专利名称：老鸦瓣的组织培养与快速繁殖方法
技术领域：
本发明涉及植物组织培养与快速繁殖方法，尤其涉及一种老鸦瓣的组织培养与快速繁殖方法。
背景技术：
老鸦瓣edulis (Miq. ) Bak.为百合科(Liliaceae)郁金香属多年生纤弱草本，分布于我国东北至长江流域各省。其除去膜质皮和绒毛后的干燥鳞茎入药，中药名为光慈姑，其性凉，味甘、辛，有小毒，具清热解毒、散结消肿之功效，主治咽喉肿痛、瘰疬结核、瘀滞疼痛、痈疖肿毒和蛇虫咬伤等症。近年发现，光慈姑具抗肿瘤作用发现老鸦瓣对小鼠的Lewis肺癌、S180实体瘤和肝癌均有显著抑制作用，且具体外抗人肝癌细胞株7721活性；也发现其在乳腺疾病等方面疗效显著，其需求也随之日益增加，但有性繁殖困难，主要靠地下鳞茎分球，故人工栽培繁殖系数低下，目前光慈姑主要自于野生的采挖，故导致供需矛盾也 日益突出，且易导致野生资源枯竭。据此，研究老鸦瓣的传花生物学特性和种子萌发特性来试图解开其繁殖机理。已经报道的老鸦瓣组织培养的研究诱导出愈伤组织再分化出不定芽的老鸦瓣的组织培养模式，而且其诱导愈伤组织采用的是低6-BA浓度高NAA浓度，诱导不定芽采用的是高6-BA浓度低NAA浓度。
发明内容
为了解决上述的技术问题，本发明的目的是提供一种老鸦瓣的组织培养与快速繁殖方法，采用该方法进行老鸦瓣的组织培养与快速繁殖，可以从鳞片直接诱导出再生小鳞茎，不经过愈伤组织，提前了最早生根时间，提高了生根率和移栽成活率。为了实现上述的目的，本发明采用了以下的技术方案
老鸦瓣的组织培养与快速繁殖方法，其特征在于该方法包括以下的步骤
1)外植体的消毒
把采挖到的老鸦瓣的鳞茎洗去表面泥土，待浙干后，用保鲜袋置于冰箱内低温保存，实验时取出，去掉干燥的根和地上部，加洗涤剂仔细刷洗，再用自来水冲洗，整个球茎浸入酒精溶液中，再泡入消毒液中消毒，无菌水冲洗，除去残余消毒液，将外植体放到已灭菌的滤纸上以除去多余的水分，将鳞片材料切成f 3 cm2的小块，切成小块后按凹面朝上的方式接入到加有不同植物生长调节物质的MS培养基中；
2)小鳞茎诱导
外植体接入的MS培养基中添加的植物生长调节物质，所述的植物生长调节物质包括以下组分
6-BA 0. 5 5. 0 mg/L ；
TDZ 0. 05 1. 0 mg/L ；
先进行暗培养，温度为25土TC，培养条件为光/暗小时比为12 16:8 12，光照强度30 40 μ mol/ m · s ;
3)仔细地将再生小鳞茎与外植体分开，如果分不开，可留少量外植体，插入到生根培养基中，所述的生根培养基中包括
基本培养基(1/4 1)MS NAA0 0· 5 mg/L
IAAO. 3 3· O mg/L ；
炼苗时可微开培养瓶盖进行炼苗，2(T30h后取出并洗净根部附着的培养基，移入土中，土为小粉土，初期要做好保湿措施，并置于阴凉处，待新叶长出，即可除去烧杯。作为优选，上述的步骤I)消毒液为滴加一滴I mol/L NaOH的O. 2%HgCl2溶液。作为再优选，上述的消毒时间为5飞min。作为优选，上述的步骤I)外植体采用剥去最外面的鳞片后的第一枚鳞片。作为优选，上述的步骤2)中MS培养基中添加的植物生长调节物质的组成包括 6-BA1. 0 4. O mg/L
