Grf3突变体、方法和植物的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种新的修饰基因rGRF3或其直向同源物，所述基因或其直向同源物显示脱离miR396控制，特别在存在至少一个GIF基因如GIF1、AtGIF2、AtGIF3、Os11g40100、Os12g31350、Os03g52320或其组合过量表达的情况下。在植物中存在时，GRF3导致生产率增加的表型(例如增加的产量、增加的生物量、增加的胁迫抗性、增加的种子产生、增加的种子产量、增加的根生长、增加的根伸长速度、延迟的叶衰老或增加的耐旱性及它们的组合)。
【专利说明】GRF3突变体、方法和植物
【技术领域】
[0001] 通过向植物中引入GRF3生长因子中或在GRF3直向同源物中的突变而显示改善 的生产率和/或产量表型和/或增加的耐旱性的植物，所述突变体解除miR396对GRF3或 GRF3直向同源物的控制（任选地与至少一个GIF基因的过量表达组合）。
【背景技术】
[0002] 与动物相比，植物在它们的整个生命周期期间持续产生新器官。地上部分器官源 自苗顶端分生组织（SAM)，所述苗顶端分生组织包含存在于植物生长锥的干细胞池。正在增 殖的SAM细胞产生过量子代细胞，所述子代细胞并入SAM周界处正在发育的叶原基中或变 成苗的一部分。控制植物中以及在其他真核生物中细胞周期进展的核心装置依赖于细胞周 期蛋白依赖性激酶的活性(Inze和De Veylder，2006)。细胞周期调节的许多方面在真核生 物之间是高度保守的。然而，正是基本细胞周期机制与发育程序的整合（一个知之甚少的 过程）在多细胞生物之间产生无数表型变异(Inze和De Vevlder,2006)。
[0003] 与拟南芥（Arabidopsis thaliana)中不确定的SAM相反，叶是具有明确形态的 确定器官。叶发育涉及各种激素信号传导途径和转录因子网络的协同作用。参与叶中 细胞增殖控制的一些主要转录调节物包括AINTEGUMENTA (Mizukami和Fischer, 2000)、 PEAPOD (White, 2006)、JAGGED (Dinnenv 等人，2004 :0hno 等人，2004)、茎上的叶片(Ha 等 人，2003)、TCPs (Nath 等人，2003)和生长调节因子（GRF) (Kim 等人，2003)。
[0004] 为了获得其特征性最终尺寸和形状，正在发育的叶的生长需要首先通过细胞增殖 并且随后通过细胞扩张得到密切协调(Piazza等人，2005 ：Tsukava, 2006)。最初，在整个正 在发育的叶范围内观察到细胞增殖(Donnelly等人，1999)。随后，细胞周期在叶尖处停止 并且有丝分裂阻滞线移向器官基部(Donnelly等人，1999)。一旦细胞停止分裂，它们开始 扩膨大并且细胞生长变成调节器官尺寸的驱动力(Piazza等人，2005 :Tsukaya, 2006)。
[0005] 目前，对在整个正在发育的叶范围内协调细胞增殖的分子机制知之甚少。一种已 知调节物是TCP基因 CINCINNATA(CIN)，其控制金鱼草中有丝分裂阻滞线的推进(Nath等 人，2003)。突变如cin (Nath等人，2003)及其拟南芥（Arabidopsis)同源物tcp2/4/10的三 重敲除(Schommer等人，2008)造成叶形态发生的变化和不均匀的器官曲率，原因在于叶缘 处细胞过度增殖。有趣地，5种拟南芥TCP(TCP2、3、4、10和24)以及CIN具有微RNA(miRNA) miR319的靶位点(Palatnik等人，2003)。miR319的过量表达造成这些TCP降解和产生卷 缩叶，类似于tcp功能丧失突变体中观察到的那些(Palatnik等人，2003)。TCP的靶位点 中削弱与该miRNA相互作用的突变影响拟南芥中的叶形态(Palatnik等人，2003 ：Palatnik 等人,2007)和番茄中的叶复杂性(Ori等人,2007),并目.在极端情况下是致死的(Palatnik 等人，2003)。
[0006] 转录因子GRF家族在拟南芥中包含9个成员(Kim等人，2003)。它们中7个具有 miR396的祀位点(.Tones-Rhoades和Bartel, 2004)。已经显示不同GRF中的功能丧失型突 变或降低GRF水平的miR396过量表达减少拟南芥叶中的细胞数目(Horiguchi等人，2005 ； Kim 等人，2003 :Kim 和 Kende, 2004 :Liu 等人，2003)。GRF 与 GRF 相互作用因子（GIF, - 个编码与人SYT转录辅助激活物同源的蛋白质的小基因家族）一起发挥作用（Horiguchi 等人，2005 ;Kim和Kende，2004)。由于细胞增殖减少，GIFl(Kim和Kende，2004)(也称作 ANGUSTIF0LIA3, AN3) (Horiguchi 等人，2005))的失活产生更窄的叶。
[0007] Rodriguez 等人，Developmentl37, 103-112 (2010)已经公开，一种微 RNA,即 miR396,在协调拟南芥叶中的细胞增殖方面发挥作用。他们证实在叶原基中，miR396以低水 平表达，但是其表达在器官发育期间稳定增加。他们证实miR396拮抗其靶标，生长调节因 子（GRF)转录因子，的表达模式。显示miR396偏好地积累于正在发育的幼叶的远端部分中， 从而使GRF2的表达限于该器官的近端部分。这转而证实了与细胞增殖标志物CYCLINB1 ;1 的活性相一致。显示miR396通过阻遏GRF活性和减少细胞周期基因的表达，减弱正在发育 的叶中的细胞增殖。另外，他们报道，缺少GRF-相互作用因子1(GIF1)的突变体中miR396 的过量表达严重损害苗分生组织。发现miR396以低水平在整个分生组织范围内表达，与其 靶GRF2的表达重叠。此外，证实miR396的过量表达可以减少细胞增殖和分生组织的尺寸。 转录因子TCP4活性增加（这减少叶中细胞增殖）的拟南芥植物显示具有较高的miR396水 平和较低的GRF水平。经突变以干扰与miR396相互作用的修饰GRF2显示与miR396调节 作用无关，而野生型GRF2接受miR396调节。据报道这些植物具有比野生型略微较大的叶， 然而这些叶向下弯曲，这可能有害于光捕获和光合作用。那些结果表明miR396水平可以显 著地限制植物中的细胞增殖
[0008] 在本公开中，显示一种突变GRF3(有时在本文中称作rGRF3)和突变GRF3直向同 源物（有时在本文中称作rGRF3直向同源物）不受miR396调节，并且包含突变GRF3或突 变GRF3直向同源物的植物具有改善的生产率（productivity)和/或产量（yield)(包括 更大的叶面积、更大的细胞数目、增加的生物量、增加的胁迫抗性、延迟的叶衰老、增加的种 子产生（production)、增加的种子产量、增加的根生长、增加的根伸长速度和更大的耐旱 性），无论与野生型植物相比或与包含不受miR396调节的突变GRF2的植物相比。另外，来 自突变GRF3植物或突变GRF3直向同源物植物的叶不像突变GRF2植物的叶那样向下弯曲。 在突变GRF2植物中观察到的叶面积轻微增加由其水平与野生型植物中的GRF2水平相比增 加至少20倍引起；然而，已经观察到与野生型植物中的GRF3水平相比，只高3至5倍的突 变GRF3就对叶尺寸和植物生物量造成大得多的影响。
[0009] 在过量表达GIF1的植物中组合GRF3修饰或GRF3直向同源物修饰时，这些作用大 为增强。
[0010] 附图简沭
[0011] 图1显示与本发明相关的核酸构建体和序列；顶部小图显示与miR396b基本上互 补的区域中GRF3野生型序列的序列，显示结合亲和力（AG = -33.9kcal/摩尔）；中部小 图显示修饰型GRF3序列（rGRF3)，它包含不同于野生型序列的5个碱基变化（A->U、G->A、 U->A、G->A和A->G修饰），碱基变化均保留天然氨基酸序列，但是使与miR396b微RNA相互 作用大幅度去稳定化，（减少AG至-14.4kcal/摩尔）；底部小图显示35S:GIF1表达构建 体的示意图。
[0012] 图2显示GRF3和GIF1在转基因拟南芥植物中如通过RT-qPCR估计的相对表达水 平以及在这类转基因植物之间的杂交体中的相对表达水平，野生型植物中的GRF3水平以 相对值1代表，可以见到miR396(在35S启动子控制下）的过量表达减少了 GRF3表达，而 rGRF3转基因植物中GRF3的表达水平大约5倍于野生型植物中GRF3的表达水平。表达突 变形式的转基因植物中GRF3的这种增加由解除miRNA阻遏作用引起。
[0013] 在rGRF3和35S:GIF1植物之间的杂交体中，GRF3表达是略微（但是不显著地）低 于rGRF3植物中所见的5倍表达水平。通过比较，GIF1表达水平（再次以野生型植物中的 水平以1代表）在表达35S:miR396的植物中未显著地改变，但是几乎40倍于rGRF3植物 中和rGRF3xGIFl植物之间的杂交体中的野生型水平。量值是三次重复土SEM。
[0014] 图3显示在rGRF3植物、35S: GIF1植物和rGRF3x35S: GIF1植物中观察到的叶发育 的修饰。在左小图中，确定全展第一叶的叶面积、鲜重和干重，这些叶显示最容易观察到的 变化；右小图显示短日照下正在发育的植物的叶表型，同时底部右小图显示短日照条件下 在大容器中培育的植物。
[0015] 图4在顶部小图中显示rGRF3x35S:GIFl杂交植物的叶衰老延迟；在底部小图中， 对全展叶5显示单片叶的延迟叶衰老，将所述全展叶5剥离并在黑暗下温育（黑暗引起的 衰老）。衰老推进后测量叶绿素荧光（Fv/Fm)。
[0016] 图5显示用野生型形式的GRF3 (GRF3)和/或用miR396抵抗形式的GRF3 (rGRF3) 转化的植物的叶面积。
[0017] 图6显示rGRF3、GRF2和35S:miR396植物的鲜重（图6A)和干重（图6B)，全部 都在长日照条件下，垂直轴以克为单位。
[0018] 图7显示以无根进化支图显示的GRF邻接分析，所述GRF来自拟南芥 (Arabidopsis thaliana)(AtGRF#)、稻（Oryza sativa) (OsGRF#)、玉蜀黍（Zea mays) (ZmORF#)、大豆（Glycine max) (GmGRF)、毛果杨（Populus trichocarpa) (PtGRF)、桃 (Prunus persica) (PpGRF)、漢藜苜猜（Medicago truncatula) (MtGRF)和番木瓜（Carica papaya) (CpCRF)。加下划线：具有miR396结合位点的GRF :用星号标记：具有FFD保守基序 的 GRF。
[0019] 图8显示QLQ、WRC和FDD蛋白质基序在来自拟南芥（AtGRF#)、稻（OsGRF#)、玉蜀黍 (ZmORF#)、大豆（GmGRF)、毛果杨（PtGRF)、桃（PpGRF)、蒺藜苜蓿（MtGRF)和番木瓜（CpGRF) 的GRF中的分布
[0020] 图9显示以无根进化支图显示的来自拟南芥和稻的GIF的邻接分析：序列从 PlantTFDB2. 0 (http: //planttfdb. cbi. pku. edu. cn)抽取。
[0021] 图10显示有害的叶形状变化（向下"卷曲"），这些变化随rGRF2 -起存在，但是 不存在于rGRF3中。
[0022] 图11显示与GRF2 (25x)的巨大积累量相比，GRF3 (3x)轻微增加造成生产率（例 如，生物量）较高增加。
[0023] 图12显示rGRF3植物显示更高比率的茎生长和茎生物量积累。左图：在10日的 野生型（wt)和rGRF3植物中4. 5cm长的茎节段伸长。
[0024] 图13显示-短日照培育的植物的莲座丛表型。注意本发明植物的叶尺寸和生物 质积累增加。
[0025] 图14显示不同转基因植物中的干旱影响。
[0026] 图15显示拟南芥GRF在增生性组织中表达。
[0027] 左小图：叶发育期间的GRF3表达模式（DAS =播种后的天数）。右小图：GRF3拟南 芥发育期间随有丝分裂特异性基因一起共表达。
[0028] 图16显示玉米GRF随有丝分裂特异性基因一起共表达。
[0029] 图17显示由拟南芥miR396抗性GRF3引起的植物尺寸增加。
[0030] A)与独立转基因植物品系：空载体（WT，左侧）、miR396抗性GRF3 (rGRF3,中央） 和野生型GRF3(GRF3,右侧）相对应的30日龄植物。注意用rGRF3转化的莲座丛的较大尺 寸。
[0031] B)在（A)中描述的不同转基因植物的全展第一叶的面积。对每种载体评定至少 50株独立植物。用不同字母标记的标度是显著差异的，通过AN0VA和Duncan多重范围检验 所确定（P〈〇. 05)。
