可以用人细胞进行，因为其中只存在人SIRPa，不与非人动物的内源 SIRPa竞争。进一步，可以在这种非人动物中改进和/或开发用于异种移植的疗法和药物。
[0126] 本发明的非人动物提供改进的体内系统，用于通过移植使人造血干细胞维持并发 育。在不同的实施方案中，本发明的非人动物提供改进的人干细胞在非人动物中的发育和 维持。在不同的实施方案中，在非人动物的血液、骨髓、脾和胸腺中观察到增加的分化人B和 T细胞群落。在不同的实施方案中，本发明的非人动物提供与表达小鼠和人SIRPa二者的非 人动物相比，人细胞移植水平上的增加。
[0127] 本发明的非人动物可用于评价靶向人细胞的治疗药物的效力。在不同的实施方案 中，给本发明的非人动物移植人细胞，然后给该动物施用靶向该人细胞的药物候选物。然后 在施用药物之后，通过监测非人动物中的人细胞确定该药物的治疗效力。可以在非人动物 中测试的药物包括小分子化合物，即分子量小于1500kD、1200kD、1000kD或800道尔顿的化 合物，和大分子化合物(例如蛋白质，如抗体），它们通过靶向（例如与其结合和/或作用于其 上)人细胞而具有预期的治疗人疾病和病况的治疗效果。
[0128] 在一些实施方案中，药物是抗癌药物，并且人细胞是癌细胞，其可以是原发癌的细 胞或者从原发癌建立的细胞系的细胞。在这些实施方案中，给本发明的非人动物移植人癌 细胞，并将抗癌药物给予给非人动物。可以通过评价非人动物中人癌细胞的生长或转移是 否因药物的使用而被抑制来确定药物的效力。
[0129] 在特定的实施方案中，抗癌药物是与人癌细胞上的抗原结合的抗体分子。在具体 的实施方案中，抗癌药物是与人癌细胞上的抗原结合，并与其它人细胞，例如人免疫系统细 胞(或者"人免疫细胞"）如B细胞和T细胞结合的双特异性抗体。
[0130] 在一些实施方案中，给本发明的非人动物移入人免疫细胞或者分化为人免疫细胞 的细胞。给具有移入的人免疫细胞的这种非人动物移植人癌细胞，并施用抗癌药物，例如与 人癌细胞上的抗原结合，并与人免疫细胞(例如T细胞)上的抗原结合的双特异性抗体。可以 根据双特异性抗体抑制人癌细胞在非人动物中生长或转移的能力来评价其治疗效力。在特 定的实施方案中，给本发明的而非人动物移入产生人免疫细胞（由其包括T细胞、B细胞、NK 细胞）的人CD34+造血祖细胞。人B细胞淋巴细胞(例如Raj i细胞)被移植到具有移入的人免 疫细胞的这种非人动物中，该非人动物随后被施用与CD20(正常B细胞和特定B细胞恶性肿 瘤上的抗原)结合并且与T细胞受体的CD3亚基结合的双特异性抗体，以测试该双特异性抗 体抑制非人动物中肿瘤生长的能力。 实施例
[0131] 提供下述特定实施例是为了向本领域普通技术人员描述如何制备和使用本发明 的方法和组合物，而不是要限制发明人视为是他们的发明的范围。除非另外指出，所给出的 温度为摄氏度，压力是大气压或近似大气压。
[0132] 实施例1.内源信号调节蛋白（SIRP)基因的人源化
[0133] 本实施例说明了在非人哺乳动物例如啮齿动物(例如小鼠）中对编码信号调节蛋 白a(SIRPa)的内源基因人源化的方法。已知人SIRPa以至少10个等位基因的形式存在。本实 施例中所述的方法可用于使用所期望的任何人等位基因或人等位基因（或等位基因片段） 的组合对非人动物的内源SIRPa基因进行人源化。在本实施例中，使用人SIRPa变体1进行小 鼠内源SIRPa基因的人源化。
[0134] 使甩VEL0CIGENE?技术（参见例如美国专利No.6586251 和Valenzuela et al. (2003)High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression ana lysis, Nature Biotech. 21(6) :652-659)构建用于 SIRP(例 如SIRPa)基因的胞外区域的人源化的靶向构建体。
