于cDNA序列，连续的外显子由交 替下划线文本分隔开。对于蛋白质序列，信号肽以下划线表示，跨膜和胞质序列以斜体表 不。
[0090] 表 3
[0091]
[0092]
「00931
[0095]
[0096] 人源化SIRPa非人动物
[0097] 提供在非人动物的免疫细胞(例如骨髓细胞)的表面上表达人源化人SIRPa蛋白的 非人动物，所述非人动物由对编码SIRPa蛋白的非人动物的内源基因座的基因修饰获得。本 文所述的合适的实例包括啮齿动物，特别是小鼠。
[0098] 人源化SIRPa基因，在一些实施方案中，包含来自异源物种(例如人）的遗传材料， 其中人源化SIRPa基因编码SIRPa蛋白，所述SIRPa蛋白包含来自异源物种的遗传材料的编 码部分。在一些实施方案中，本发明的人源化SIRPa基因包含异源物种的基因组DNA，所述基 因组DNA相应于在细胞质膜上表达的SIRPa蛋白的胞外部分。还提供含有所述人源化SIRPa 基因的非人动物，胚胎，细胞和用于制备非人动物、胚胎、细胞的靶向构建体。
[0099]在一些实施方案中，内源SIRPa基因被缺失。在一些实施方案中，内源SIRPa基因被 改变，其中一部分内源SIRPa基因被替换为异源序列（例如全部或部分人SIRPa基因）。在一 些实施方案中，全部或基本上全部的内源SIRPa基因被替换为异源基因（例如人SIRPa基 因）。在一些实施方案中，异源SIRPa基因的一部分被插入到内源SIRPa基因座上的内源非人 SIRPa基因中。在一些实施方案中，异源基因是人基因。在一些实施方案中，对内源SIRPa基 因的两个拷贝中的一个进行修饰或人源化，获得人源化SIRPa基因杂合的非人动物。在其它 实施方案中，提供人源化SIRPa基因杂合的非人动物。
[0100]本发明的非人动物在内源非人SIRPa基因座上含有全部或部分人SIRPa基因。因 此，这种非人动物可以被描述为具有异源SIRP基因。可以通过多种方法检测内源SIRPa基因 座上的被替换、插入或修饰的SIRPa基因，例如，PCR、Western印迹、Southern印迹、限制性片 段长度多态性(RFLP)或者等位基因的获得或丢失的测定。在一些实施方案中，非人动物是 人源化SIRPa基因杂合的。
[0101]在不同的实施方案中，根据本发明的人源化SIRPa基因包括具有第二、第三和第四 外显子的SIRPa基因，所述第二、第三和第四外显子每个具有与表3的人SIRPa基因中所示的 第二、第三和第四外显子至少50%(例如50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多）相同的序列。
[0102] 在不同的实施方案中，根据本发明的人源化SIRPa基因包括具有核苷酸编码序列 (例如cDNA序列）的SIRPa基因，所述核苷酸编码序列与表3的人SIRPa基因中所示的核苷酸 352-1114至少50% (例如50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、 93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多）相同。
[0103] 在不同的实施方案中，由本发明的非人动物产生的人源化SIRPa蛋白具有胞外部 分，所述胞外部分具有与表3中所示的人SIRPa蛋白的胞外部分至少50% (例如50%、55%、 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、 99 %或更多）相同的序列。
[0104] 在不同的实施方案中，由本发明的非人动物产生的人源化SIRPa蛋白具有胞外部 分，所述胞外部分具有与表3的人SIRPa蛋白中所示的氨基酸残基28-362至少50 % (例如 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、 97%、98%、99%或更多）相同的序列。