[0032] 图18显示组织特异性表达改善了 rGRF3在植物生产率方面的表现。从以下 不同启动子表达rGRF3的转基因植物的全展第一叶的面积：GRF3、非对称叶1(AS1)或 aintegumenta(ANT)。对每种载体评定至少50株植物。对于ASl:rGRF3和ANT:rGRF3,数据 代表独立的原代转基因品系，而对于GRF3:rGRF3,使用一个代表性品系。用不同字母标记的 标度是显著差异的，通过Kruskal-Wallis和Duncan多重范围检验所确定（P〈0. 05)。
[0033] 图19显示因 rGRF3所致的茎直径增加。从以下不同启动子表达rGRF3的转基因 植物的茎直径：GRF3、非对称叶1 (AS1)和aintegumenta(ANT)。用不同字母标记的标度是 显著差异的，通过Kruskal-Wallis和Duncan多重范围检验所确定（P〈0. 05)。
[0034] 图20显示使用组织特异性启动子，对叶尺寸的影响脱离对叶衰老时程的那些影 响。如本文中显示GRF3:rGRF3增加叶尺寸并延迟叶衰老。如果需要，后一种影响可以脱离 叶尺寸的增加。来自ANT和AS1启动子的rGRF3表达显著地增加叶尺寸，同时对叶衰老影 响微弱。黑暗诱导的全展叶#5衰老。从莲座丛切下全展叶后（第1日）和将它们在暗处 温育6日后（第6日）立即拍照。对于GRF3:rGRF3,使用代表性品系，并且对于ASl:rGRF3 和ANT:rGRF3载体，选择叶面积最大的4株原代转基因植物。
[0035] 图21显示以下9种拟南芥GRF的核苷酸序列，即AtGRFl (SEQ ID No. 40)、 AtGRF2(SEQ ID No.87)、AtGRF3(SEQ ID No.2)、AtGRF4(SEQ ID No.l9)、AtGRF5(SEQ ID No. 41)、AtGRF6 (SEQ ID No. 42)、AtGRF7 (SEQ ID No. 43)、AtGRF8 (SEQ ID No. 44)和 AtGRF9(SEQ ID No. 45)。加下划线的序列区段代表编码WRC(Trp、Arg、Cys)结构域的核苷 酸序列的部分；并且加下划线和加粗的序列区段代表miR396靶位点，如果存在的话。
[0036] 图22显示以下9种拟南芥GRF的氨基酸序列（AtGRFl(SEQ ID No. 46)、AtGRF2(SEQ ID No. 47)、AtGRF3 (SEQ ID No. 20)、AtGRF4 (SEQ ID No. 21)、AtGRF5 (SEQ ID No. 48)、 AtGRF6(SEQIDNo·49)、AtGRF7(SEQIDNo·50)、AtGRF8(SEQIDNo·51)和AtGRF9(SEQID No. 52)，加下划线的序列区段代表称作WRC(Trp、Arg、Cys)结构域的氨基酸序列的部分；并 且加下划线和加粗的序列区段代表FFD基序。
[0037] 图 23 显示 12 种稻（Oryza sativa)GRF 的核苷酸序列。（OsGRFl (SEQ ID No. 3)、 0sGRF2(SEQ ID No.4)、0sGRF3(SEQ ID No.5)、0sGRF4(SEQ ID No.6)、0sGRF5(SEQ ID No. 53)、0sGRF6 (SEQ ID No. 54)、0sGRF7 (SEQ ID No. 55)、0sGRF8 (SEQ ID No. 56)、 0sGRF9(SEQ ID No.57)、0sGRF10(SEQ ID No.58)、0sGRFll(SEQ ID No·59)和0sGRF12(SEQ ID No. 60))，加下划线和加粗的序列区段代表miR396靶位点，如果存在的话。
[0038] 图 24 显示 12 种稻 GRF 的氨基酸序列。（OsGRFl (SEQ ID No. 22)、0sGRF2 (SEQ ID No. 23)、0sGRF3(SEQ ID No. 24)、0sGRF4(SEQ ID No. 25)、0sGRF5(SEQ ID No. 61)、 0sGRF6 (SEQ ID No. 62)、0sGRF7 (SEQ ID No. 63)、0sGRF8 (SEQ ID No. 64)、0sGRF9 (SEQ ID No.65)、0sGRF10(SEQ ID No.66)、0sGRFll(SEQ ID No.67)和 0sGRF12(SEQ ID No.68))。
[0039] 图25显示14种玉蜀黍（玉米）GRF的核苷酸序列。（ZmORFl(SEQ ID No.7)、 Zm0RF2 (SEQ ID No. 69)、Zm0RF3 (SEQ ID No. 8)、ZmORF4 (SEQ ID No. 70)、Zm0RF5 (SEQ ID No. 9), Zm0RF6 (SEQ ID No. 10), Zm0RF7 (SEQ ID No. 11), Zm0RF8 (SEQ ID No. 71), Zm0RF9(SEQ ID No. 12)、Zm0RF10(SEQ ID No. 72)、ZmORFll (SEQ ID No. 13)、Zm0RF12(SEQ ID No. 73)、Zm0RF13(SEQ ID No. 74)和 ZmORF14(SEQ ID No. 14))。加下划线和加粗的序列 区段代表miR396靶位点，如果存在的话。
[0040] 图26显示14种玉蜀黍（玉米）GRF的氨基酸序列。（Zm0RFl(SEQ ID No. 26)、 Zm0RF2(SEQ ID No.75)、Zm0RF3(SEQ ID No.27)、Zm0RF4(SEQ ID No.76)、Zm0RF5(SEQ ID No. 28)、Zm0RF6 (SEQ ID No. 29)、Zm0RF7 (SEQ ID No. 30)、Zm0RF8 (SEQ ID No. 77)、 Zm0RF9(SEQ ID No. 31)、Zm0RF10(SEQ ID No. 78)、ZmORFll (SEQ ID No. 32)、Zm0RF12(SEQ ID No.79)、Zm0RF13(SEQ ID No.80)和 ZmORF14(SEQ ID No.33))。
[0041] 图27显示与AtGRF3具有高相似性的GRF的核苷酸序列，即大豆GRF(GmGRF) (SEQ ID No. 16)。加下划线和加粗的序列区段代表miR396靶位点，如果存在的话。
[0042] 图28显示与AtGRF3具有高相似性的GRF的核苷酸序列，即蒺藜苜蓿GRF (MtGRF) (SEQ ID No. 17)。
[0043] 图29显示与AtGRF3具有高相似性的GRF的核苷酸序列，即毛果杨GRF(PtGRF) (SEQ ID No. 18)。
[0044] 图30显示与AtGRF3具有高相似性的GRF的核苷酸序列，即桃GRF (PpGRF) (SEQ ID No. 15)。
[0045] 图31显示蒺藜苜蓿GRF (MtGRF) (SEQ ID No. 36)的氨基酸序列；加下划线的序列 区段代表称作WRC(Trp、Arg、Cys)结构域的氨基酸序列的部分；并且加下划线和加粗的序 列区段代表FFD基序。
[0046] 图32显示大豆GRF(GmGRF) (SEQ ID No. 35)的氨基酸序列；加下划线的序列区段 代表称作WRC(Trp、Arg、Cys)结构域的氨基酸序列的部分；并且加下划线和加粗的序列区 段代表FFD基序。
[0047] 图33显示毛果杨GRF(PtGRF) (SEQ ID No. 37)的氨基酸序列；加下划线的序列区 段代表称作WRC(Trp、Arg、Cys)结构域的氨基酸序列的部分；并且加下划线和加粗的序列 区段代表FFD基序。
[0048] 图34显示桃GRF (PpGRF) (SEQ ID No. 34)的氨基酸序列；加下划线的序列区段代 表称作WRC(Trp、Arg、Cys)结构域的氨基酸序列的部分；并且加下划线和加粗的序列区段 代表FFD基序。
[0049] 图35显示带突变的miR396-靶位点的拟南芥GRF3 (At-rGRF3)的核苷酸序列（SEQ ID No. 81);加阴影和加下划线的序列部分是突变的miR396-靶位点。小写指使GRF抵抗 miR396的碱基替换。为避免疑问，当时本文中提到突变体AtGRF3,除非另外声明，否则正在 提到的是这个序列。这个序列在本文中也称作At-rGRF3和rGRF3。这个突变的At-rGRF3 在本文中尤其用来产生转基因拟南芥植物。
[0050] 图36显示带突变的miR396-靶位点的大豆GRF (Gm-rGRF)的核苷酸序列（SEQ ID No. 82);加阴影和加下划线的序列部分是突变的miR396-靶位点。小写指使GRF抵抗 miR396的碱基替换。这个突变的Gm-rGRF在本文中用来产生转基因拟南芥植物。
[0051] 图37显示带突变的miR396-靶位点的稻GRF4 (0s-rGRF4. 1)的核苷酸序列（SEQ ID No. 83);加阴影和加下划线的序列部分是突变的miR396-靶位点。小写指使GRF抵抗 miR396的碱基替换。这个突变的0s-rGRF4在本文中用来产生转基因拟南芥植物。这个序 列在本文中也称作0s_rGRF4. 1和r0sGRF4. 1。
[0052] 图38显示来自其他植物物种的At_GRF3和GRF之间基于一级氨基酸序列的相似 性表。使用Needle评定GRF3和来自At、0s和Zm的每种GRF(外加来自选择物种的其他高 度相似的 GRF)之间的总体相似性(EMBOSS:http://www. ebi. ac. uk/Tools/psa/) 〇 同一性 指相同氨基酸处于相应位置时的情况；而相似性指氨基酸的保守性置换于相应位置时的情 况。
[0053] 图39显示编码JD16_GIF1的核苷酸序列（包含35S启动子（nt427-1295)_加下 划线部分；GIF1编码序列（ntl310-1942)_斜体和加粗的部分；和终止子（nt2106-2755) -加粗和加下划线的部分。
[0054] 图40显示编码RER32GRF3的核苷酸序列（SEQ ID No. 85)(包括GRF3启动 子（427-1707)-加下划线部分；5'UTR(1708-1913) -小写和斜体；GRF3编码序列+内 含子[小写](1914-4231)-斜体和加粗；3' UTR (4232-4454)-小写和斜体；和终止子 (4455-5105)-加粗和加下划线的部分。
[0055] 图 41 显示载体 35S:GIF1(JD16) (SEQ ID No. 84)的图-载体尺寸：11332pb，用 Bam HI 和 Sal I 消化，产物：10682 和 650pb。
[0056] 图 42 显示载体 GRF3:GRF3r (RER32)的图-载体尺寸：13642pb，用 Xba I 和 Sal I 消化，产物：11962和1680pb。
[0057] 图43显示GIF1、GIF2和GIF3的过量表达促进细胞增殖和叶尺寸并且GIF2和GIF3 蛋白是GIF1的功能等同物（见图43连同图9)。
[0058] 图44显示包含pBRACT114中rGRF3:GIFl的两个质粒的图。DBRACT114从www. bract, org可获得。pBRACT基于pGreen/pSoup载体系统并且pGreen的原始参考文献是： Hellens 等人，2000。
[0059] 图45显示原代转基因拟南芥植物中由突变的拟南芥GRF(At-rGRF3)和由突变的 大豆GRF (Gm-rGRF)所致的叶衰老延迟。
[0060] 图46显示当脱离miR396调节作用时，来自大豆和来自稻的GRF3直向同源物在拟 南芥中的表达还增加植物生物量。测量转基因植物的全展第一叶的面积，所述转基因植物 表达来自拟南芥、大豆或稻的GRF。
[0061] 图47显示与AtGRF3具有高相似性的GRF的核苷酸序列，即番木瓜GRF(CpGRF) (SEQ ID No. 88)。
[0062] 图48显示番木瓜GRF (CpGRF)的氨基酸序列（SEQ ID No. 89);加下划线的序列区 段代表称作WRC(Trp、Arg、Cys)结构域的氨基酸序列的部分；并且加下划线和加粗的序列 区段代表FFD基序。
[0063] 图49显示在用拟南芥rGRF3转化的甘蓝（Brassica oleracea)植物和对照植物 (无 At rGRF3)中比较开花时土壤层以上10cm的茎宽度和开花时最大茎宽度的数据。
[0064] 图50显示来自组织特异性启动子的rGRF3表达。