[0135] 简短地说，对小鼠细菌人工染色体(BAC)克隆bMQ_261H14进行改造，以删除含有内 源SIRPa基因的外显子2-4的序列，并使用人BAC克隆CTD-3035H21插入人SIRPa基因的外显 子2UAC克隆bMQ-261H14中的相应于内源SIRPa基因的外显子2-4的基因组DAN(~ 8555bp)被替换为含有BAC克隆CTD-3035H21的人SIRPa基因的外显子2-4的~8581bp的DNA 片段。BAC克隆CTD-3035H21中含有的人SIRPa等位基因的序列分析表明该等位基因相应于 人变体1。侧翼具有loxP位点的新霉素盒被加入到含有人SIRPa基因的外显子2-4的~ 8581bp的人DNA片段中（图1)。
[0136] 分别从小鼠 BAC DNA的外显子2和4的5'位置和3'位置获得上游和下游同源臂，并 加入到~8581bp的人片段-新霉素盒中，以产生最终的用于内源SIRPa基因的人源化的靶向 载体，从5 '到3 '含有含内源SIRPa基因的外显子2的5 '的19kb小鼠 DNA，含人SIRPa基因的外 显子2-4的~8581bp的DNA片段，侧翼具有loxP位点的新霉素盒，和含内源SIRPa基因的外显 子4的3'的21kb小鼠 DNA。靶向载体的靶向插入将新霉素盒置于小鼠 SIRPa基因外显子4和5 之间的第五内含子中。靶向载体用Swal消化而被线性化，然后用于细菌细胞的同源重组中， 以实现用人SIRPa基因的外显子2-4替换小鼠 SIRPa基因的外显子2_4(图1)。
[0137] 靶向BAC DNA(如上所述)被用于对小鼠 ES细胞进行电穿孔，以产生改造的ES细胞， 所述改造的ES细胞包含用包含人SIRPa基因的外显子2-4的基因组片段对内源小鼠 SIRPa基 因中的外显子2-4的替换。使用TAQMAN探针（Lie and Petropoulos, 1998·Curr·Opin·Biotechnology 9:43-48)通过定量PCR鉴别含有包含人SIRPa基因的外显 子2-4的基因组片段的阳性ES细胞。横跨上游插入点的核苷酸序列包括下述序列，其表明插 入点上游的内源小鼠序列(包含在下面的括号中）与插入点上存在的人SIRPa基因组序列连 续连接：（AGCTCTCCTA CCACTAGACT GCTGAGACCC GCTGCTCTGC TCAGGACTCG ATTTCCAGTA CACAATCTCC CTCTTTGAAA AGTACCACAC ATCCTGGGGT)GCTCTTGCAT TTGTGTGACA CTTTGCTAGC CAGGCTCAGT CCTGGGTTCC AGGTGGGGAC TCAAACACAC TGGCACGAGT CTACATTGGA TATTCTTGGT (SEQ ID N0:6)。位于新霉素盒的5'末端的横跨下游插入点的核苷酸序列包括下述序列，其 表明人SIRPa基因组序列与插入点下游的盒序列（包含在下面的括号中，其中ΙοχΡ序列为斜 体）连续相接：GCTCCCCATT CCTCACTGGC CCAGCCCCTC TTCCCTACTC TTTCTAGCCC CTGCCTCATC TCCCTGGCTG CCATTGGGAG CCTGCCCCAC TGGAAGCCAG(TCGAG A TAA CTTCGTA TAA TGTA TGCTA TA CGAA GTTA T ATGCATGGCC TCCGCGCCGG GTTTTGGCGC CTCCCGCGGG CGCCCCCCTC CTCACGGCGA) (SEQ ID NO: 7)。位于新霉素盒的3 '末端的横跨下游插入点的核苷酸序列包括 下述序列，其表明盒序列与内源SIRPa基因的外显子4的3'小鼠基因组序列（包含在下面的 括号中）连续相接：CATTCTCAGT ATTGTTTTGC CAAGTTCTAA TTCCATCAGA CCTCGACCTG CAGCCCCTAG ATAACTTCGT ATAATGTATG CTATACGAAG TTATGCTAGC(TGTCTCATAG AGGCTGGCGA TCTGGCTCAG GGACAGCCAG TACTGCAAAG AGTATCCTTG TTCATACCTT CTCCTAGTGG CCATCTCCCT GGGACAGTCA)(SEQ ID N0:8)。