[0105] 在不同的实施方案中，由本发明的非人动物产生的人源化SIRPa蛋白具有与表3中 所示的人SIRPa蛋白的氨基酸残基至少50% (例如50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、 85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多）相同的氨基酸序 列。
[0106] 提供制备非人动物的组合物和方法，所述非人动物表达人源化SIRPa蛋白，包括特 定的多态性形式或等位基因变体(例如单氨基酸差异），包括用于制备从人启动子和人调节 序列表达这种蛋白的非人动物的组合物和方法。在一些实施方案中，还提供用于制备从内 源启动子和内源调节序列表达这种蛋白的非人动物的组合物和方法。该方法包括将编码全 部或部分人SIRPa蛋白的遗传材料插入到非人动物基因组中相应于内源SIRPa基因的精确 位置，由此产生表达全部或部分人SIRPa蛋白的人源化SIRPa基因。在一些实施方案中，该方 法包括将相应于人SIRPa基因的外显子2-4的基因组DNA插入到非人动物中，由此产生编码 SIRPa蛋白的的人源化基因，所述SIRPa蛋白含有人部分，该人部分含有由插入的外显子编 码的氨基酸。
[0107] 人源化SIRPa基因方法利用对内源基因的相对最小的改变，在非人动物中获得天 然的SIRPa-介导的信号传导，在不同的实施方案中，因为在单个片段上改造了SIRPa序列的 基因组序列，因此通过包括必需的调节序列而保留了正常的功能性。因此，在这样的实施方 案中，SIRPa基因改造不影响其它周围的基因或其它内源SIRP基因。进一步，在不同的实施 方案中，该改造不影响质膜上功能受体的组装，并且通过未受改造影响的受体的胞质部分 的结合和后续信号传导而保持正常的效应子功能。
[0108] 图1中提供内源鼠 SIRPa基因和人源化SIRPa基因的示意图（非成比例的）。如图所 示，含有人s I RPa基因的外显子2-4的基因组DNA通过靶向构建体被插入到内源鼠 SI RPa基因 座中。该基因组DNA包含编码人SIRPa蛋白的负责配体连接的胞外部分(例如氨基酸残基28-362)的基因部分。
[0109] 在内源SIRPa基因座上具有人源化SIRPa基因的非人动物（例如小鼠）可以通过本 领域已知的任何方法制备。例如，可以制备引入具有可选择标记基因的全部或部分人SIRPa 基因的靶向载体。图1显示了包含人SIRPa的外显子2-4的插入物的小鼠基因组。如所示的， 靶向构建体含有5'同源臂和3'同源臂，该5'同源臂含有内源鼠 SIRPa基因的外显子2上游的 序列、接着含有人SIRPa基因的外显子2-4的基因组DNA、药物选择盒(例如两侧为ΙοχΡ序列 的新霉素抗性基因），该3'同源臂含有内源鼠 SIRPa基因的外显子4下游的序列。通过同源重 组，内源鼠 SIRPa基因的外显子2-4被靶向载体中含有的序列替换。产生人源化SIRPa基因， 获得细胞或非人动物，所述细胞或非人动物表达含有人SIRPa基因的外显子2-4编码的氨基 酸的人源化SIRPa蛋白。药物选择盒可以任选地通过后续加入重组酶(例如通过Cre处理)而 被去除。
[0110] 除了本文所述的具有人源化SIRPa基因的小鼠之外，本文还提供其它包含人源化 SIRPa基因的基因修饰的非人动物。在一些实施方案中，这些非人动物包含与内源SIRPa启 动子可操作连接的人源化SIRPa基因。在一些实施方案中，这些非人动物从内源基因座表达 人源化SIRPa蛋白，其中该人源化SIRPa蛋白包含人SIRPa蛋白的氨基酸残基28-362.