[0065] A)顶部：将GRF3作为与GFP的翻译融合物表达的构建体的示意图。底部：从 GRF3: GRF3-GFP植物和GRF3: rGRF3-GFP植物所采集的不同年龄叶中GRF3-GFP融合蛋白 的表达模式。B)顶点和不同年龄叶中GRF3mRNA的表达水平。C)用ANT:⑶S报道基因和 AS1:⑶S报道基因转化的植物的⑶S染色。上半部分，报道基因的示意图。
[0066] 图51显示rGRF3在组织特异性启动子下的表达水平和转化体的叶面积。
[0067] A)从不同启动子表达GRF3的转基因籽苗中GRF3的表达水平。通过RT-qPCR实施 测定并针对野生型植物归一化。B)全展第一和第二叶的面积。C)全展第一叶（左侧）和 第二叶（右侧）。
[0068] 图52显示从其内源性启动子和从ANT和AS1启动子表达rGRF3的40日龄植物的 图片。
[0069] 图53显示当rGRF3在其自身启动子控制下表达时延迟的衰老。衰老在野生型中 并且当rGRF3在AS1和/或ANT控制下表达时明显。
[0070] A)50日龄莲座丛的图片。注意GRF3:rGRF3植物的衰老延迟和AS1:GRF3和 ANT:GRF3植物的正常发育。B)显示剥离并在黑暗下温育（黑暗诱导的衰老）的全展叶#5 的单独叶的衰老。通过测定Fv/Fm对衰老的进展定量。
[0071] 图54显示针对独立原代转基因植物作图的叶面积。CHF3是空载体对照，带FFD基 序的rGRF3是从其自身启动子表达的rGRF3cDNA。rGRF3AAD是FFD基序（FFDDW)中存在三 个突变的rGRF3的cDNA，所述三个突变以三个丙氨酸替换两个苯丙氨酸和色氨酸（AADDA)。
[0072] 图55显示表达rGRF2和rGRF3的植物之间的比较。如本文中显示，rGRF3表达导 致产生比野生型或rGRF2表达更大的植物。rGRF2还产生扭曲的莲座丛。
[0073] 图56是显示表达rGRF3的甘蓝转化体和对照植物（TC)的开花时和10cm茎重量 的最宽茎宽度的表。
[0074] 图57,左侧，显示在播种后各种天数时野生型甘蓝和表达rGRF3的两个转基因甘 蓝植物的根长度的图。右侧，显示野生型和表达rGRF3的两个转基因植物的根伸长速度的 图。
[0075] 发明简沭
[0076] 本发明基于以下令人惊讶的研究结果：经证实脱离miR396控制，特别在GIF1过量 表达存在的情况下脱离miR396控制的新的修饰型GRF3基因，rGRF3,可以用来在植物中显 著地改善生物量、改善胁迫抗性、改善耐旱性、延迟叶衰老。生物量积累的改令人惊讶地高 并且出乎意料地好于唯一其他已报道的脱离miRNA的GRF，即rGRF2,同时从先前报道的数 据未曾预料到耐旱性。
[0077] 本发明人还已经令人惊讶地发现，也经修饰以脱离miR396控制的GRF3的直向同 源物也提供这些令人惊讶和出乎意料的效果。
[0078] 在第一方面提供一种分离的核酸，其编码修饰的生长调节因子（GRF)_3或其直向 同源物，所述核酸脱离miR396控制。
[0079] 在另一个方面提供包含本发明核酸的构建体，所述核酸与启动子和终止子可操纵 的连接。
[0080] 本发明还提供包含本发明核酸或本发明构建体的载体。
[0081] 在又一个方面，本发明提供了包含本发明核酸、本发明构建体或本发明载体的植 物、植物细胞或植物组织。
[0082] 在又一个方面，提供一种用于使用本发明核酸的方法，所述方法包括将本发明的 核酸或本发明的构建体或本发明的载体引入植物中。
[0083] 在本发明的另一个方面，提供本发明核酸或本发明构建体或本发明载体，用于产 生植物，所述植物具有增加的生产率和/或产量（例如包括增加的生物量、增加的胁迫抗 性、增加的耐旱性、增加的种子产生、增加的种子产量、增加的根生长、增加的根伸长速度、 延迟的叶衰老及它们的组合）。
[0084] 在本发明的另一个方面，提供了一种产生植物的方法，所述植物具有增加的生产 率/产量（例如包括以下一者或多者：增加的生物量、增加的胁迫抗性、增加的耐旱性、延迟 的叶衰老、增加的种子产生、增加的种子产量、增加的根生长、增加的根伸长速度及它们的 组合），所述方法包括用本发明的核酸或本发明的构建体或本发明的载体转化植物。
[0085] 又一个方面提供本发明的核酸或本发明的构建体或本发明的载体在产生用于增 加生产率和/或产量（例如以下一者或多者：增加生物量、增加胁迫抗性、增加耐旱性、延迟 叶衰老、增加种子产生、增加种子产量、增加根生长、增加根伸长速度或它们的组合）的植 物中的用途。
[0086] 在另一个方面，本发明提供一种新的修饰型基因，rGRF3,所述基因经证实脱离 miR396控制，特别在存在GIF1过量表达的情况下。
[0087] 因此，本发明的一个目的是提供新的修饰型GRF3基因或新的修饰型GRF3直向同 源基因。
[0088] 本发明的又一个目的是提供包含修饰型GRF3基因或修饰型GRF3直向同源基因的 新植物。
[0089] 本发明的又一个目的是提供在GIF1过量表达存在的情况下包含修饰型GRF3基因 或修饰型GRF3直向同源物的新植物。
[0090] 本发明的再一个目的是提供一种使用本文中公开的修饰型GRF3或修饰型GRF3直 向同源物的方法。
[0091] 本发明的再一个目的是提供一种用于产生植物的方法，与野生型植物或包含修饰 型GRF2(rGRF2)的植物相比，所述植物具有增加的生产率/产量表型（例如以下表型：延迟 的叶衰老、增加的生物量、增加的胁迫反应、增加的耐旱性、增加的种子产生、增加的种子产 量、增加的根生长、增加的根伸长速度或它们的组合）。
[0092] 本发明的又一个目的是提供植物，其中，所述植物具有增加的生产率和/或产量 表型（例如以下表型：延迟的叶衰老、增加的生物量、增加的胁迫反应、增加的耐旱性、增加 的种子产生、增加的种子产量、增加的根生长、增加的根伸长速度或它们的组合），而没有在 表达修饰型GRF2 (rGRF2)的植物中观察到的不良副作用如有害性叶形状变化，例如弯曲叶 或下卷叶。
[0093] 将参考本文提供的完整公开内容和所附权利要求书理解本发明的其他目的和优 点。
[0094] 本发明优诜实施方案的详细公开内容
[0095] Rodriguez等人（2010)使用在顶端中的小RNA印迹和原位杂交，直接跟踪miR396 的表达模式，并且通过野生型和miRNA抗性GRF2-GUS报道基因的差异性表达，间接跟踪 miR396的表达模式。miR396以低水平在分生组织和叶原基中表达，并且随后它随叶的发育 稳定积累。与之相比，在SAM和幼叶中高度表达的GRF在叶发育期间减少，与细胞增殖隐退 (retreat)协调一致。
[0096] 已经分别观察了 miR156和miR172及它们的靶SPL和AP2样转录因子的表达的时 间拮抗性谱图（Chuck等人，2007 ;Wu和Poethig，2006)。异时性miR156和miR172网络相 应地调节幼体至成体转变和营养期至繁殖期转变，这需要牵涉整个植株的决定（Aukerman 和 Sakai，2003 ;Chen，2004 ;Chuck 等人，2007 ;Schmid 等人，2005 ;Wu 和 Poethig，2006)。对 miR396的观察表明这种miRNA还参与植物中发育事件的协调；然而，其作用限于单个器官。
[0097] 拟南芥发育程序指导基本塑形模式（basiplastic pattern)，而叶成熟在顶端开 始并且随后向该器官的基部推进（Donnelly等人，1999)。细胞分裂首先在原基各处发生 并且随后有丝分裂阻滞线从叶顶端移向基部，从而叶远端部分中的细胞停止循环并开始膨 大，而基部处的细胞继续增殖（Donnelly等人，1999)。Rodriguez等人的结果显示，叶的远 端部分积累更多miR396,并且一个miRNA活性梯度指向器官基部。该结果得到了小RNA印 迹和观察到的野生型GRF2-GUS报道基因隐退的支持，这则匹配CYCB1 ;1报道基因的模式。 这些观察结果促使这些作者指向通过作为有丝分裂阻滞线组分的miR396对GRF表达的阻 遏。
[0098] 已经观察到在分生组织和叶原基中GRF2mRNA和miR396的相似空间表达模式，这 表明在这个早期阶段存在miRNA和其靶的共表达。然而在叶发育的晚期，情况不同。野生型 GRF2-GUS报道基因仅在正在发育的幼叶的近端部分中有活性，而rGRF2-GUS报道基因遍及 叶各处表达。野生型GRF2-GUS表达的这种定性变化平行于miR396大量增加，其中miR396 的水平在不同发育年龄的叶中变化达10-30倍。有趣地，GRF表达的下降在miR396达到 其最大水平之前出现，这表明该miRNA的部分增加足以在体内阻抑GRF ;然而，不能排除与 miR396 -致的发挥作用的其他因素也可能参与这个过程。
[0099] 已经提出miRNA可能具有导致其靶完全消除的定性作用，和更难以察觉的定 量作用（Bartel和Chen，2004)。在植物中，已经对miR169 (Cartolano等人，2007)和 miR156 (Wang 等人，2007)、miR319 (Ori 等人，2007)和 miR164 (Baker 等人，2005 ;Nikovics 等人，2006)和它们的靶提出这些定量性相互作用。从机理性观点看，正试图猜测的是 miR396在叶发育期间具有双重功能：它可能定量地调节在SAM和叶原基中的GRF表达，同 时造成巨大的定性作用，有助于从较老器官清除GRF活性。清除GRF转录物的后一种功能 作用可能解释miR396水平的持续升高，甚至在细胞增殖已经停止之后也是如此。在另一方 面，早期叶发育期间对GRF活性的潜在定量性调节可能在精细调节细胞增殖方面发挥相关 作用，已经显示调整miR396水平和GRF2水平之间的平衡对器官中细胞最终数目具有重要 影响。
[0100] miR396因其在拟南芥和稻之间保守而首先鉴定（Jones-Rhoades和Bartel, 2004)。miR396和具有miR396靶位点的GRF存在于许多植物物种中（Axtell和Bartel， 2005 Jones-Rhoades 和 Bartel，2004)，表明 miR396-GRF 调节网络的古老来源。基于 grf 突变体（Horiguchi 等人，2005 ;Kim 等人，2003 ;Kim 和 Lee，2006)和 gif 突变体（Horiguchi 等人，2005 ;Kim和Kende，2004)的表型和具有高miR396水平的植物（Liu等人，2003)，明 确确定了 GRF作为叶中细胞数目的调节物的功能。
[0101] Rodriguez等人（2010)扩充了这些观察结果并且发现GRF调节SAM中的细胞增 殖，这至少部分地解释了过量表达miR396的an3-l突变体（这项研究）中和grf多重敲除 情况下（Kim等人，2003;Kim和Lee，2006)功能性分生组织的缺乏。分析中度miR396过量 表达者的转录组已经显示有丝分裂特异性基因的下调是高miR396水平的主要分子作用之 一。然而，GRF本身在细胞周期期间不改变它们的表达（Menges等人，2005)，并且将需要未 来工作以鉴定GRF活性的潜在机制。
[0102] 通过RT-qPCR对GRF的测量表明，miR396靶和非靶在相似的叶发育阶段关闭并且 它们以冗余方式发挥作用。其中启动子已经与GUS报道基因直接融合的先前研究已经显示 了 GRF基因的转录可以在叶的不同区域内发生（Horiguchi等人，2005)。Rodriguez等人观 察到，miR396对GRF2的转录后控制显著地促进其最终表达模式，并得出结论，miRNA也可能 在调节其他GRF表达方面发挥重要作用。
[0103] 已经显示金鱼草TCP基因 CIN在叶发育期间以动态模式表达并调节细胞周期蛋白 表达（Nath等人，2003)。来自拟南芥的受miR319调节的CIN样基因也参与叶中细胞增殖 和分化的协调（Efroni 等人，2008 ;Koyama 等人，2007 ;Masuda 等人，2008 ;Palatnik 等人， 2003 ;Schommer等人，2008)。因损害与miR319相互作用的突变所致的TCP4水平增加产生 较小的叶（Efroni 等人，2008 ;Palatnik 等人，2003 ;Scho_er 等人，2008)。
[0104] Rodriguez等人观察到，表达miR319抗性形式的TCP4的植物诱导miR396。由于 miR396和GRF之间的定量性平衡调节叶中的细胞数目，由TCP4引起的miR396增加可能造 成soj8突变体中细胞数目的至少部分减少。然而，他们观察到，TCP4水平增加还造成不受 miR396和GIF1调节的GRF减少，表明在转录水平起作用。在动物中充分描述了其中转录因 子导致靶基因的转录性阻遏和miRNA的诱导（其转而转录后抑制相同基因群）的调节性回 路，在动物中它们称作相干前馈环（Hornstein和Shomron，2006)。