TDZ O. Γθ. 8mg/L。作为最优选，上述的步骤2)中添加的植物生长调节物质选用TDZ 0.3 mg/L +6_BA2. O mg/L ο作为优选，上述的步骤3)中生根培养基中包含肌醇，肌醇的含量为MS中原含量的0 50%。作为优选，上述的步骤3)中生根培养基中NAA为O. 05、. 2mg/L, IAA为O. 5^2. Omg/L ο作为最优选，上述的步骤3)中生根培养基选用1/4MS+ NAA O.1 mg/L +IAA 1.0mg/L ο 本发明由于采用了上述的技术方案，采用该方法进行老鸦瓣的组织培养与快速繁殖，可以从鳞片直接诱导出再生小鳞茎，不经过愈伤组织，提前了最早生根时间，提高了生根率和移栽成活率。
具体实施例方式材料来源5月中下旬于浙江省杭州市拱墅区皋亭山上采挖地上茎基本枯萎的老鸦瓣 Tulipa edulis (Miq. ) Bak.的鳞莖。外植体材料老鸦瓣鳞茎的鳞片。缩略词
2，4-D 2，4-二氯苯氧乙酸 6-BA 6-苄基腺嘌呤 IAA 吲哚乙酸 MS Murashige 和 Skoog NAA α-萘乙酸 TDZ 塞苯隆。1.外植体的消毒
把采挖到的老鸦瓣的鳞茎洗去表面泥土，待浙干后，用保鲜袋置于4°C冰箱内保存，实验时取出，去掉干燥的根和地上部,加适量洗涤剂仔细刷洗,再用自来水冲洗0. 5 I h，整个球茎浸入70%的酒精溶液中30 S，再泡入滴加了 I滴I mol/L NaOH的0. 2% HgCl2溶液中消毒若干时间，无菌水冲洗2 3次以除去残余HgCl2，将外植体放到已灭菌的滤纸上以除去多余的水分，将鳞片材料切成广3 cm2的小块，接种于各培养基中。1.1结果消毒l(Tll min，外面鳞片的污染率和死亡均低于10% ;消毒30 min后去除最外面的鳞片，内部的鳞片污染率和死亡率均为O。2.小鳞茎诱导的预实验
外植体采用剥去最外面的鳞片后的第一枚鳞片，切成小块后按凹面朝上的方式接入到加有不同植物生长调节物质的MS培养基中，各处理分别为1) 2,4-D 2.0 mg/L +6-BA 0.5mg/L ；2) 6-BA 2. 0 mg/L +NAA 0.1 mg/L ；3) TDZ 0. 3 mg/L +NM 0.1 mg/L ；4) TDZ 0. 05mg/L +2, 4-D 2.0 mg/L ；5) TDZ 0.3 mg/L +6-BA 2.0 mg/L。重复 3 次。所有培养基中蔗 糖浓度为3%，琼脂浓度为0.7%，pH 5. 8飞.0，下同。先进行暗培养，温度为(25±1)°C，培养条件为14 h光/10 h暗，光照强度3(T40 ymol/ms，下同。平时观察外植体生长情况并记录，在30 d时随机抽出10瓶进行统计，并筛选出较佳的植物生长调节物质组合以进行优化。2.1结果几种培养基均可诱导出小鳞茎。接入的鳞片由白色转变成绿色，鳞片也有明显增厚的现象。在切口处靠近凹面不久会出现较大的颗粒状突起，随后长出绿色的不定芽，并直接长成绿色小鳞茎。但是诱导率、颗粒状突起的时间和小鳞茎的数量并不一致。诱导率介于74. 7^93. 8%之间，但是随着培养时间的延续，每个处理均可达到95%以上；颗粒状突起发生的最早时间介于15 23 d之间，以I号培养基最早，2号培养基的最晚；每个外植体诱导产生的小鳞茎数量介于1. 06^11. 78之间，2号培养基的最少，而I号和5号的最多，分别为11. 78和10. 98，但是I号诱导产生的小鳞茎的生长速度要低于5号。