专利名称：抗cd52单克隆抗体、其编码序列及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及医学领域。更具体地，本发明涉及抗CD52的特异性单克隆抗体及其应用。本发明的抗体对于移植排斥反应的预防和治疗以及非常有用。
背景技术：
目前，器官移植技术已成为脏器功能衰竭终末期的有效、常规性治疗手段。但是，器官移植最大的问题是免疫排斥反应。在器官移植，特别是肾、肝、心脏、肺和骨髓移植中，减小免疫系统的移植排斥反应是非常必要的。目前已经研制出许多免疫抑制剂，而且在临床上也获得了成功，比如包括类固醇、咪唑硫嘌呤和环孢菌素A。但是它们都必须严格进行控制，以避免产生不必要的副作用。另外还有一个难点，就是免疫抑制作用使移植器官易被细菌或病毒感染，而这类细菌或病毒感染在正常情况下是能够由个体的免疫系统消除的。
除了使用免疫抑制剂，还可以使用一些单克隆抗体(MAbs)来抑制免疫反应。这些单克隆抗体通常根据相应的CD数命名，如CD3的抗体描述为“抗CD3”。
CD52通常又称为campath-1抗原，该抗原是一种存在于B淋巴细胞和T淋巴细胞表面的抗原。针对于CD52抗原的抗CD52单克隆抗体在体内可暂时清除血液中的淋巴细胞，使免疫系统处于失效状态。这使得器官植入患者体内后，不会马上遭到患者免疫系统的排异。免疫系统在一、两个月的逐渐恢复过程中，会把被移植器官“误认为”是患者体内原有的组成部分。
另外，抗CD52单克隆抗体在体内还能够导致抗体依赖性地溶胞或杀细胞作用，从而清除血液、骨髓和其他受影响器官中的恶性淋巴细胞。
目前，虽然国内外已经获得了多种抗CD52抗原的单克隆抗体，但这些单克隆抗体的特异性等特性不够理想。因此，本领域还需要研制对人免疫原性更小，表达量更高，以及具有其他优良特性的抗CD52单克隆抗体，从而开发出对于慢性淋巴细胞白血病具有显著疗效的药物。
发明内容
本发明的目的提供一种特异性抗CD52单克隆抗体。
本发明的另一目的是提供一种所述特异性抗CD52单克隆抗体的制备方法。
本发明的另一目的是提供一种含所述抗CD52单克隆抗体的药物组合物。
在本发明的第一方面，提供了一种单克隆抗体VH链，它的互补决定区CDR具有选自下组的CDR的氨基酸序列SEQ ID NO5所示的CDR1，SEQ ID NO6或16所示的CDR2，SEQ ID NO7或17所示的CDR3。
较佳地，所述的单克隆抗体VH链具有SEQ ID NO2或12所示的氨基酸序列。
在本发明的第二方面，提供了一种单克隆抗体VL链，它的互补决定区CDR具有选自下组的CDR的氨基酸序列SEQ ID NO8或18所示的CDR1，SEQ ID NO9或19所示的CDR2，SEQ ID NO10或20所示的CDR3。
较佳地，所述的单克隆抗体VL链具有SEQ ID NO4或14所示的氨基酸序列。
在本发明的第三方面，提供了一种单克隆抗体，其VH链具有SEQ ID NO2或12所示的氨基酸序列，且其VL链分别具有SEQ ID NO4或14所示的氨基酸序列。
较佳地，所述的单克隆抗体是人源化抗体。
在本发明的第四方面，提供了一种DNA分子，它编码选自下组的蛋白质本发明上述的单克隆抗体VH链、单克隆抗体VL链、或单克隆抗体。
较佳地，所述的DNA分子具有选自下组的DNA序列SEQ ID NO1、3、11或13。
在本发明的第五方面，提供了一种药物组合物，它含有单克隆抗体和药学上可接受的载体，所述单克隆抗体的VH链和VL链分别具有SEQ ID NO5-7和SEQ ID NO8-10所示的CDR。较佳地，所述单克隆抗体的VH链具有SEQID NO2或12所示的氨基酸序列，且其VL链分别具有SEQ ID NO4或14所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，本发明的抗CD52抗体或其药物组合物用于治疗慢性淋巴细胞白血病。
具体实施例方式
本发明人通过筛选人源抗体库，成功获得了对CD52高特异性的单克隆抗体，并且对抗CD52人源化单克隆抗体基因和抗体可变区位点进行了独特的人工设计，即构建全人源的抗体库，筛选表达量高的抗体，并且将之与人源的IgGl-Fc相连，因此该抗体是全人源的，因而更适于在哺乳动物细胞(优选CHO)中进行表达。在此基础上完成了本发明。
本发明提供了一种重组抗CD52人源化单克隆抗体，它包括人源恒区(如人源恒区IgGl-Fc)，经过人工设计后的重链可变区和轻链可变区具有独特的不同于现有技术的结构。