[0105] miR319 过量表达者（Efroni 等人，2008 ;0ri 等人，2007 ;Palatnik 等人，2003)和 tcp敲除者（Nath等人，2003 ;Schommer等人，2008)具有叶形态的巨大变化，以及其他表型 缺陷，如开花时间延迟（Palatnik等人，2003)。这表示TCP具有超出叶发育之外的功能。然 而，可能的是miR319调节的TCP招募miR396网络作为它们生物学功能的部分。Rodriguez 等人提出，miR396网络可能是不同发育性输入或环境刺激和细胞周期装置各组分之间的纽 带。
[0106] 在本公开中，在植物中显示了以类似于Rodriguez等人对GRF2所报道的方式使 GRF3(及其直向同源物）突变以产生新分子rGRF3(或其直向同源物）的作用。然而令人 惊讶的是，与具有野生型（例如未突变的）GRF3、野生型GRF2或Rodriguez等人中描述的 突变GRF2 (rGRF2)的植物相比，本文报道的结果具有明显增加的生产率和/或产量的植物 (例如具有明显增加的生物量、增加的胁迫反应、延迟的叶衰老、增加的种子产生、增加的种 子产量、增加的根生长、增加的根伸长速度和/或增加的耐旱性）。
[0107] 此外，显示在至少一种GIF (例如GIF1)在突变的GRF3(rGRF3)或其直向同源物存 在的情况下过量表达时，这些作用增强。
[0108] 另外，来自突变GRF3植物和/或突变GRF3直向同源物植物的叶不像Rodriguez 等人中报道的突变GRF2植物的叶那样向下弯曲。
[0109] 如果rGRF2水平增加到至少20倍于GRF2水平，则可以在rGRF2植物中观察到叶 面积轻微增加；然而，在GRF3或GRF3直向同源物仅高3至5倍的rGRF3植物和rGRF3直向 同源物植物中，可以观察到对生产率（例如叶尺寸和植物生物量）的大得多的影响。
[0110] 因而，按照本公开，如下文提供的实施例和实验方法中详细显示，产生了在核酸序 列中包含几个同义突变（即GRF3的氨基酸序列没有变化）的rGRF3或其直向同源物。
[0111] 结果是其中本来由miR396实现的阻遏作用与rGRF3脱离的植物，并且因而可产生 具有增加的生产率/产量（包括增加的生物量、增加的胁迫抗性、延迟的叶衰老和增加的耐 旱性或它们的组合）的植物。
[0112] 在第一方面提供一种分离的核酸，其编码修饰的生长调节因子（GRF)_3或其直向 同源物，所述核酸脱离miR396控制。
[0113] 核酸可以通过使miR396靶位点突变而脱离miR396控制。
[0114] 优选地，突变或修饰的核酸仅在miR396靶位点中修饰，例如基因剩余部分未修饰 或未突变。
[0115] 在一个优选实施方案中，修饰的核酸以这样的方式修饰，从而包含保守的核酸变 化。换句话说，如此修饰核酸，从而在该核酸表达的GRF3或GRF3直向同源物的氨基酸序列 中不存在变化。
[0116] 对核酸的修饰使该核酸（例如基因）实质上（substantially)脱离了 miR396控 制。
[0117] 优选地，通过突变miR396靶位点中的核酸，使该核酸脱离miR396控制。
[0118] 优选地，本发明的核酸编码具有FFD基序的蛋白质。
[0119] 在一些实施方案中，本发明的核酸优选地编码具有FFD (D/E)WP基序的蛋白质。
[0120] 为避免疑问，"（D/E) "意指在该位置处存在D或E残基。换句话说，FFD (D/E) WP意 指 FFDDWP 或 FFDEWP。
[0121] 为了决定某个GRF是否为本发明的GRF3直向同源物，可以查询编码具有FFD (例 如FFD(D/E)WP)基序的蛋白质的GRF。
[0122] 本发明的GRF3直向同源物是至少包含miR396靶位点的GRF。
[0123] 适当地，miR396靶位点（例如在本发明的核酸中，如在GRF3基因中或在GRF3直 向同源物基因中）可以具有、包含以下核苷酸序列CGTTCAAGAAAGCCTGTGGAA(SEQ ID No. 1) 或由其组成。在一些实施方案中，这个核苷酸序列可以视为野生型miR396靶位点序列。
[0124] 本发明的GRF3直向同源物根据优选地是选自如下已经脱离miR396控制的一种或 多种 GRF :拟南芥 GRF4 ;稻 GRF1、2、3、4 或 5 ;玉蜀黍 GRF1、3、5、6、7、9、11 或 14 ;大豆 GRF ; 蒺藜苜蓿GRF ;毛果杨GRF、番木瓜GRF和桃GRF。
[0125] 在一个实施方案中，GRF3直向同源物是在图7中描述的进化支图中与AtGRF3聚 类的一种直向同源物。已经发现这些GRF3直向同源物以类似于AtGRF3的方式发挥作用。
[0126] 为避免疑问，与AtGRF2或AtGRF9聚类的GRF不是本申请的目的，因为已经发现这 些GRF不像AtGRF3那样发挥作用。
[0127] 本发明的GRF3直向同源物是与AtGRF3具有相同功能性的一种直向同源物。
[0128] 如本文所用的术语"直向同源物"意指功能相似或相同但是在不同物种中出现的 基因。
[0129] 如7图中所示，GRF3直向同源物可以优选地是包含miR396靶位点并编码具有 FFD (例如FFD (D/E) WP)基序的蛋白质的一种直向同源物。
[0130] 本发明的GRF3直向同源物是至少包含miR396靶位点的GRF。
[0131] 本发明涉及分离的核酸，所述分离的核酸包含i)显示为SEQ ID No. 2(AtGRF3)的 核苷酸序列；ii)或与SEQ ID No. 2相同至少45%、优选地至少50%、优选地至少60%、优 选地至少65%的核苷酸序列；或iii)在严谨条件下与i)或ii)的核苷酸序列杂交的核苷 酸序列，其中所述核苷酸序列在miR396靶位点中包含使核酸脱离miR396控制的修饰。
[0132] 本发明的分离核酸可以包含i)显示为SEQ ID No. 3、SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 5、 SEQ ID No. 6,SEQ ID No. 7,SEQ ID No. 8,SEQ ID No. 9,SEQ ID No. 10,SEQ ID No. 1USEQ ID No. 11、SEQ ID No. 12、SEQ ID No. 13、SEQ ID No. 14、SEQ ID No. 15、SEQ ID No. 16、SEQ ID No. 17、SEQ ID No. 18 或SEQ ID No. 19 的核苷酸序列；ii)或与 SEQ ID No. SEQ ID No. 3、 SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 5、SEQ ID No. 6、SEQ ID No. 7、SEQ ID No. 8、SEQ ID No. 9、SEQ ID No. 10、SEQ ID No. 11、SEQ ID No. 11、SEQ ID No. 12、SEQ ID No. 13、SEQ ID No. 14、SEQ ID No. 15、SEQ ID No. 16、SEQ ID No. 17、SEQ ID No. 18 或 SEQ ID No. 19 相同至少 45%、 优选地至少50%、优选地至少60%、优选地至少65%的核苷酸序列；或iii)在严谨条件下 与i)或ii)的核苷酸序列杂交的核苷酸序列，其中i)、ii)或iii)的核苷酸序列在miR396 靶位点中包含使核酸脱离miR396控制的修饰。
[0133] 本发明的分离核酸可以包含i)编码本文中如下所示的多肽的核苷酸序列：SEQ ID No. 20,SEQ ID No. 2USEQ ID No. 22,SEQ ID No. 23,SEQ ID No. 24,SEQ ID No. 25,SEQ ID No. 26、SEQ ID No. 27、SEQ ID No. 28、SEQ ID No. 29、SEQ ID No. 30、SEQ ID No. 31、SEQ ID No. 32、SEQ ID No. 33、SEQ ID No. 34、SEQ ID No. 35、SEQ ID No. 36 或 SEQ ID No. 37 ;ii) 或与i)的核苷酸序列具有至少45%、优选地至少50%、优选地至少60%、优选地至少65% 同一性的核苷酸序列；或iii)在严谨条件下与i)或ii)的核苷酸序列杂交的核苷酸序列， 其中i)、ii)或iii)的核苷酸序列在miR396祀位点中包含使核酸脱离miR396控制的修 饰。
[0134] 优选地，根据本发明脱离miR396控制的核酸在至少一个GIF基因（例如GIF1)过 量表达存在的情况下显示出进一步的增强作用。
[0135] 可以通过用包含与启动子可操作连接的至少一种GIF(例如GIF1)编码序列的构 建体转化植物、或植物细胞或植物组织，完成至少一种GIF (例如GIF1)的过量表达。
[0136] 在一个实施方案中，植物、植物细胞或植物组织包含至少2种，例如2或3种，过量 表达的GIF基因。
[0137] 本发明的GIF基因可以是任何合适的GIF基因，包括AtGIFl (有时在本文中称作 GIF1)、AtGIF2、AtGIF3、0sllg40100、0sl2g31350、0s03g52320 或它们的组合。
[0138] GIF (例如GIF1)编码序列可以处于组成型启动子如CaMV35S启动子控制下或可以 处于组织特异性启动子控制下。
[0139] 如下文提供的实施例和实验方法中详细显示，可以产生包含几个核酸同义改变 (即GRF3的氨基酸序列没有变化）的rGRF3或其直向同源物。
[0140] 在一个实施方案中，修饰型GRF3或其直向同源物可以在miR396靶位点中包含至 少一个或全部以下碱基变化：A->U、G->A、U->G、U->A、G->C、A->T、G->A、T->A、G->A、A->G 修饰。这些变化可以保留天然氨基酸序列，但是使miR396与所述rGRF3的相互作用大幅去 稳定化。
[0141] 在一个实施方案中，修饰型GRF3或其直向同源物可以在miR396靶位点中包含至 少一个或全部以下碱基变化：A->U、G->A、U->A、G->A、A->G修饰。这些变化可以保留天然 氨基酸序列，但是使miR396与所述rGRF3的相互作用大幅去稳定化。
[0142] 在一个优选实施方案中，修饰型GRF3或其直向同源物包含具有以下序列的修饰 的miR396靶位点：CGTTCxAGAAAxCCxGTxGAx(SEQ ID No. 86)，其中X表示（例如与野生型序 列相比）已经修饰（例如突变）的碱基。
[0143] 修饰型GRF3或其直向同源物包含具有以下序列的修饰的miR396靶位点： CGTTCtAGAAAaCCaGTaGAg(SEQ ID No. 38)，其中小写字母表示修饰的碱基（例如与野生型序 列相比）。
[0144] 可以通过任何已知方法产生突变序列，并且多种方法易于被本领域普通技术人员 获得。本领域技术人员理解，可以向核苷酸序列产生众多位点定向突变或随机突变并随后 通过各种手段筛选所编码多肽的改善功能性。
[0145] 可以使用合成性寡核苷酸引入突变。这些寡核苷酸含有分布在所需突变位点侧翼 的核苷酸序列。
[0146] 合适的方法在 Morinaga 等人，（Biotechnology (1984) 2，第 646-649 页） 中公开。在核苷酸序列中引入突变的另一种方法在Nelson和Long (Analytical Biochemistry(1989)，180,第 147-151 页）中描述。
[0147] 用于向核苷酸序列中引入突变的一种方法使用来自Stratagene的 QuikChange?涖点定向诱变试剂盒。
[0148] 在一些实施方案中，Colbert 等人，2001 (Plant Physiology June2001，第 126 卷， 第480-484页）中描述的基因组内定向引入局部损伤（TILLING)技术可以用来筛选引起的 突变，例如引起的点突变。
[0149] 在另一个方面提供包含本发明核酸的构建体，所述核酸与启动子和/或终止子可 操作的连接。
[0150] 启动子可以是组成型启动子，如CaMV35S启动子，天然AtGRF3启动子，或天然GRF3 直向同源物启动子，或可以是组织特异性启动子。
[0151] 在一个实施方案中，启动子可以是组织特异性启动子。
[0152] 当需要使GRF3的不同功能脱离（如使增加的生物量脱离延迟的叶衰老时），本发 明的核酸优选地与组织特异性启动子可操作的连接。
[0153] 此外，组织特异性启动子的使用可以改善植物生产的性能并进一步改善生产率。
[0154] 在一些实施方案中，组织特异性启动子可以包括（或可以是）在叶早期发育期间 瞬时表达的启动子。