3.小鳞茎诱导的植物生长调节物质组合的优化各设置3个梯度的TDZ (0. 1,0. 3和1. 0 mg/L)和6-BA(0. 5、2. 0和5. 0 mg/L)组合，配制MS培养，将外植体接种于其上，夕卜植体材料和接种方向同“小鳞茎诱导的预实验”。30 d随机抽出10瓶进行统计。3.1结果TDZ和6-BA浓度的升高，不定芽诱导率和诱导数均随之增加，诱导率介于68. 4-93. 2%之间，诱导出的再生小鳞茎数量介于6. 24 12. 05之间，但高浓度下诱导的再生小鳞茎质量不高，生长不好，选择中等浓度的激素组合则可保证质量，TDZ 0.3 mg/L+6-BA 2.0 mg/L为最佳组合，其不定芽诱导率为93. 2%，每个鳞片诱导出的再生小鳞茎为12. 05 个。4.不同鳞片位置对小鳞茎诱导的影响
切取消毒完的鳞茎，剥出鳞片，共选用外层、中层和内层各I枚鳞片，切成小块，接入添加有TDZ 0.3 mg/L +6-BA 2.0 mg/L的MS培养基中，摆放位置为凹面向上。30 d随机抽出10瓶进行统计。4.1结果从诱导率和每个外植体诱导出的小鳞茎数来看，为外层 > 中层 > 内层。5.摆放试对小鳞茎诱导的影响
外植体采用剥去最外面的鳞片后的第一枚鳞片，切成小块后分别按凸面朝上和凹面朝上的方式接入到添加有TDZ 0.3 mg/L +6-BA 2.0 mg/L的MS培养基中。30 d随机抽出10瓶进行统计。
5.1结果从诱导率、每个外植体诱导出小鳞茎数和生长速度来看，为凹面朝上好于凸面朝上。6.不同植物生长调节物质、肌醇浓度、MS浓度对再生小鳞茎的生根和移栽的影响仔细地将再生小鳞茎与外植体分开，如果分不开，可留少量外植体，插入到生根培养基中，各设置3个梯度的基本培养基(MS、1/2MS和1/4MS)、NAA(0、0.1和O. 5 mg/L)、IAA (O. 3、1.O和3. O mg/L)和肌醇(0、50%、100%)，30 d时随机抽出10瓶进行统计生根率。炼苗时可微开培养瓶盖进行炼苗，I d后取出并洗净根部附着的培养基，移入土中，土为小粉土，初期要做好保湿措施，并置于阴凉处，待新叶长出，即可除去烧杯，同时统计移栽成活率。6.1结果所有处理中均可诱导生根，但生根最早时间、生根率、生根质量和移栽成活率有所区别。其生根最早时间介于8 14 d之间，生根率介于45、7%之间，移栽成活率介于65-98%之间。1/4MS要好于1/2MS好于MS，0%肌醇好于50%肌醇好于100%肌醇；NAA 和IAA对于生根有着协同作物，但高浓度的NAA或IAA均易导致根的质量变低，并引起移栽成活率降低，故选择中等浓度的NAA和IAA组合NAA O. 1+IAA 1.0。故最适生根培养基为1/4MS+ NAA O.1 mg/L +IAA 1.0 mg/L，最早生根时间8d，生根率达97%，移栽成活率达98%。从再生小鳞茎切下的外植体，可继续用以诱导再生小鳞茎。
权利要求
