体，这些抗体会干扰免疫检验体系，造成与实际分析物浓度无关的虚高检测值，表18在测试时间2min～15min的线性范围为均无法达到试剂的线性范围5-300mg/l；表19样本量5ul～40ul均无法达到试剂的线性范围5-300mg/l。以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。当前第1页12