[0155] 在一个实施方案中，组织特异性启动子可以包括（或可以是）非对称叶l(AS-l) 启动子或AINTEGUMENTA (ANT)启动子。
[0156] 本领域技术人员知晓使本发明核酸的表达定向于植物的适宜位置中的其他合适 的组织特异性启动子。不希望受理论约束，在具有或没有GIF共过量表达时，脱离miR396 控制的突变GRF3或突变GRF3直向同源物可调节所述核酸在其中特异性表达的叶或其他器 官中的细胞数目。因此，rGRF3将仅影响其中出现表达的植物的那部分。
[0157] 本领域技术人员还知晓，也可能调节表达的时间模式和水平。例如，AS-1启动子 具有活性的时间比ANT启动子长，并且因此当表达突变的GRF3 (rGRF3)序列或突变的GRF3 直向同源物序列时产生更大的叶。
[0158] 因此，组织特异性启动子可以是在空间和/或时间上调节表达的启动子。
[0159] 本发明还提供一种包含本发明核酸或本发明构建体的载体。
[0160] 在又一个方面，本发明提供了包含本发明核酸、本发明构建体或本发明载体的植 物、植物细胞或植物组织。
[0161] 在一个实施方案中，本发明的植物、植物细胞或植物组织还可以包含修饰型 GRF2(rGRF2)，所述修饰型GRF2也脱离miR396控制。换句话说，GRF2也可以在本发明的 miR396靶位点中被突变。为避免疑问，这个实施方案仅涉及本发明rGRF3或rGRF3-直向同 源物与rGRF2的组合。
[0162] AtGRF2和AtGRF9不是本发明的GRF3直向同源物。
[0163] 因此，如本文所用的术语"GRF3直向同源物"不包括AtGRF2或AtGRF9。
[0164] 因此，本发明的核苷酸序列不包含这样的核苷酸序列，所述核苷酸序列包含本文 中作为SEQ ID No. 87或EQ ID No. 45显示的核苷酸序列。
[0165] 同样，如本文所用的术语"修饰型GRF3直向同源物"或"rGRF3直向同源物"不包 括修饰型AtGRF2或修饰型AtGRF9。
[0166] 在本发明的一个实施方案中，植物、植物细胞或植物组织可以额外地过量表达至 少一种GIF (例如GIF1)。
[0167] 可以通过用包含与启动子可操作的连接的至少一种GIF(例如GIF1)编码序列的 构建体转化所述植物、或植物细胞或植物组织，实现至少一种GIF (例如GIF1)的过量表达。
[0168] 在一些实施方案中，本发明的植物、植物细胞或植物组织可以包含多于一种（例 如两种，例如三种）本发明的核酸。
[0169] 仅以举例方式，本发明的植物、植物细胞或植物组织可以包含多于一种（例如两 种，例如三种）rGRF3基因和/或rGRF3直向同源物。例如，本发明的植物、植物细胞或植物 组织根据可以包含与一种或多种rGRF3直向同源物组合的rGRF3。
[0170] 如本文所用的术语"GRF3"意指可获自（优选地获自）拟南芥的生长调节因子3。
[0171] 如本文所用的术语"rGRF3"意指可获自（优选地获自）拟南芥的突变或修饰的生 长调节因子3。优选地，突变或修饰的生长调节因子3已经经过突变或修饰从而使其脱离 miR396 控制。
[0172] 如本文所用的术语"GRF3直向同源物"可以涵盖选自如下的一种或多种GRF :拟南 芥 GRF4 ;稻 GRF1、2、3、4 或 5 ;玉蜀黍 GRF1、3、5、6、7、9、11 或 14 ;大豆 GRF ;蒺藜苜蓿 GRF ; 毛果杨GRF ;番木瓜GRF和桃GRF。
[0173] 如本文所用的术语"rGRF3直向同源物"可以涵盖选自已经脱离miR396控制的如 下的一种或多种61^ :拟南芥61^4;稻61^1、2、3、4或5;玉蜀黍61^1、3、5、6、7、9、11或14 ; 大豆GRF ;蒺藜苜蓿GRF ;毛果杨GRF ;番木瓜GRF和桃GRF。
[0174] 编码修饰型GRF-3或其直向同源物的核酸可以包含内含子或可以排除内含子。
[0175] 在一个实施方案中，编码修饰型GRF-3或其直向同源物的核酸包含内含子。不希 望受理论约束，内含子可以增强转基因的表达。
[0176] 在又一个方面，提供使用本发明核酸的方法，所述方法包括将本发明的核酸或本 发明的构建体或本发明的载体引入植物中。
[0177] 在本发明的另一个方面，提供本发明核酸或本发明构建体或本发明载体，用于产 生植物，其中所述植物具有增加的生物量、增加的胁迫抗性、增加的耐旱性、延迟的叶衰老 及它们的组合。
[0178] 在本发明的另一个方面，提供产生植物的方法，所述植物植物具有增加的生物量、 增加的胁迫抗性、增加的耐旱性、延迟的叶衰老及它们的组合，所述方法包括用本发明的核 酸或本发明的构建体或本发明的载体转化植物。
[0179] 又一个方面提供本发明的核酸或本发明的构建体或本发明的载体在产生用于增 加生物量、增加胁迫抗性、增加耐旱性、延迟叶衰老或其组合的植物中的用途。
[0180] 优选地，本发明的植物具有增加的生物量、增加的胁迫抗性、增加的耐旱性、延迟 的叶衰老或它们的组合。
[0181] 术语"增加的生物量"可以包括选自如下的一者或多者：增加的总体植物生物量、 增加的鲜重、增加的叶面积或尺寸、增加的根长度、增加的干重、增加的茎生长、增加的茎生 物量、增加的茎直径和开花时增加的茎宽度。
[0182] 使用rGRF3或rGRF3直向同源物（其不同于使用rAtGRF2)的一个令人惊讶的技 术优点是产生了增加的生物量，增加的耐旱性，延迟的叶衰老或它们的组合而没有有害的 叶形状变化，例如向下卷曲。
[0183] 在一些实施方案中，可以优选使增加的生物量脱离延迟的叶衰老。发明人已经令 人惊讶地发现，这可以通过使用组织特异性启动子实现。
[0184] 如本文所用的术语"增加的胁迫抗性"意指植物甚至在置植物于胁迫（例如干旱 等）下的条件下保生产（例如维持或增加生物量等）的能力。
[0185] 术语"增加的生物量"、"增加的胁迫抗性"、"增加的耐旱性"、"延迟的叶衰老"、"增 加的根生长"、"增加的根伸长速度"意指与野生型植物（例如包含未修饰的GRF3或GRF3直 向同源物的植物）或包含修饰型GRF2(rGRF2)的植物相比增加或延迟。
[0186] 术语"增加的总体植物生物量"、"增加的鲜重"、"增加的叶面积或尺寸"、"增加的 干重"、"增加的茎生长"、"增加的茎生物量"、"增加的茎直径"和"开花时增加的茎宽度" 意指与野生型植物（例如包含未修饰的GRF3或GRF3直向同源物的植物）或包含修饰型 GRF2 (rGRF2)的植物相比增加或延迟。
[0187] 如本文所用的术语"修饰"可以意指突变。如本文所用的术语"修饰"意指不同于 野生型。
[0188] 如本文所用的术语"野生型"意指天然存在的核酸。也就是指这样一种核酸，与宿 主生物的遗传密码相比，其发现于内源遗传密码中并且从其尚未突变（即不含碱基缺失、 添加或置换）的内源宿主生物分离。
[0189] 本发明的载体可以是表达载体。术语"表达载体""意指能够体内或体外表达的构 建体。
[0190] 优选地，表达载体并入合适宿主生物（例如植物）的基因组中。术语"并入"优选 地涵盖稳定并入基因组中。
[0191] 本发明的核苷酸序列可以存在于载体中，在所述载体中，核苷酸序列与能够导致 核苷酸序列通过合适宿主生物（例如植物）表达的调节序列可操作的连接。
[0192] 如下文描述，可以将用于本发明中的载体转化入合适的宿主细胞，例如植物细胞。
[0193] 用于本发明中的载体可以含有一种或多种选择标记基因，如赋予抗生素耐药性例 如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素抗性的基因。
[0194] 载体可以例如在体外使用，用于产生RNA或用来转染、转化、转导或感染宿主细 胞。
[0195] 因此，在又一个实施方案中，本发明提供一种通过以下方式产生本发明核苷酸序 列的方法：将本发明的核苷酸序列引入复制型载体中，将该载体引入相容性宿主（例如植 物）细胞中并且在导致载体复制的条件下培育宿主（例如植物）。
[0196] 如本文中所用，术语"可操作的连接"指并置，其中所述组件处在允许它们以其预 期方式发挥功能的关系中。与编码序列"有效连接"的调节序列以这样的方式连接，从而在 与所述调控序列相容的条件下实现编码序列的表达。
[0197] 术语"调节序列"包括启动子和启动子和其他表达调节信号。
[0198] 术语"启动子"以本领域正常含义使用，例如RNA聚合酶结合位点。
[0199] 术语"构建体"-其与术语如"缀合物"、"盒"和"杂交分子"同义-包括根据本发 明使用的与启动子直接或间接连接的核苷酸序列。
[0200] 间接连接的例子是提供合适的间隔序列如内含子序列，如Shi-内含子或ADH内含 子介于启动子和本发明的核苷酸序列间。对于本发明而言，这也适用于术语"融合"，所述融 合包括直接或间接连接。在一些情况下，该术语不涵盖通常与野生型基因启动子结合和它 们均处于其天然环境时的编码蛋白质的核苷酸序列的天然组合。
[0201] 构建体可以甚至含有或表达标记，所述标记允许选择基因构建体。
[0202] 对于一些应用，本发明的构建体优选地至少包含与启动子可操作的连接的本发明 核苷酸序列。
[0203] 适于本发明核酸转化的宿主生物可以是植物。在这个方面，构建基因修饰 植物方面的基本原理是在植物基因组中插入遗传信息从而实现所插入遗传物质的 稳定维持。一般技术的综述可以见于Potrykus (Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol[1991]42:205-225)和 Christou(Agro-Food-Industry Hi-Tech March/ Aprill99417-27)〇
[0204] 用农杆菌直接感染植物组织是已经广泛使用并且在Butcher D. N.等 人，（1980)，Tissue Culture Methods for Plant Pathologists,编者：D.S. Ingrams 和 J. P. Helgeson，203-208中描述的一项简单技术。
[0205] 用于转化植物的其他技术包括抛射体转化、碳化硅晶须技术（见Frame BR, Drayton PR,Bagnaall SV, Lewnau CJ, Bullock WP, Wilson HM,Dunwell JM, Thompson JA 和 Wang K(1994)Production of fertile transgenic maize plants by silicon carbide whisker-mediated transformation，The Plant Journal6:941-948)和病毒转化 技术（例如，见 Meyer P，Heidmann I 和 Niedenhof I(1992)The use of cassava mosaic virus as a vector system for plants, Genell0:213_217)〇
[0206] 关于植物转化的另外教导可见于EP-A-0449375。
[0207] 可以根据熟知的组织培养方法培养和维持植物细胞，如通过在补充有必需生长因 子如氨基酸、植物激素、维生素等的合适培养基中培养细胞。
[0208] 在又一个方面，本发明涉及一个携带本发明核苷酸序列或构建体并且能够将该核 苷酸序列或构建体引入生物（如植物）的基因组中的载体系统。该载体系统可以包含一种 载体，但是它也可以包含两种载体。在两种载体的情况下，该载体系统通常称作双元载体 系统。双元载体系统更详细地描述于Gynheung An等人，（1980)，Binary Vectors, Plant Molecular Biology Manual A3, l_19〇
[0209] -个广泛用于转化植物细胞的系统使用了来自根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens)的 Ti 质粒或来自发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes)的 Ri 质粒（An 等人，（1986), Plant Physiol. 81, 301-305和Butcher D.N.等人，（1980), Tissue Culture Methods for Plant Pathologists,编者：D.S. Ingrams 和 J.P.Helgeson, 203-208)。在 植物中分别引入所需的本发明启动子或构建体或核苷酸序列后，可能需要存在和/或插 入其他DNA序列。如果，例如，为了转化，使用植物细胞的Ti质粒或Ri质粒，可以连接Ti 质粒和Ri质粒T-DNA的至少右边界并且然而经常连接其右边界和左边界，作为所引入基 因的侧翼区。T-DNA用于转化植物细胞的用途已经被充分研究并且描述于EP-A-120516 ; Hoekema, 弓| 自：The Binary Plant Vector System Offset-drukkerij Kanters B. B.，Alblasserdam, 1985，第 V 章；Fraley 等人，Crit. Rev. Plant Sci.，4:1-46 和 An 等 人，ΕΜΒ0 J. (1985)4:277-284。