本发明还提供了抗CD52单克隆抗体的氨基酸序列及其其可变区链，以及具有这些链的其他蛋白质或融合表达产物。具体地，本发明包括具有含超变区(互补决定区，CDR)的轻链和重链的任何蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物(即免疫偶联物及融合表达产物)，只要该超变区与本发明的轻链和重链的超变区相同或至少90％同源性，较佳地至少95％同源性。
抗体的抗原结合特性可由位于重链和轻链可变区的3个特定的区域来描述，称为超变区域(CDR)，将该段间隔成4个框架区域(FR)，4个FR的氨基酸序列相对比较保守，不直接参与结合反应。这些CDR形成环状结构，通过其间的FR形成的β折叠在空间结构上相互靠近，重链上的CDR和相应轻链上的CDR构成了抗体的抗原结合位点。可以通过比较同类型的抗体的氨基酸序列来确定是哪些氨基酸构成了FR或CDR区域。
此外，最近还发现由轻链可变区构成的相关结构，与相应的重链可变区相比，其结合的动力学比较小，分离的重链可变区域自身具有抗原结合活性。
此处鉴定的V链的超变区或互补决定区(complementarity determiningregion，CDR)特别令人感兴趣，因为它们中至少部分涉及结合抗原。因此，本发明包括那些具有带CDR的单克隆抗体轻链和重链可变链的分子，只要其CDR与此处鉴定的CDR具有90％以上(较佳地95％以上)的同源性。
本发明不仅包括完整的单克隆抗体，还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab或(Fab’)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但保留来自人的抗体部分的抗体。
本发明还提供了编码上述单克隆抗体或其片段的DNA分子。本发明的单抗的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。一种可行的方法是用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。此外，还可将轻链和重链的编码序列融合在一起，形成单链抗体。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS7、293细胞的动物细胞等。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔，脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
本发明还提供了一种治疗移植排斥的药物组合物，它含有上述的单克隆抗体或免疫偶联物，以及药学上可接受的载体。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)腹膜内、静脉内、或局部给药。
本发明的药物组合物可直接用于预防和治疗移植排斥。此外，还可同时使用其他治疗剂。
本发明的药物组合物含有安全有效量的本发明上述的单克隆抗体以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。
使用药物组合物时，是将安全有效量的免疫偶联物施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
本发明的突出优点在于本发明的单克隆抗体的生理活性和在宿主细胞(如CHO细胞)中的表达量比现有的单克隆抗体有显著的提高。而且，本发明的单克隆抗体是人源化的，其亲和力已经达到0.1nM的水平。这种高亲和力的单克隆抗体在临床上具有重要的价值。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(NewYorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1从抗体库中筛选抗CD52抗体的可变区基因1)人源抗体库的构建按照Marks等人J.Mol.Biol.，222，581-597；Hoogenboom和Winte，J.Mol.Biol.，227，381-388；Haidaris CG等，J Immunol Methods.2001 Nov 1；257(1-2)185-202；Griffiths，A.D.等EMBO J.，13，3245-3260(1994)；Nissim，A.等EMBO J.，13，692-698(1994)中描述的方法构建人源抗体库。简而言之，从外周血淋巴细胞制备免疫球蛋白重链和轻链的基因，用PCR方法进行体外扩增，并将其克隆到噬菌体载体，利用抗体分子片段在噬菌体表面呈现的特点，以CD52蛋白(购自深圳晶美公司)为抗原，筛选到相应的特异性抗体。
