一种苦荞的快速再生组织培养方法_2

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具体实施方式】
[0029]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合实施例,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
[0030]下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。
[0031]如图1所示,本发明实施例的苦荞的快速再生组织培养方法包括以下步骤:
[0032]SlOl:苦荞麦组织培养无菌苗的获得:选择颗粒饱满的苦荞种子,在100mg/L的赤霉素溶液中浸泡2h,剥去种皮,之后用75%的乙醇浸泡60s,再用10%的次氯酸钠(其中含有0.1 % Tween 20)震荡处理8min,接着使用无菌水冲洗3次,每次5min,最后,将灭菌后的种子均匀铺于滤纸上,吸干其表面残留水分后均匀播撒至MS培养基上,之后,将处理好的种子放于光照培养箱中,温度为白天25°C光照16h,夜间20°C持续8h ;
[0033]S102:苦荞麦快速再生外植体的制备:取12-15日龄的苦荞麦无菌苗,在超净工作台内剪取苦荞组培苗的顶端分生组织作为外植体;
[0034]S103:苦荞麦丛生芽的诱导:将剪取的苦荞麦外植体倾斜45°插入培养基之中,每个培养基中接种数5-10个外植体;苦荞麦丛生芽诱导培养基的配置为MS基础培养基中添加2.0mg/L 6-BA和0.5mg/L TDZ,之后,将接种好苦荞麦外植体的培养皿置于暗室中进行暗处理,处理时间为2天,之后将其置于人工光照培养箱中进行不定芽的诱导;期间,光照培养箱中光照强度为2000LUX,光照时间为白天16h、夜间8h,温度为白天25°C、夜间20 V,3-5周后在培养皿中即可得到众多诱导的不定芽;
[0035]S104:苦荞麦再生芽诱导生根:将上述诱导出的苦荞麦不定芽从基部切下,将其垂直插入到生根培养基中,每瓶接种数为8-10株,瓶中生根培养基的配置为1/2MS基础培养基中添加1.0mg/L IBA ;随后将培养瓶放置于人工光照培养箱中进行生根培养,光照培养箱中光照强度为2000Lux,光照时间为白天16h、夜间8h,温度为白天25°C、夜间20°C,2_3周后在组培瓶中的不定芽即可生根;
[0036]S105:苦荞再生植株的炼苗与移栽:选择组培瓶中生长健壮的苦荞麦再生苗,打开瓶盖,轻轻洗去不定根上的培养基,注意不要伤及根部,将其移栽到装有营养土的花盆中,在室内炼苗4-6天,再将花盆中的再生苦荞麦幼苗取出,最后移栽至松软的土壤中生长。
[0037]上述所有培养基的pH值为5.8-6.2,同时添加0.25%的植物凝胶。
[0038]进一步,所述的MS基础培养基组分如下:
[0039]20 XMS 大量元素母液:NH4N03 33.0g, KN03 38.0g, MgS04.7H20 7.4g,KH2P043400mg ;
[0040]200 XMS 微量元素母液:KI 0.166g, H3B03 1.24g,MnS04.4H20 4.46g,ZnS04.7H20 1.72g,Na2Mn04.2H20 0.05g,CuS04.5H20 0.005g, CoC12.6H20 0.005g ;
[0041]200 X MS 铁盐母液:FeS04.7H20 5.56g,Na2_EDTA.2H20 7.46g ;
[0042]200 XMS 有机母液:肌醇 20.0g,烟酸 0.lg, VB6 0.lg, VBl 0.lg,甘氨酸 0.4g ;
[0043]20 XMS 钙盐母液:CaC12 6.64g。
[0044]进一步,所述MS基础培养基制备方法如下:
[0045]组分称量后,使用去离子水溶解并定容到IL ;置于121°C高压灭菌锅中灭菌15min备用;