[0210] 如本文所用的术语GIF意指GRF相互作用因子（GIF，一个编码与人SYT转录辅助 激活物同源的蛋白质的小基因家族（Horiguchi等人，2005 ;Kim和Kende，2004)。
[0211] GIF1 (Kim 和 Kende，2004)又称作 ANGUSTIF0LIA3 (AN3)。
[0212] 在一个实施方案中，根据本发明使用的GIF优选地是GIF1。GIF1也可以在本文中 称作 AtGIFl。
[0213] 在一个实施方案中，根据本发明使用的GIF可以是GIF1，其中GIFli)包含本文中 作为以下显示的氨基酸或与之具有至少80%同一性的氨基酸序列：MQQHLMQMQPMMAGYYPSN VTSDHIQQYLDENKSLILKIVESQNSGKLSECAENQARLQRNLMYLAAIADSQPQPPSVHSQYGSAGGGMIQGEGGS HYLQQQQATQQQQMTQQSLMAARSSMLYAQQQQQQQPYATLQHQQLHHSQLGMSSSSGGGGSSGLHILQGEAGGFHD FGRGKPEMGSGGGGEGRGGSS⑶GGETLYLKSSDDGN(SEQ ID Νο·95);或
[0214] ii)由以下核苷酸序列编码：
[0215] ATGCAACAGCACCTGATGCAGATGCAGCCCATGATGGCTGGTTACTACCCCAGCAATGTTACCTCTGAT CATATCCAACAGTACTTGGACGAAAACAAATCGTTGATTCTGAAGATTGTTGAGTCTCAAAACTCTGGAAAGCTTAG CGAATGCGCCGAGAATCAAGCAAGGCTTCAACGCAACCTAATGTACCTAGCTGCAATAGCAGATTCTCAGCCTCAGC CACCAAGTGTGCATAGCCAGTATGGATCTGCTGGTGGTGGGATGATTCAGGGAGAAGGAGGGTCACACTATTTGCAG CAGCAACAAGCGACTCAACAGCAACAGATGACTCAGCAGTCTCTAATGGCGGCTCGATCTTCAATGTTGTATGCTCA GCAACAGCAGCAGCAGCAGCCTTACGCGACGCTTCAGCATCAGCAATTGCACCATAGCCAGCTTGGAATGAGCTCGA GCAGCGGAGGAGGAGGAAGCAGTGGTCTCCATATCCTTCAGGGAGAGGCTGGTGGGTTTCATGATTTTGGCCGTGGG AAGCCGGAAATGGGAAGTGGTGGTGGCGGTGAAGGCAGAGGAGGAAGTTCAGGGGATGGTGGAGAAACCCTTTACTT GAAATCATCAGATGATGGGAATTGA(SEQ ID Νο·39);或
[0216] iii)由与SEQ ID No. 39至少70%、优选地80%、更优选地90%、甚至更优选地 95 %相同的核苷酸序列编码；或
[0217] iv)由严谨条件下与SEQ ID No. 39杂交的核苷酸序列编码。
[0218] 如可以从图9看出，来自拟南芥和稻的许多GIF序列聚类在一起。可以理解，可以 根据本发明使用这些GIF的任一种。因此，根据本发明使用的GIF可以是可获自（优选地获 自）稻的命名为0sllg40100、0sl2g31350、0s03g52320的一种或多种GIF或是可获自（优 选地获自）拟南芥的命名为AtGIFl、AtGIF2或AtGIF3的一种或多种GIF。
[0219] 在一个实施方案中，本发明使用的GIF可以是AtGIF2,其中AtGIF2i)包含本文中 作为以下显示的氨基酸或与之具有至少80%同一性的氨基酸序列：MQQQQSPQMFPMVPSIPPA NNITTEQIQKYLDENKKLIMAIMENQNLGKLAECAQYQALLQKNLMYLAAIADAQPPPPTPGPSPSTAVAAQMATPH SGMQPPSYFMQHPQASPAGIFAPRGPLQFGSPLQFQDPQQQQQIHQQAMQGHMGIRPMGMTNNGMQHAMQQPETGLG GNVGLRGGKQDGADGQGKDDGK(SEQ ID Νο·96);或
[0220] ii)由以下核苷酸序列编码：
[0221] ATGCAGCAGCAGCAGTCTCCGCAAATGTTTCCGATGGTTCCGTCGATTCCCCCTGCTAACAACATCACT ACCGAACAGATCCAAAAGTACCTTGATGAGAACAAGAAGCTGATTATGGCCATCATGGAAAACCAGAATCTCGGTAA ACTTGCTGAGTGCGCCCAGTACCAAGCTCTTCTCCAGAAGAACTTGATGTATCTTGCTGCAATTGCTGATGCTCAAC CCCCACCACCTACGCCAGGACCTTCACCATCTACAGCTGTCGCTGCCCAGATGGCAACACCGCATTCTGGGATGCAA CCACCTAGCTACTTCATGCAACACCCACAAGCATCCCCTGCAGGGATTTTCGCTCCAAGGGGTCCTTTACAGTTTGG TAGCCCACTCCAGTTTCAGGATCCGCAACAGCAGCAGCAGATACATCAGCAAGCTATGCAAGGACACATGGGGATTA GACCAATGGGTATGACCAACAACGGGATGCAGCATGCGATGCAACAACCAGAAACCGGTCTTGGAGGAAACGTGGGG CTTAGAGGAGGAAAGCAAGATGGAGCAGATGGACAAGGAAAAGATGATGGCAAGTGA(SEQ ID No. 90)，或
[0222] iii)由与SEQ ID No. 90至少70%、优选地80%、更优选地90%、甚至更优选地 95 %相同的核苷酸序列编码；或
[0223] iv)由严谨条件下与SEQ ID No. 90杂交的核苷酸序列编码。
[0224] 在一个实施方案中，本发明使用的GIF可以是AtGIF3,其中AtGIF3i)包含本文中 作为以下显示的氨基酸或与之具有至少80%同一性的氨基酸序列：MQQSPQMIPMVLPSFPPTN NITTEQIQKYLDENKKLIMAILENQNLGKLAECAQYQALLQKNLMYLAAIADAQPQPPAATLTSGAMTPQAMAPNPS SMQPPPSYFMQQHQAVGMAQQIPPGIFPPRGPLQFGSPHQFLDPQQQLHQQAMQGHMGIRPMGLNNNNGLQHQMHHH ETALAANNAGPNDASGGGKPDGTNMSQSGADGQGGSAARHGGGDAKTEGK(SEQ ID Νο·97);或
[0225] ii)由以下核苷酸序列编码：
[0226] ATGCAGCAATCTCCACAGATGATTCCGATGGTTCTTCCTTCATTTCCGCCCACCAATAATATCACCAC CGAACAGATCCAAAAGTATCTTGATGAGAACAAGAAGCTGATAATGGCGATCTTGGAAAATCAGAACCTCGGTAAA CTTGCAGAATGTGCTCAGTATCAAGCTCTTCTCCAGAAGAATTTGATGTATCTCGCTGCAATTGCGGATGCTCAAC CTCAGCCACCAGCAGCTACACTAACATCAGGAGCCATGACTCCCCAAGCAATGGCTCCTAATCCGTCATCAATGCA GCCACCACCAAGCTACTTCATGCAGCAACATCAAGCTGTGGGAATGGCTCAACAAATACCTCCTGGGATTTTCCCT CCTAGAGGTCCATTGCAATTTGGTAGCCCGCATCAGTTTCTGGATCCGCAGCAACAGTTACATCAACAAGCTATGC AAGGGCACATGGGGATTAGACCAATGGGTTTGAATAATAACAACGGACTGCAACATCAAATGCACCACCATGAAAC TGCTCTTGCCGCAAACAATGCGGGTCCTAACGATGCTAGTGGAGGAGGTAAACCGGATGGGACCAATATGAGCCAG AGTGGAGCTGATGGGCAAGGTGGCTCAGCCGCTAGACATGGCGGTGGTGATGCAAAAACTGAAGGAAAATGA(SEQ IDNo.91)，或
[0227] iii)由与SEQ ID No. 91至少70%、优选地80%、更优选地90%、甚至更优选地 95 %相同的核苷酸序列编码；或
[0228] iv)由严谨条件下与SEQ ID No. 91杂交的核苷酸序列编码。
[0229] 在一个实施方案中，本发明使用的GIF可以是命名为0sllg40100的GIF，其中， 0sllg40100i)包含本文中作为以下显示的氨基酸或与之具有至少80%同一性的氨基酸序 列：
[0230] MQQQMAMPAGAAAAAVPPAAGITTEQIQKYLDENKQLILAILENQNLGKLAECAQYQAQLQKNLLYLAA IADAQPPQNPGSRPQMMQPGATPGAGHYMSQVPMFPPRTPLTPQQMQEQQQQQLQQQQAQALAFPGQMLMRPGTVNG MQSIPVADPARAADLQTAAPGSVDGRGNKQDATSEPSGTESHKSAGADNDAGGDIAEKS(SEQ ID No.98);或
[0231] ii)由以下核苷酸序列编码：
[0232] ATGCAGCAGCAGATGGCCATGCCGGCGGGGGCCGCCGCCGCCGCGGTGCCGCCGGCGGCCGGCATCAC CACCGAGCAGATCCAAAAGTATTTGGATGAAAATAAACAGCTAATTTTGGCCATCCTGGAAAATCAAAACCTAGGG AAGTTGGCTGAATGTGCTCAGTACCAAGCTCAGCTTCAAAAGAATCTCTTGTATCTGGCTGCCATTGCAGATGCC CAACCACCTCAGAATCCAGGAAGTCGCCCTCAGATGATGCAGCCTGGTGCTACCCCAGGTGCTGGGCATTACATG TCCCAAGTACCGATGTTCCCTCCAAGAACTCCCTTAACCCCACAACAGATGCAAGAGCAGCAGCAGCAGCAACTC CAGCAACAGCAAGCTCAGGCTCTAGCCTTCCCCGGCCAGATGCTAATGAGACCAGGTACTGTCAATGGCATGCAA TCTATCCCAGTTGCTGACCCTGCTCGCGCAGCCGATCTTCAGACGGCAGCACCGGGCTCGGTAGATGGCCGAGGA AACAAGCAGGATGCAACCTCGGAGCCTTCCGGGACCGAGAGCCACAAGAGTGCGGGAGCAGATAACGACGCAGGC GGTGACATAGCGGAGAAGTCCTGA(SEQID No. 92)，或
[0233] iii)由与SEQ ID No. 92至少70%、优选地80%、更优选地90%、甚至更优选地 95 %相同的核苷酸序列编码；或
[0234] iv)由严谨条件下与SEQ ID No. 92杂交的核苷酸序列编码。
[0235] 在一个实施方案中，根据本发明使用的GIF可以是命名为0sl2g31350的GIF，其 中，0sl2g31350i)包含本文中作为以下显示的氨基酸或与之具有至少80%同一性的氨基 酸序列：
[0236] MQQQPMPMPAQAPPTAGITTEQIQKYLDENKQLILAILENQNLGKLAECAQYQAQLQKNLLYLAAIADT QPQTTISRPQMVPHGASPGLGGQYMSQVPMFPPRTPLTPQQMQEQQLQQQQAQLLSFGGQMVMRPGVVNGIPQLLQG EMHRGADHQNAGGATSEPSESHRSTGTENDGGSDFGDQS(SEQ ID No.99);或
[0237] ii)由以下核苷酸序列编码：
