一种检测肿瘤标志物的三维石墨烯修饰电极及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物电化学检测技术领域，具体涉及一种检测肿瘤标志物的三维石墨 稀修饰电极及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 肿瘤相关标志物的分析检测对疾病的有效诊断与治疗具有十分重要的意义。因 此，如何快速、高效、灵敏地检测这些标志物，就成为了当前生命科学领域中所面临的一个 十分重要的问题。显然，解决这个问题的关键就在于发展各种新型的分析检测技术。生物 传感器的出现为有效地解决这些问题提供了新的工具，为生命科学及其相关领域的研究提 供了许多新的方法。
[0003] 生物传感器是由固定化的生物敏感材料（包括酶、抗体、核酸等生物活性物质）作 识别元件，对生物物质敏感并将其浓度转换为电信号进行检测的仪器。电化学生物传感器 是指在生物传感器的基础上，以电极作为转换元件，以电势或电流为特征检测信号的传感 器。因其具有选择性好、灵敏度高、分析速度快、成本低的特点，使其在近几十年获得蓬勃而 迅速的发展。
[0004] 电化学生物传感器中所用电极对检测的灵敏度有着至关重要的作用。基于三维石 墨烯的独特性能（如多孔性、表面积大、突出的电子传导性能及传质快），采用氮掺杂三维 石墨烯修饰金电极，用于生物传感器，在一定程度上提高了该生物传感器的检测性能。
【发明内容】
[0005] 针对上述现有技术，本发明提供了一种检测肿瘤标志物的三维石墨烯修饰电极的 制备方法，该制备方法简单，制备条件易于控制和实现。
[0006] 本发明还提供了 一种三维石墨烯修饰电极。
[0007] 本发明还提供了一种该三维石墨烯修饰电极用于检测肿瘤标志物的应用。
[0008] 本发明是通过以下技术方案实现的：
[0009] -种检测肿瘤标志物的三维石墨烯修饰电极的制备方法，包括以下步骤：
[0010] (1)将金电极预处理；
[0011] (2)将预处理后的金电极浸没在0. 5mM的4-氨基对苯硫酚的乙醇溶液中，静置反 应1~3h ;
[0012] (3)将氧化石墨烯溶于水中，得氧化石墨烯溶液，超声分散均匀后，加入氨水；其 中，所用氨水的质量浓度为25 %~28% ;
[0013] (4)将步骤（2)中电极取出，用乙醇溶液冲洗干净，浸没到步骤（3)所得溶液和 1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺（EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS)的混合溶液中，室 温条件下，反应6~8h ;然后，将以上反应体系放入到反应釜中，在140~180°C的条件下， 反应6~8h ;待反应结束后，将电极取出，用蒸馏水将电极洗涤干净后将其冷冻干燥，即得 三维石墨稀修饰电极。
[0014] 步骤⑴中，金电极预处理过程：先后用0· 5 μπι和(λ 03 μπι的Al2O3粉末打磨 成镜面，然后用二次水清洗，再依次置于乙醇和二次水中超声1~2min;处理完成后， 用0. 5mol · L 1的浓硫酸对电极进行活化，直到产生稳定的循环伏安扫描图，扫描电压为 0. 20~I. 65V，扫速为0.1 V · s %最后用二次水冲洗，室温干燥。
[0015] 步骤（3)中，氧化石墨烯的制备方法：在冰水浴条件下，将0. 6g石墨、1.0 g硝酸钠 混合，搅拌条件下，缓慢加入35mL冷冻浓硫酸，搅拌0. 5~1小时；在0. 5~1小时内加入 3. Og高锰酸钾，在0~10°C下搅拌2h ;将体系温度升高至35°C，搅拌30min，逐滴加入150mL 去离子水；然后将体系温度升高到98°C，搅拌15min ;预热200mL去离子水至60°C，将反应 完毕的体系边搅拌边转移到去离子水中；向体系中逐滴加入双氧水，直至体系颜色变为褐 色；用5%盐酸抽滤清洗三次，取1~3mL滤液加入到氯化钡溶液中，若无沉淀生成则清洗 干净；用离心机离心清洗，至上清液pH为2~5,将氧化石墨烯转移至蒸发皿中，用保鲜膜 密封，放在冰箱中冷冻2~5h，再冷冻干燥，即得。