[0111] 这种非人动物可以选自由小鼠、大鼠、兔、猪、牛(例如奶牛、公牛、水牛）、鹿、绵羊、 山羊、鸡、猫、狗、白鼬、灵长动物(例如狨猴、猕猴)组成的组。对于不容易获得合适的课基因 修饰的ES细胞的非人动物，使用其它方法制备包含本文所述的基因修饰的非人动物。这些 方法包括，例如修饰非ES细胞基因组(例如成纤维细胞或诱导的多能细胞），并利用核转移 将修饰的基因组转移到合适的细胞，例如卵母细胞中，并在合适的条件下在非人动物中使 修饰的细胞(例如修饰的卵母细胞)孕育以形成胚胎。
[0112] 在一些实施方案中，本发明的非人动物是哺乳动物。在一些实施方案中，本发明的 非人动物是小哺乳动物，例如跳鼠科或鼠科超家族的哺乳动物。在一些实施方案中，本发明 的基因修饰的动物是啮齿动物。在一些实施方案中，本发明的啮齿动物选自小鼠、大鼠和仓 鼠。在一些实施方案中，本发明的啮齿动物选自鼠科超家族。在一些实施方案中，本发明的 基因修饰的动物来自于选自丽仓鼠科（Calomyscidae)(例如类似小鼠的仓鼠）、仓鼠科 (Cricetidae)(例如仓鼠、新世界大鼠和小鼠、田鼠）、鼠科(Muridae)(真正的小鼠和大鼠、 沙鼠、棘鼠、冠毛鼠）、马岛鼠科(Nesomyidae)(攀鼠、岩鼠、白尾鼠、马达加斯加大鼠和小 鼠）、刺睡鼠科（Platacanthomyidae)(例如刺睡鼠 （spiny dormice))和驢形鼠科 (Spalacidae)(例如鼹形鼠、竹鼠和鼢鼠）的家族。在一些特定的实施方案中，本发明的基因 修饰的啮齿动物选自真正的小鼠或大鼠（鼠科家族）、沙鼠、棘鼠和冠毛鼠。在一些特定的实 施方案中，本发明的基因修饰的啮齿动物来自于鼠科家族的成员。在一些实施方案中，本发 明的非人动物是啮齿动物。在一些特定的实施方案中，本发明的啮齿动物选自小鼠和大鼠。 在一些实施方案中，本发明的啮齿动物是小鼠。
[0113] 在一些实施方案中，本发明的非人动物是C57BL株的小鼠，所述C57BL株选自 C57BL/A、C57BL/An、C57BL/GrFa、C57BL/KaLwN、C57BL/6、C57BL/6J、C57BL/6ByJ、C57BL/ 6NJ、C57BL/10、C57BL/10ScSn、C57BL/10Cr 和 C57BL/01a。在一些特定的实施方案中，本发明 的小鼠是选自由 129?1、129?2、129卩3、129父1、12951(例如12951/5￥、12951/5￥1111)、12952、 129S4、129S5、129S9/SvEvH、129/SvJae、129S6(129/SvEvTac)、129S7、129S8、129Tl、129T2 组成的组的 129株（参见例如，Festing et al.，1999，Mammalian Genome 10:836;Auerbach et al. ,2000，Biotechniques 29(5) :1024-1028,1030,1032)。在一些特定的实施方案中， 本发明的基因改造的小鼠是上述的129株和上述的C57BL/6株的杂交体。在一些特定的实施 方案中，本发明的基因改造的小鼠是上述的129株的杂交体，或上述的BL/6株的杂交体。在 一些特定的实施方案中，本文所述的杂交体中的129株是129S6 (129/SvEvTac)株。在一些实 施方案中，本发明的小鼠是BALB株，例如BALB/c株。在一些实施方案中，本发明的小鼠是 BALB株和另一种上述株的杂交体。
[0114]在一些实施方案中，本发明的非人动物是大鼠。在一些特定的实施方案中，本发明 的大鼠选自Wistar大鼠、LEA株、Sprague Dawley株、Fischer株、F344、F6和Dark Agouti。在 一些特定的实施方案中，本文所述的大鼠株是选自由Wistar、LEA、Sprague Dawley、 Fischer、F344、F6和Dark Agouti组成的组的两个或更多个株的杂交体。
[0115]使用具有人源化SIRPa非人动物的方法