[0238] ATGCAGCAGCAGCCGATGCCGATGCCCGCGCAGGCGCCGCCGACGGCCGGAATCACCACCGAGCAGATC CAAAAGTATCTGGATGAAAACAAGCAGCTTATTTTGGCTATTTTGGAAAATCAGAATCTGGGAAAGTTGGCAGAATG TGCTCAGTATCAAGCGCAGCTTCAGAAGAATCTCTTGTACTTGGCTGCAATTGCTGATACTCAACCGCAGACCACTA TAAGCCGTCCCCAGATGGTGCCGCATGGTGCATCGCCGGGGTTAGGGGGGCAATACATGTCGCAGGTGCCAATGTTC CCCCCCAGGACCCCTCTAACGCCCCAGCAGATGCAGGAGCAGCAGCTGCAGCAACAGCAAGCCCAGCTGCTCTCGTT CGGCGGTCAGATGGTTATGAGGCCTGGCGTTGTGAATGGCATTCCTCAGCTTCTGCAAGGCGAAATGCACCGCGGAG CAGATCACCAGAACGCTGGCGGGGCCACCTCGGAGCCTTCCGAGAGCCACAGGAGCACCGGCACCGAAAATGACGGT GGAAGCGACTTCGGCGATCAATCCTAA(SEQ ID No. 93)，或
[0239] iii)由与SEQ ID No. 93至少70%、优选地80%、更优选地90%、甚至更优选地 95 %相同的核苷酸序列编码；或
[0240] iv)由严谨条件下与SEQ ID No. 93杂交的核苷酸序列编码。
[0241] 在一个实施方案中，根据本发明使用的GIF可以是命名为0s03g52320的GIF，其 中，0s03g52320i)包含本文中作为以下显示的氨基酸或与之具有至少80%同一性的氨基 酸序列：
[0242] MQQQHLMQMNQGMMGGYASPTTVTTDLIQQYLDENKQLILAILDNQNNGKVEECARNQAKLQHNLMYLA AIADSQPPQTAAMSQYPSNLMMQSGARYMPQQSAQMMAPQSLMAARSSMMYAQPALSPLQQQQQQQAAAAHGQLGMG SGGTTSGFSILHGEASMGGGGGGGGAGNSMMNAGVFSDFGRGGGGGGKEGSTSLSVDVRGANSGAQS⑶GEYLKGTL· EEGS(SEQ ID No. 100);或
[0243] ii)由以下核苷酸序列编码：
[0244] ATGCAGCAGCAACACCTGATGCAGATGAACCAGGGCATGATGGGGGGATATGCTTCCCCTACCACCGTC ACCACTGATCTCATTCAGCAGTATCTGGATGAGAACAAGCAGCTGATCCTGGCCATCCTTGACAACCAGAACAATGG GAAGGTGGAAGAGTGCGCTCGGAACCAAGCTAAGCTCCAGCACAATCTCATGTACCTCGCCGCCATCGCCGACAGCC AGCCGCCGCAGACGGCCGCCATGTCCCAGTATCCGTCGAACCTGATGATGCAGTCCGGGGCGAGGTACATGCCGCAG CAGTCGGCGCAGATGATGGCGCCGCAGTCGCTGATGGCGGCGAGGTCTTCGATGATGTACGCGCAGCCGGCGCTGTC GCCGCTCCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGGCGGCGGCGGCGCACGGGCAGCTGGGCATGGGCTCGGGGGGCACCACCA GCGGGTTCAGCATCCTCCACGGCGAGGCCAGCATGGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGTGGCGCCGGTAACAGCATGATG AACGCCGGCGTGTTCTCCGACTTCGGACGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCAAGGAGGGGTCCACCTCGCTGTCCGTCGA CGTCCGGGGCGCCAACTCCGGCGCCCAGAGCGGCGACGGGGAGTACCTCAAGGGCACCGAGGAGGAAGGCAGCTAG( SEQ ID No. 94)，或
[0245] iii)由与SEQ ID No. 94至少70%、优选地80%、更优选地90%、甚至更优选地 95 %相同的核苷酸序列编码；或
[0246] iv)由严谨条件下与SEQ ID No. 94杂交的核苷酸序列编码。
[0247] 另外，发明人已经证实，GIFUGIF2和GIF3的过量表达促进细胞增殖和叶尺寸，并 且GIF2和GIF3蛋白是GIF1的功能等同物（见图43连同图9)。
[0248] 先前，Horiguchi等人（2005)已经证实GIF1/AN3基因的过量表达也刺激细胞增 殖，导致叶扩大约20%。
[0249] 这些结果表明，全部GIF基因均以冗余方式作为细胞增殖的正调节物发挥作用， 因而决定植物器官尺寸。
[0250] 因此本发明涉及本发明的任何GIF基因的用途。
[0251] 此外，本发明还涉及GIF基因的组合。
[0252] 在一个方面，序列优选地处于分离的形式。术语"分离的"意指该序列至少基本上 不含至少一种其他组分，所述其他组分与所述序列在自然界中天然连接并且如自然界中所 找到那样的。
[0253] 在一个方面，序列优选地处于纯化的形式。术语"纯化"意指该序列处于相对纯的 状态-例如至少约90%纯度、或至少约95%纯度或至少约98%纯度。
[0254] 如本文所用，术语"核苷酸序列"或"核酸"指寡核苷酸序列或多核苷酸序列，及其 变体、同源物、片段和衍生物（如其部分）。核苷酸序列可以是基因组来源或合成来源或重 组来源的，它可以是双链或单链的，无论代表有义或反义链。
[0255] 对于本发明而言，术语"核苷酸序列"或"核酸"包括基因组DNA、cDNA、合成性DNA 和RNA。优选地，它意指DNA，更优选地意指编码本发明的cDNA序列。
[0256] 在一个优选实施方案中，当涉及本发明自身范围并且由其涵盖时，核苷酸序列不 包括这样的本发明天然核苷酸序列，此时所述天然核苷酸序列处于其天然环境中和与其天 然结合的序列连接，所述天然结合的序列也处于其天然环境中。为便于参考，这个优选的实 施方案应当称作"非天然核苷酸序列"或"非天然核酸"
[0257] -般，使用重组DNA技术（即重组DNA)制备由本发明范围涵盖的核苷酸序列或核 酸。然而，在本发明的可选实施方案中，可以使用本领域熟知的化学方法完全或部分地合 成核苷酸序列或核酸（见 Caruthers MH 等人，（1980)Nuc Acids Res Symp Ser215_23 和 Horn T 等人，（1980) Nuc Acids ResSymp Ser225-232)。
[0258] 由于遗传密码中的简并性，可以容易地产生这些核苷酸序列，其中对于原始核 苷酸序列编码的一些或全部氨基酸，已经改变了三联体密码子使用，因而产生与原始 核苷酸序列具有低同源性，但编码如原始核苷酸序列所编码相同的氨基酸序列或变体 的核苷酸序列。例如，对于大部分氨基酸，遗传密码的简并性在三联体密码子中的第 三位置（摇摆位置）处（文献参见Stryer, Lubert, Biochemistry,第3版，Freeman Press, ISBN0-7167-1920-7)，因此，其中全部三联体密码子已经在第三位置内"摇摆"的核 苷酸序列将与原始核苷酸序列相同约66%。然而，修订的核苷酸序列将编码与原始核苷酸 序列相同或变异的一级氨基酸序列。
[0259] 因此，本发明在一些实施方案中还涉及任何核苷酸序列，所述核苷酸序列具有至 少一个编码氨基酸的三联体密码子的可选三联体密码子使用，但是编码与原始核苷酸序列 编码的多肽序列相同的或变异的多肽序列。
[0260] 另外，特定生物一般对于使用何种三联密码子来编码氨基酸具有偏好。优选的密 码子使用表是广泛地可获得的，并且可以用来制备密码子优化的基因。这类密码子优化技 术常规地用来优化转基因在异源宿主中的表达。
[0261] 本发明还涵盖与本发明序列具有同一性或相似性的序列的用途。
[0262] 这里，术语"同一性"意指与氨基酸序列和核苷酸序列具有某种同一性的实体。同 一性意指与另一个序列比较时，一个序列中相同的氨基酸或碱基的百分数。
[0263] 这里，术语"相似性"意指具有相似化学特性/功能的实体。因此，术语"相似性" 考虑保守性变化。
[0264] 在本发明中，具有某个同一性或相似性百分数的序列意在包括可以与本发明序列 (主题序列）相同至少90%、优选地相同至少95%、96%、97%、98%或99%的序列。一般， 该序列将包含与主题序列相同的活性部位等的编码序列。
[0265] 同一性或相似性比较可以通过肉眼或更常见地借助可容易获得的序列比较程序 进行。可获得的计算机程序可以计算两个或更多个序列之间的同一性百分数和相似性百分 数。
[0266] 同一性百分数可以在连续序列内计算，S卩，将一个序列与另一个序列比对并且将 一个序列中的每个氨基酸与另一个序列中的相应氨基酸直接比较，一次一个残基。这称作 "无空位"比对。一般，这类无空位比对仅在数目相对小的残基内进行。
[0267] 尽管这是非常简单且稳定的方法，但是它没有考虑到如在其它方面相同的成对序 列中，一个插入或缺失将导致随后的氨基酸残基无法比对，因此可能造成在进行整体比对 时的同源性％大大降低。因此，大部分序列比较方法设计成产生最佳比对结果，所述的最佳 比对结果考虑了可能的插入和缺失，而没有过度地罚除总体同源性评分。这通过在序列比 对中插入"空位"以试图使局部同源性最大化来实现。
[0268] 然而，这些更复杂的方法向比对中出现的每个空位赋予"空位罚分"，使得对于相 同数目的相同氨基酸，具有尽量少缺口的序列比对（反映了两个比较的序列间更高的相关 性）将比具有更多缺口的序列比对达到更高的得分。一般使用"仿射空位成本"，它对缺口 的存在处以较高罚分，而对缺口中的每个后续残基处以较低罚分。这是最常用的空位评分 系统。高空位罚分当然将产生具有更少空位的优化比对。大多数比对程序允许修正空位 罚分。然而，使用这种软件用于序列比较时，优选使用默认值。例如，使用GCG Wisconsin Bestfit软件包时，氨基酸序列的默认空位罚分是空位-12和每个延伸-4。
[0269] 因此，最大同一性％的计算首先要求在考虑空位罚分的情况下产生最佳比对。 适合用于开展此类比对的计算机程序有GCG Wisconsin Bestfit软件包（Devereux等 人，1984Nuc. Acids Researchl2第387页）。可以执行序列比较的其他软件的例子包括但 不限于 BLAST 软件包（见 Ausubel 等人，1999Short Protocols in Molecular Biology,第 4 版-第 18 章）、FASTA(Altschul 等人，11990J. Mol. Biol. 403-410)和 GENEWORKS 比较工 具软件包。BLAST和FASTA均可用于离线检索和在线检索（见Ausubel等人，1999, Short Protocols in Molecular Biology,第 7-58 页至第 7-60 页）。
[0270] 然而，对于一些应用，优选使用GCG Bestfit程序。称作BLAST2Sequence的一种 新工具也可用于比较蛋白质和核苷酸序列（见FEMS Microbiol Lettl999174(2) :247-50 ; FEMS Microbiol Lettl999177 (1):187-8 和 tatianaOncbi. nlm. nih. gov)。
[0271] 尽管可以就同一性方面测定最终的同一性％，然而比对过程本身一般不基于全是 或全非的成对比较。相反，通常使用比例相似性评分矩阵，该评分矩阵基于化学相似性或进 化距离对每个成对比较分配评分。此种常使用的矩阵的例子是BL0SUM62矩阵-即用于程 序BLAST套装的默认矩阵。GCG Wisconsin程序通常使用公共默认值或所提供的定制符号 比较表（关于进一步细节，见用户手册）。对于一些应用，优选使用GCG软件包的公共默认 值，或在其他软件的情况下，优选使用默认矩阵，如BL0SUM62。
[0272] 或者，也可以基于与CLUSTAL类似的算法（Higgins DG和Sharp PM (1988)，Gene73 (1)，237-244)，使用 DNASIS? (Hitachi Software)中的多重比对特征计算 同一性百分数。
[0273] 通常，在至少50个、优选地至少100个、优选地至少200个连续碱基或残基范围内 计算同一性百分数。优选地，使用全长序列计算同一性百分数。
[0274] -旦软件已经产生最佳比对，则可能计算序列同一性％。该软件一般将此作为序 列比较的一部分并产生数值结果。