[0016] 步骤（3)中，氧化石墨稀溶液的浓度为1~3mg · mL 1C3
[0017] 步骤（3)中，氧化石墨烯溶液与氨水的体积比为600:1~600:5。
[0018] 步骤⑷中，EDC与NHS的浓度分别为0. 1~0. 3M。
[0019] 步骤（4)中，EDC、NHS和氧化石墨稀的体积比为1: 1:1~2:1: 1。
[0020] 上述三维石墨烯修饰电极在检测肿瘤标志物中的应用，检测步骤为：
[0021] (1)将羧基化的磁珠用pH为7. 0的咪唑-盐酸缓冲溶液洗涤，重复三次后，加入 EDC、NHS，在30~40°C的条件下，反应30~60min，将反应后的体系用磷酸缓冲溶液（PBS) 洗涤3~6次，最后将所得物分散于磷酸缓冲溶液溶液中；
[0022] (2)将氨基化的捕获DNA(SO)加入到步骤⑴所得到的溶液中，在室温条件下，反 应2~3h，得到带有捕获DNA的磁珠，将所得磁珠保存在0~KTC的条件下；
[0023] (3)将与捕获DNA互补度为1/3~1/2的富含鸟嘌呤脱氧核苷酸的DNA链（SI)，加 入到步骤（2)所获得的磁珠溶液中，在室温条件下，反应1~2h，加入氯高铁血红素 hemin， 使得富G部分形成G-四联体，最终制得hemin/G-四联体/SO/磁珠的结构；
[0024] (4)将hemin/G-四联体/SO/磁珠加入到与捕获DNA完全互补或特异性识别的靶 物质的溶液中，室温条件下，反应1~2h ;
[0025] (5)将步骤（4)反应后的溶液混合均匀，滴涂在三维石墨烯修饰电极表面，干燥 后，测其电化学响应信号。
[0026] 所述靶物质为凝血酶或TP53。
[0027] 步骤⑴中，EDC与NHS的浓度分别为0· 6~1M、0. 1~0· 3M。
[0028] 步骤（1)中，EDC与NHS的体积比为1:1~2:1。
[0029] 步骤（2)中，SO的浓度为20~30ηΜ。
[0030] 步骤（3)中，SI的浓度为20~30ηΜ。
[0031] 本发明的有益效果是：
[0032] (1)发明巧妙的利用氮掺杂三维石墨烯修饰的金电极检测反应体系中被靶DNA 链挤脱掉的hemin/G-四联体结构，间接的反映出靶物质的浓度；当靶物质浓度较高时，则 hemin/G-四联体/SO/磁珠结构中被挤脱掉的hemin/G-四联体数量就比较多，则滴涂到金 电极表面的溶液中的hemin/G-四联体的浓度也相应的比较大，从而在电化学检测的过程 中产生较大的电化学信号，靶物质和电化学信号之间存在正比例关系。
[0033] (2)在本发明中三维石墨烯与金电极之间是通过4-氨基对苯硫酚的桥梁作用来 连接的，金电极与4-氨基对苯硫酚之间是通过Au-S的作用连接的，EDC、NHS用来活化氧化 石墨烯结构中的-C00H，以便使氧化石墨烯通过与4-氨基对苯硫酚中_順 2的酰胺缩合反应 连接到金电极表面，所以结构很牢固。
[0034] (3)本发明以氨水作为氮掺杂三维石墨烯的氮源，以氧化石墨烯作为三维石墨烯 的原料，三维石墨烯具有多孔性、表面积大、突出的电子传导性能及传质快等优点，本发明 中使用氮掺杂三维石墨烯是因为一方面氮原子能诱导更多的正电荷到相邻的碳原子上；另 一方面N原子由于具有与C原子近似的原子半径，可以作为电子供体以取代的方式对石墨 烯进行掺杂，掺杂的N原子会影响C原子的自旋密度和电荷分布，使生成的氮掺杂石墨烯表 现出较纯石墨烯更多优异的性能。
【附图说明】
[0035] 图1为本发明制备三维石墨烯修饰电极的过程示意图；
[0036] 图2为本发明的三维石墨烯修饰电极用于靶物质的检测原理图。
【具体实施方式】
[0037] 下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
[0038] 实施例1 :
[0039] -种检测肿瘤标志物的三维