然后使用阳性ES细胞克隆植入雌性小鼠，使用 VEL0CIM0USE?方法（参见，例如美国专利No · 7294754和Poueymirou et al · 2007， FOgeneration mice that are essentially fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowing immediate phenotypic analyses Nature Biotech.25 (1):91-99),以产生含有人SIRPa基因的外显子2-4向小鼠内源SIRPa基因的插入的一窝幼 i_U 思。
[0138]上述的靶向ES细胞被用作供体ES细胞，并通过颗L0CIM0USE?方法（见上文） 被引入到8-细胞期的小鼠胚胎中。用改进的等位基因测定(Valenzuela et al.，见上文)进 行基因型分析，检测人SIRPa基因序列的存在，由此鉴别带有内源SIRPa基因的外显子2-4的 人源化的小鼠。
[0139] 可以将带有人源化SIRPa基因构建体的小鼠（即在小鼠 SIRPa基因中含有人SIRPa 外显子)培育成Cre缺失小鼠株(参见，例如，国际专利申请公开号No. W02009/114400)，以除 去任何由靶向载体引入的，在ES细胞期或在胚胎中没有被除去的lox化（loxed)的新霉素 盒。任选地，在小鼠中保留新霉素盒。
[0140]对幼崽进行基因型分析，对人源化SIRPa基因构建体杂合的幼崽被选择用于进行 特征描述。
[0141]实施例2.人源化SIRPa在非人动物中的表达
[0142] 本实施例说明了SIRPa蛋白在非人动物的细胞表面上的特征表达，所述非人动物 被工程化以在内源SIRPa基因座上含有实施例1所述的人源化SIRPa基因构建体。
[0143] 简短地说，从野生型(WT)和人源化SIRPa基因杂合的小鼠分离脾。然后给脾灌注胶 原酶D(Roche Bioscience)并用ACK裂解缓冲液裂解红细胞，根据制造商的说明进行。使用 荧光染料缀合的抗 _CD3(17A2)、抗-CD19(1D3)、抗-CDllb(Ml/70)、抗人 SIRPa(SE5A5)和抗 小鼠 SIRPa(P84)通过FACS分析小鼠和人SIRPa的细胞表面表达。使用BD LSRF0RTESSA进行 流式细胞术。所检测到的示例性的CD 11 b+单核细胞表面上人和小鼠 SI RPa的表达如图2所 不。
[0144] 如图2所示，小鼠和人源化SIRPa的表达在杂合小鼠的CDllb+单核细胞表面上都是 可以清楚检测到的。
[0145] 实施例3.人源化SIRP非人动物中人细胞的移入
[0146] 本实施例说明在本发明的具有人源化SIRPa基因的非人动物中的改进的人造血干 细胞的移入。
[0147] 简短地说，具有或不具有人源化SIRPa基因的Rag2K0 IL2Ry_小鼠在无病原体的 条件下饲养。新生小鼠（2-5天龄)用240cGy辐照，并肝内注射lxlO5⑶34+人造血干细胞。移入 后10-12周对小鼠取血，使用荧光染料缀合的抗-人CD45(HI 30)、抗-人CD3(SK7)、抗-人 CD19(HIB19)和抗-小鼠 CD45(30-F11)通过FACS分析血液，以检查人免疫系统的重建。小鼠 的遗传背景是BALB/cTa X 129/SvJae。
[0148] 人CD34+细胞在野生型、人SIRPa杂合小鼠、人源化SIRPa杂合小鼠和BALB_Rag2 一Λ IL2R γ c-Λ (DK0)小鼠中示例性百分比如图3-5所示。