1.老鸦瓣的组织培养与快速繁殖方法，其特征在于该方法包括以下的步骤 1)外植体的消毒 把采挖到的老鸦瓣的鳞茎洗去表面泥土，待浙干后，用保鲜袋置于冰箱内低温保存，实验时取出，去掉干燥的根和地上部，加洗涤剂仔细刷洗，再用自来水冲洗，整个球茎浸入酒精溶液中，再泡入消毒液中消毒，无菌水冲洗，除去残余消毒液，将外植体放到已灭菌的滤纸上以除去多余的水分，将鳞片材料切成f 3 Cm2的小块，切成小块后按凹面朝上的方式接入到加有不同植物生长调节物质的MS培养基中； 2)小鳞茎诱导 外植体接入的MS培养基中添加的植物生长调节物质，所述的植物生长调节物质包括以下组分6-BA O. 5 5. O mg/L ；TDZ O. 05 1. O mg/L ； 先进行暗培养，温度为25土TC，培养条件为光/暗小时比为12 16:8 12，光照强度30 40 μ mol/ m · s ; 3)仔细地将再生小鳞茎与外植体分开，如果分不开，可留少量外植体，插入到生根培养基中，所述的生根培养基中包括 基本培养基(1/4 1)MS NAA0 0· 5 mg/L IAAO. 3 3· O mg/L ； 炼苗时可微开培养瓶盖进行炼苗，2(T30h后取出并洗净根部附着的培养基，移入土中，土为小粉土，初期要做好保湿措施，并置于阴凉处，待新叶长出，即可除去烧杯。
2.根据权利要求1所述的老鸦瓣的组织培养与快速繁殖方法，其特征在于步骤I)消毒液为滴加一滴I mol/L NaOH的O. 2%HgCl2溶液。
3.根据权利要求2所述的老鸦瓣的组织培养与快速繁殖方法，其特征在于步骤I)消毒时间为10 11 min。
4.根据权利要求1所述的老鸦瓣的组织培养与快速繁殖方法，其特征在于步骤I)外植体采用剥去最外面的鳞片后的第一枚鳞片。
5.根据权利要求f4任意一项权利要求所述的老鸦瓣的组织培养与快速繁殖方法，其特征在于步骤2)中MS培养基中添加的植物生长调节物质的组成包括6-BA1. 0 4. O mg/L TDZ O. Γθ. 8mg/L。
6.根据权利要求5所述的老鸦瓣的组织培养与快速繁殖方法，其特征在于步骤2)中添加的植物生长调节物质选用TDZ 0.3 mg/L +6-BA 2.0 mg/L。
7.根据权利要求1所述的老鸦瓣的组织培养与快速繁殖方法，其特征在于步骤3)生根培养基中包含肌醇，肌醇的含量为MS中原含量的(Γ50%。
8.根据权利要求1、2、3、4或7所述的老鸦瓣的组织培养与快速繁殖方法，其特征在于所述的生根培养基中NAA为O. 05 O. 2mg/L，IAA为O. 5 2. O mg/L。
9.根据权利要求8所述的老鸦瓣的组织培养与快速繁殖方法，其特征在于所述的生根培养基选用 1/4MS+ NAA O.1 mg/L +IAA1. O mg/L。
全文摘要
本发明涉及一种老鸦瓣的组织培养与快速繁殖方法。老鸦瓣的组织培养与快速繁殖方法，其特征在于该方法包括以下步骤1)外植体的消毒把老鸦瓣的鳞茎洗净、沥干，低温保藏后进行消毒；实验时，将鳞片材料切成1~3cm2的小块，切成小块后按凹面朝上的方式接入到加有不同植物生长调节物质的MS培养基中；2)小鳞茎诱导外植体接入的MS培养基中添加的植物生长调节物质；3)仔细地将再生小鳞茎与外植体分开，插入到生根培养基中，20~30h后取出并洗净根部附着的培养基，移入土中，待新叶长出，即可除去烧杯。本发明的优点在于可以从鳞片直接诱导出再生小鳞茎，不经过愈伤组织，提前了最早生根时间，提高了生根率和移栽成活率。
文档编号A01H4/00GK103004588SQ201210505868
公开日2013年4月3日 申请日期2012年12月3日 优先权日2012年12月3日
发明者朱诚, 孙骏威, 王飞娟, 江琼, 丁艳菲 申请人:中国计量学院