[0275] 序列也可以具有产生沉默改变并且产生功能性等同物的氨基酸残基的缺失、插 入或置换。可以基于氨基酸特性（如残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或两 亲性质）方面的相似性进行谨慎的氨基酸取代，并且因此有用的是将氨基酸按官能团归 集在一起。氨基酸可以单独基于其侧链特性归集在一起。然而更有用的是还包括突变数 据。因此出于结构性原因，导出的氨基酸集合可能是保守的。这些集合可以按Venn简图 形式描述（Livingstone C. D.和 Barton G. J. (1993)''Protein sequence alignments:a strategy for the hierarchical analysis of residue conservation〃Comput. Appl Biosci. 9:745-756)(Taylor W. R. (1986)"The classification of amino acid conservation"】· Theor. Biol. 119 ;205_218)。可以例如根据描述普遍接受的氨基酸Venn 简图分组的下表，产生保守性置换。
[0276]
【权利要求】
1. 分离的核酸，所述核酸编码修饰型生长调节因子（GRF)-3或其直向同源物，并且所 述核酸脱离miR396控制。
2. 分离的核酸，所述核酸包含脱离miR396控制的修饰型GRF-3基因（或由脱离miR396 控制的修饰型GRF-3基因组成）。
3. 根据权利要求1或权利要求2所述的分离的核酸，其中，所述核酸包含突变的 miR396靶位点。
4. 根据前述权利要求中任一项所述的分离的核酸，其中，所述核酸编码具有FFD (例如 FFD(D/E)WP)基序的蛋白质。
5. 根据前述权利要求中任一项所述的分离的核酸，其中，生长调节因子（GRF)是选自 以下的已经脱离miR396控制的GRF:拟南芥（Arabidopsis thaliana)GRF3或4;稻（Oryza sativa)GRFl、2、3、4 或 5;玉蜀黍（Zea mays)GRFl、3、5、6、7、9、ll 或 14;大豆（Glycine max)GRF ;漢藜苜猜（Medicago truncatula)GRF ;毛果杨（Populus trichocarpa)GRF、番木
6. 根据前述权利要求中任一项所述的分离的核酸，包含i)SEQ ID No. 2(AtGRF3)所示 的核苷酸序列；ii)或与SEQ ID No. 2相同至少45%、优选至少50%、优选至少60%、优选 至少65%的核苷酸序列；或iii)在严谨条件下与i)或ii)的核苷酸序列杂交的核苷酸序 列，其中所述核苷酸序列在miR396靶位点中包含使核酸脱离miR396控制的修饰。
7. 根据权利要求1-5中任一项所述的分离的核酸，所述核酸包括i)SEQ ID No. 3、SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 5、SEQ ID No. 6、SEQ ID No. 7、SEQ ID No. 8、SEQ ID No. 9、SEQ ID No. 10、SEQ ID No. 11、SEQ ID No. 12、SEQ ID No. 13、SEQ ID No. 14、SEQ ID No. 15、SEQ ID No. 16、SEQ ID No. 17、SEQ ID No. 18、SEQ ID No. 19 或 EQ ID No. 88 所示的核苷酸序 列；ii)或与 SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No. 8、SEQ ID No. 9、SEQ ID No. 10、SEQ ID No. 11、SEQ ID No. 12、SEQ ID No. 13、SEQ ID No. 14、SEQ ID No. 15、SEQ ID No. 16、SEQ ID No. 17、SEQ ID No. 18、SEQ ID No.19 或 SEQ ID No. 88相同至少45%、优选至少50%、优选至少60%、优选至少65%的核苷酸序列；或 iii)在严谨条件下与i)或ii)的核苷酸序列杂交的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列在 miR396靶位点中包含使核酸脱离miR396控制的修饰。
8. 根据前述权利要求中任一项所述的分离的核酸，其中，脱离miR396调节的GRF-3或 其直向同源物与至少一个GIF基因的过量表达的组合，显示出增强的性能，所述至少一个 GIF 基因是，例如 GIFl、AtGIF2、AtGIF3、0sllg40100、0sl2g31350、0s03g52320 或其组合。
9. 根据前述权利要求中任一项所述的分离的核酸，其中修饰型GRF3或其直向同源 物在miR396靶位点中包含至少一个或全部以下碱基变化：A->U、G->A、U->A、U->G、G->C、 A->T、G->A、T->A、G->A、A->G修饰，所述碱基变化均保留天然氨基酸序列，但是使miR396与 所述rGRF3的相互作用实质上去稳定化。
10. 根据前述权利要求中任一项所述的分离的核酸，其中修饰型GRF3或其直向同源物 包含具有以下序列的修饰型miR396靶位点：CGTTCxAGAAAxCCxGTxGAx(SEQ ID No. 86)，其中 x表示（例如与野生型序列相比）已经修饰的碱基。
11. 根据前述权利要求中任一项所述的分离的核酸，其中修饰型GRF3或其直向同源物 包含具有以下序列的修饰型miR396靶位点：CGTTCtAGAMaCCaGTaGAg(SEQ ID No. 38)，其中 小与字母表不修饰的喊基。
12. 构建体，其包含与启动子和终止子可操作的连接的权利要求1-11中任一项所述的 核酸。
13. 根据权利要求12所述的构建体，其中，所述启动子是组织特异性启动子。
14. 根据权利要求12或权利要求13所述的构建体，其中，所述启动子包含非对称叶 l(AS-l)启动子或 AINTEGUMENTA(ANT)启动子。
15. 载体，其包含根据权利要求1-11中任一项所述的核酸或根据权利要求12-14中任 一项所述的构建体。
16. 植物、植物细胞或植物组织，其包含根据权利要求1-11中任一项所述的核酸、根据 权利要求12-14中任一项所述的构建体或根据权利要求15所述的载体。
17. 根据权利要求16所述的植物、植物细胞或植物组织，所述植物还包含修饰型 GRF2 (rGRF2)，所述修饰型GRF2也脱离miR396控制。
18. 根据权利要求16或权利要求17所述的植物、植物细胞或植物组织，所述植物、 植物细胞或植物组织还包含至少一个过量表达的GIF基因，例如GIF1、AtGIF2、AtGIF3、 0sllg40100、0sl2g31350、0s03g52320 或它们的组合。
19. 根据权利要求16-18中任一项所述的植物、植物细胞或植物组织，其中，所述植物、 植物细胞或植物组织包含多于一种（例如2种、例如3种）的权利要求1-11中任一项所述 的核酸。
20. 根据权利要求16-19中任一项所述的植物、植物细胞或植物组织或宿主植物，其 中，所述植物是芸苔属（Brassica)植物。
21. 根据权利要求20所述的植物、植物细胞或植物组织或宿主植物，其中所述植物是 甘蓝（Brassica oleracea) 〇
22. 产生植物的方法，所述植物具有增加的生产率（例如以下一者或多者：增加的产 量、增加的生物量、增加的胁迫抗性、增加的耐旱性、延迟的叶衰老、增加的种子产生、增加 的种子产量、增加的根生长、增加的根伸长速度及其组合），所述方法包括用根据权利要求 1-11中任一项所述的核酸或根据权利要求12-14中任一项所述的构建体或根据权利要求 15所述的载体转化植物。
23. 使用权利要求1-11中任一项所述的核酸的方法，所述方法包括将权利要求1-11中 任一项所述的核酸或权利要求12-14中任一项所述的构建体或权利要求15所述的载体引 入植物中。
24. 根据权利要求23所述的方法，其中，所述植物具有增加的生产率（例如以下一者或 多者：增加的产量、增加的生物量、增加的胁迫抗性、增加的耐旱性、延迟的叶衰老、增加的 种子产生、增加的种子产量、增加的根生长、增加的根伸长速度或其组合）。
25. 根据权利要求22或权利要求24所述的方法，其中，所述增加的生物量包括选自以 下的一者或多者：增加的总体植物生物量、增加的鲜重、增加的叶面积或尺寸、增加的根长 度、增加的干重、增加的茎生长、增加的茎生物量、增加的茎直径和开花时增加的茎宽度。
26. 根据权利要求22或权利要求25中任一项所述的方法，其中，所述增加的生产率 (例如增加的产量、增加的生物量、增加的胁迫抗性、增加的耐旱性、延迟的叶衰老、增加的 种子产生、增加的种子产量、增加的根生长、增加的根伸长速度或其组合）在不存在有害叶 形状变化（例如向下卷曲）的情况下出现。
27. 根据权利要求22-26中任一项所述的方法，其中，优选地通过使用组织特异性启动 子，使增加的生物量与延迟的叶衰老脱离。
28. 根据权利要求22-27中任一项所述的方法，其中，增加的生产率（例如增加的产 量、增加的生物量、增加的胁迫抗性、增加的耐旱性、延迟的叶衰老、增加的种子产生、增加 的种子产量、增加的根生长、增加的根伸长速度或其组合）是指与野生型植物或包含修饰 型GRF2 (rGRF2)的植物相比时增加的生产率。
29. 根据权利要求1-11中任一项所述的核酸或根据权利要求12-14中任一项所述的构 建体或根据权利要求15所述的载体，其用于产生植物，所述植物具有增加的生产率（例如， 选自增加的产量、增加的生物量、增加的胁迫抗性、增加的耐旱性、延迟的叶衰老、增加的种 子产生、增加的种子产量、增加的根生长、增加的根伸长速度及其组合）。
30. 根据权利要求29所述的核酸，其中，所述增加的生物量包括选自以下的一者或多 者：增加的总体植物生物量、增加的胁迫抗性、增加的鲜重、增加的叶面积或尺寸、增加的根 长度、增加的干重、增加的茎生长、增加的茎生物量、增加的茎直径和开花时增加的茎宽度。
31. 根据权利要求29或权利要求30所述的核酸，其中，所述增加的生物量、增加的胁迫 抗性、增加的耐旱性、延迟的叶衰老或其组合在不存在有害叶形状变化例如向下卷曲的情 况下出现。
32. 根据权利要求29-31中任一项所述的核酸，其中，优选通过使用组织特异性启动 子，使所述增加的生物量与延迟的叶衰老脱离。
33. 根据权利要求29-32中任一项所述的核酸，其中，所述增加的生物量、增加的胁迫 抗性、增加的耐旱性、延迟的叶衰老或其组合是与野生型植物或包含修饰型GRF2(rGRF2) 的植物相比。
34. 根据权利要求1-11中任一项所述的核酸或根据权利要求12-14中任一项所述的构 建体或根据权利要求15所述的载体在产生用于增加生产率（例如，选自增加的产量、增加 的生物量、增加的胁迫抗性、增加的耐旱性、延迟的叶衰老、增加的种子产生、增加的种子产 量、增加的根生长、增加的根伸长速度或其组合）的植物中的用途。
35. 根据权利要求34所述的用途，其中，增加的生物量包括选自以下的一者或多者：增 加的总体植物生物量、增加的鲜重、增加的叶面积或尺寸、增加的根长度、增加的干重、增加 的茎生长、增加的茎生物量、增加的茎直径和开花时增加的茎宽度。
36. 根据权利要求34或权利要求35所述的用途，其中，所述增加的生产率（例如增加 的产量、增加的生物量、增加的胁迫抗性、增加的耐旱性、延迟的叶衰老、增加的种子产生、 增加的种子产量、增加的根生长、增加的根伸长速度或其组合）在不有害地改变叶形状的 情况下，例如在不造成向下卷曲的情况下出现。
37. 根据权利要求34-36中任一项所述的用途，其中，优选通过使用组织特异性启动 子，使所述增加生物量与延迟叶衰老脱离。
38. 根据权利要求34-37中任一项所述的方法，其中，所述增加的生产率（例如增加的 产量、增加的生物量、增加的胁迫抗性、增加的耐旱性、延迟的叶衰老、增加的种子产生、增 加的种子产量、增加的根生长、增加的根伸长速度或其组合）是与野生型植物或包含修饰 型GRF2 (rGRF2)的植物相比时增加的生产率。
39.如参考实施例和附图在本文中整体描述的核酸、构建体、载体、植物、植物细胞或植 物组织、方法或用途。
【文档编号】A01H5/00GK104093844SQ201380004805
【公开日】2014年10月8日 申请日期:2013年1月4日 优先权日:2012年1月4日
【发明者】J·帕拉特尼克, R·罗德里格斯, M·麦卡奇亚, J·M·德伯纳蒂 申请人:国立罗萨里奥大学, 国家科学和技术研究委员会(Conicet)