[0149] 如本实施例中所示，人源化SIRPa基因杂合的小鼠与其它测试株相比，提供了外周 (例如血液）中的最高人⑶34+细胞百分比，证明人⑶34+细胞的移入被改进。
[0150] 综合起来，这些数据证明人源化SIRPa通过在小鼠细胞表面上表达，在本文所述的 小鼠中是有功能的，并且开始能够支持人CD34+造血干细胞的移入。
[0151] 实施例4.评价Ab 1对于BRG小鼠中Raji淋巴瘤肿瘤生长的效力
[0152]
[0153] Ab 1是双特异性抗体(bsAb)，它与CD3,与T细胞受体(TCR)复合物结合的T细胞抗 原，和CD20,正常B细胞和几种B细胞系恶性肿瘤上存在的B细胞表面抗原结合。Ab 1被设计 以通过结合TCR的CD3亚基将表达CD20的细胞与细胞毒性T细胞连接起来，导致CD20-指导的 多克隆T细胞杀伤。CD20是得到临床验证的免疫治疗的靶;嵌合抗体利妥昔单抗被证明可用 于治疗非霍奇金淋巴瘤(NHL)和慢性淋巴细胞性白血病(CLL)。虽然患者可能变得用利妥昔 单抗难以治疗，但通常不会观察到CD20的表达的消失。因此，连接CD20阳性肿瘤细胞与细胞 毒性T细胞的双特异性抗体代表了潜在的抗肿瘤策略。
[0154] 在本研究中，在小鼠肿瘤模型中检查用⑶20xCD3bsAb Ab 1治疗对于人B细胞淋巴 瘤(Raji)肿瘤生长的作用。该模型使用SIRPa人源化的移入hCD34+的BALB/c-Rag2缺失IL2r γ缺失(BALB/c-Rag2null IL2r γ null，BRG)小鼠。这些小鼠，具有人T、B和NK细胞，以及粒 细胞、单核细胞和树突细胞(DCs)，用Ab 1治疗，每周2次，与载体对照和非结合性对照mAb， 对照Ab 5相比，导致Raji肿瘤生长的显著抑制。在整个治疗期中，与载体对照组相比， 0.4mg/kg和0.04mg/kg的Ab 1治疗都以更大的显著性抑制肿瘤生长(p〈0.0001)。在任何治 疗组中都没有观察到显著的体重减轻。这些结果表明Ab 1靶向具有人免疫细胞的Raji肿 瘤，导致显著的肿瘤抑制。
[0155] 材料与方法
[0156] 材料
[0157]测试化合物和对照抗体
[0158] 测试化合物:Ab 1。
[0159] 对照抗体:对照Ab 5。
[0160] 试剂
[0161] 表4:试剂列表
[0162]
[0163]测试系统
[0164] 在本报告中显示的肿瘤研究利用信号调节蛋白a(SIRPa)人源化的24-32周龄的雄 性和雌性BALB/C-Rag2缺失IL2r γ缺失(BRG)免疫缺陷小鼠。这些小鼠在Regeneron通过胚 胎干（ES)细胞靶向产生（Strowig et al.，Proc Natl Acad Sci USA, 108(32) :13218-13223(2011))。在识别CD47之后，SIRPa抑制巨噬细胞对CD47阳性细胞的清除。之前的研究 显示表达人SIRPa转基因的BRG小鼠具有增强的人HSC移入（Strowig et al.，Proc Natl Acad Sci USA,108(32):13218-13223(2011))〇
[0165] 新生的SIRPaBRG幼崽被辐照并移入来自胎儿肝脏的hCD34 +造血祖细胞 (Traggiai，et al.，Science ,304(5667): 104-107(2004))。这些人HSCs产生人T、B和NK细 胞，以及粒细胞、单核细胞和树突细胞(DCs)。由于循环人B细胞的低水平，存在低水平的循 环人IgG。而且，这些小鼠不发育生发中心，缺乏淋巴结并且当T和B细胞耗尽的时候，这些细 胞的补充有限。鼠单核细胞、DCs和粒细胞仍然存在。通过血液的流式细胞术验证免疫细胞 组合物，并且在用于进行肿瘤研究之前，将小鼠按照人CD45移入的％随机划分。在第0天给 小鼠植入Raji肿瘤细胞，并测试Ab 1在4周中阻断肿瘤生长的能力。在植入后第3、6、9、13、 16、20、23、27、30和34天记录体重和肿瘤体积。
[0166] 实验