[0116] 已报道了 SIRPa突变体和转基因非人动物（例如小鼠）（lnagaki et al. ,2000， EMBO Journal 19(24):6721-6731；Strowig et al.,2011,Proc.Nat.Acad.Sci.108(32): 13218-13223)。在多种测定中利用这种动物来确定SIRPa表达、功能和调节的分子方面。但 是，它们并非是没有限制。例如，由于含有SIRPa的突变体形式的细胞不能传递信号导致受 损伤的健康状况，从而使SIRPa突变体的使用受到限制。进一步，由于CD47，SIRPa的配体可 能与SIRPa的突变体形式存在于同一个细胞上，并且这两种蛋白都能够提供胞内信号，所以 不能分辨这种结果是来自于SIRPa信号传导的缺乏还是来自于⑶47结合的缺乏。在人SIRPa 转基因小鼠的情况中，小鼠 SIRPa是完整的并且具有功能。因此在这些小鼠中，不同生物过 程(例如移植）中的依赖于SIRPa的功能不能清楚地归因于单独的人SIRPa或小鼠 SIRPa的功 能，因为人和小鼠 SIRPa受体都存在并且都具有功能。
[0117] 本发明的非人动物提供表达人SIRPa的生物材料(例如细胞)的改进的体内系统和 来源，其对于多种测定是有用的。在不同的实施方案中，本发明的非人动物用于开发靶向 SIRPa和/或调解SIRPa-CD47信号传导的疗法。在不同的实施方案中，本发明的小鼠用于筛 选和开发与人SIRPa结合的候选治疗剂(例如抗体）。在不同的实施方案中，本发明的非人动 物用于确定拮抗剂和/或激动剂与本文所述的非人动物的细胞表面上的人源化SIRPa的结 合模式。
[0118] 在不同的实施方案中，本发明的非人动物用于测量阻断或调解SIRPa信号传导(例 如磷酸化)的治疗效果和细胞变化对于基因表达的影响。在不同的实施方案中，本发明的非 人动物以及由其分离的细胞被暴露于候选治疗剂，所述候选治疗剂与该非人动物的细胞表 面上的人SIRPa结合，并且在后来的一段时间之后，分析对于依赖于SIRPa的过程，例如B和/ 或T细胞增殖、血小板清除和细胞因子表达的诱导的作用。
[0119]本发明的非人动物表达人源化SIRPa蛋白，因此可以产生细胞、细胞系和细胞培养 物作为结合和功能测定中所使用的人源化SIRPa的来源，例如，以测定SIRPa拮抗剂或激动 剂的结合或功能，特别是当该拮抗剂或激动剂对于人SIRPa序列或表位是特异性的时候。在 不同的实施方案中，由本文所述的非人动物表达的人源化SIRPa蛋白可以包含变体氨基酸 序列。已报道了具有与配体结合残基相关的变化的变体人SIRPa蛋白。在不同的实施方案 中，本发明的非人动物表达人源化SIRPa蛋白变体。在不同的实施方案中，变体在与配体结 合相关的氨基酸位置上具有多态性。在不同的实施方案中，本发明的非人动物用于通过与 人SIRPa的多态性变体的相互作用来确定配体结合的效果。
[0120] 来自本发明的非人动物的细胞可以被分离并随时使用，或者可以在培养物中保持 许多代。在不同的实施方案中，来自本发明的非人动物的细胞被永生化，并在培养物中无限 期保持(例如在连续培养中）。
[0121] 在不同的实施方案中，本发明的非人动物的细胞被用在细胞迀移或伸展测定中， 以筛选和开发调节人SIRPa的候选治疗剂。这种过程对于许多细胞过程，包括伤口愈合、分 化、增殖和存活来说是必需的。
[0122] 在不同的实施方案中，本发明的非人动物的细胞被用在巨核细胞集落形成细胞的 克隆测定上，用于测试靶向人SIRPa的候选治疗剂的药学毒理学方面。
[0123] 在不同的实施方案中，本发明的非人动物的细胞被用在吞噬作用的测定上，以确 定化合物或生物制剂调节吞噬作用的依赖于SIRPa的调控的治疗潜能。
[0124] 本发明的非人动物为药物或疫苗的分析和测试提供体内系统。在不同的实施方案 中，候选药物或疫苗可以被递送到本发明的一个或多个非人动物中，然后监测非人动物，以 确定对于该药物或疫苗的一种或多种免疫反应、药物或疫苗的安全性状况或者对于疾病或 病况的效果。可以在这种非人动物中改进和/或开发这种药物或疫苗。
[0125] 本发明的非人动物提供改进的体内系统，其通过过继转移说明了人细胞间相互作 用的机理。在不同的实施方案中，本发明的非人动物可以被植入肿瘤异种移植物，然可以通 过过继转移在非人动物中第二次植入肿瘤浸润淋巴细胞，以确定消除实体肿瘤或其它恶性 肿瘤的效果。这些实验