[0046]MS基础培养基的配置:20X大量元素母液50mL,200 X微量元素母液5mL,200 X铁盐母液5mL,20 X钙盐母液50mL,200 X有机母液5mL,植物凝胶2.5g,蔗糖30g ;
[0047]1/2MS培养基的配置:20 X大量元素母液25mL,200 X微量元素母液2.5mL,200 X铁盐母液2.5mL,20 X钙盐母液25mL,200 X有机母液2.5mL,植物凝胶2.5g,蔗糖20g ;
[0048]使用去离子水定容到1L,再用0.5M NaOH调节PH值至5.8—6.2之间,最后,将其置于121°C高压灭菌锅中灭菌15min。
[0049]进一步,所述苦荞麦丛生芽的诱导具体包括:将剪取的苦荞麦外植体倾斜45°插入苦荞麦丛生芽诱导培养基之中,每个培养基中接种数5-10个外植体;苦荞麦丛生芽诱导培养基的配置为MS基础培养基中添加2.0mg/L 6-BA和0.5mg/L TDZ,之后,将接种好苦荞麦外植体的培养皿置于暗室中进行暗处理,处理时间为2天,之后将其置于人工光照培养箱中进行不定芽的诱导;期间,光照培养箱中光照强度为2000LUX,光照时间为白天16h、夜间8h,温度为白天25°C、夜间20°C,3-5周后在培养皿中即可得到众多诱导的不定芽。
[0050]进一步,所述苦荞麦再生芽诱导生根具体包括:将诱导出的苦荞麦不定芽从基部切下,垂直插入到苦荞麦生根培养基中,每瓶接种数为8-10株,苦荞麦生根培养基的配置为1/2MS基础培养基中添加1.0mg/L IBA ;随后将培养瓶放置于人工光照培养箱中进行生根培养,光照培养箱中光照强度为2000Lux,光照时间为白天16h、夜间8h,温度为白天25°C、夜间20°C,2-3周后在组培瓶中的不定芽即可生根。
[0051]进一步,所述苦荞麦丛生芽的诱导之前需要制备苦荞麦快速再生外植体,具体包括:
[0052]苦荞麦组织培养无菌苗的获得:选择颗粒饱满的苦荞种子,在100mg/L的赤霉素溶液中浸泡2h,剥去种皮,之后用75%的乙醇浸泡60s,再用10%的次氯酸钠震荡处理8min,接着使用无菌水冲洗3次,每次5min,最后,将灭菌后的种子均匀铺于滤纸上,吸干其表面残留水分后均匀播撒至MS培养基上,之后,将处理好的种子放于光照培养箱中,温度为白天25°C光照16h,夜间20°C持续8h ;
[0053]苦荞麦快速再生外植体的制备:取12-15日龄的苦荞麦无菌苗,在工作台内剪取苦荞组培苗的顶端分生组织作为外植体。
[0054]进一步,所述苦荞再生植株的炼苗与移栽:选择组培瓶中生长健壮的苦荞麦再生苗,打开瓶盖,洗去不定根上的培养基,移栽到装有营养土的花盆中,在室内炼苗4-6天,再将花盆中的再生苦荞麦幼苗取出,最后移栽至松软的土壤中生长。
[0055]进一步,所述MS基础培养基的pH值为5.8-6.2,同时添加0.25%的植物凝胶。
[0056]下面结合具体实施例对本发明的应用原理作进一步的说明。
[0057](I)分别以苦荞地方品种“园子荞”、“西昌苦荞”以及主要栽培品种“川荞3号”为实施对象,首先在100mg/L的赤霉素溶液中浸泡2h,剥去种皮,之后利用75%的乙醇浸泡60s,再用10%的次氯酸钠(其中含有0.1% Tween 20)震荡处理8min,接着使用无菌水冲洗3次,每次5min。再将种子均匀铺于滤纸上,吸干其表面残留水分,均匀播撒至MS培养基上。之后,将处理好的种子放于光照培养箱中,温度为白天25°C光照16h,夜间20°C持续8h。
[0058](2)在超净工作台内分别剪取12-15日龄的“园子荞”、“西昌苦荞”以及“川荞3号”的顶端分生组织作为快速再生外植体,并在超净工作台中,将剪取的苦荞外植体倾斜45 °插入苦荞丛生芽诱导培养基之中,苦荞丛生芽诱导培养基为MS基础培养基中添加2.0mg/L6-BA和0.5mg/L TDZ, 3 %的蔗糖,0.25 %的植物凝胶;
[0059](3)将接种有苦荞外植体的培养皿置于暗室中进行暗处理,处理时间为2d。之后将其放置于人工光照培养箱中进行苦荞麦丛
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