2)筛选将复苏的抗体库菌株1毫升加入新鲜LB培养基14毫升，于50毫升三角瓶中37℃培养16小时。
12000rpm高速离心10分钟，转移上清至一个无菌的50毫升离心管中，保存备用。其滴度应在2×1011以上。以纯化的CD52蛋白(购自深圳晶美公司)为抗原，包被25毫升细胞培养瓶。在包被后的细胞瓶中加入不少于3×1010噬菌体颗粒，37℃温育1小时。
然后，倒掉瓶中的液体，用10毫升加入了1％Tween-20的PBS洗涤培养瓶10次。在培养瓶中加入1毫升对数期的TGl细胞，37℃温育震荡培养16小时。重复进行4个循环。
将上述获得的细胞稀释至100000细胞/毫升，然后在加入0.1％氨苄青霉素的1.5％琼脂平板上进行培养以获得单克隆。取上述平板上的克隆在96孔深孔板上进行培养，每孔一个克隆，共作960个克隆(10块96孔板)。将上述深孔板在96孔板离心机上5000rpm离心20分钟，将上清转移到新的无菌深孔板，封口后保藏于4℃备用。
取96孔板10块，每孔中加入CD52(10微克/毫升)10微升常规包被后，分别加入上述保存的上清10微升，37℃温育1小时后用含有1％Tween-20的PBS洗涤20次。加入1微升HRP标记的羊抗M13单抗，37℃温育30分钟后用1％Tween-20的PBS洗涤10次。
加入含有0.025％DAB显色剂的PBS 200微升和1微升1％的H2O2，37℃温育显色20分钟后在读板机上读取595纳米处的光吸收。根据光吸收读数确定显色反应强的孔，这些孔相对应的克隆即为亲和力较强的抗体可变区克隆。
通过上述过程筛选出了296个阳性克隆，最强的克隆的亲和力测定结果见表1。根据读数确定其中1个亲和力最强的克隆5E6，用于以下的研究。
表1各克隆的亲和力
实施例2抗体可变区编码序列的表达载体的克隆将实施例1得到的克隆的菌株，在100毫升LB培养基中扩增，用Promega公司的质粒DNA抽提纯化试剂盒纯化质粒DNA。
用XbaI和NheI酶切上述质粒DNA后在1.5％琼脂糖凝胶电泳上分离酶切片段，取350bp左右的带进行胶回收，所得片段即为重链可变区编码序列。
用HindIII和Bsi WI酶切上述质粒DNA后在1.5％琼脂糖凝胶电泳上分离酶切片段，取320bp左右的带进行胶回收，所得片段即为轻链可变区编码序列。
然后首先将上述重链可变区编码序列插入到表达载体pMG18-3K(参见书籍DEVELOPMENT OF TOOLS FOR ENVIRONMENTAL MONITORINGBASED ON INCP-9 PLASMIDS SEQUENCES.A.Greated，R.Krasowiak，M.Titok，C.M.Thomas School of Biological Sciences，University of Birmingham，Edgbaston，Birmingham B15 2TT，UK and Faculty of Biology，Dept ofMicrobiology，Belarus State University Scorina Av.4，Minsk 220080Belarus1992年出版。此外，该载体可购自Invitrogen公司)的XbaI/NheI位点中，再用Hind III和Bsi WI将上述抗体轻链可变区编码序列插入到插入有重链可变区编码序列的pMG18-3K的HindIII/Bsi WI位点中，构建成人源化抗CD52抗体基因的表达载体。
实施例3CHO细胞的转染与重组克隆的筛选上述实施例2中构建的带有抗体基因的表达载体转入在大肠杆菌DH5α菌株，然后接种于100毫升LB培养基中进行扩增，用Qiagen公司的超纯质粒DNA纯化试剂盒(Ultrapure Plasmid DNA Purification Kit)抽提纯化质粒DNA。将上述纯化的质粒DNA采用Invitrogen公司的脂质体法试剂盒转染CHO细胞，操作参照厂家的说明书进行。
转化的CHO细胞在选择培养基上进行连续9周的选择，最后在96孔板上进行极度稀释培养，连续进行3次，进行单克隆化。
挑出的单克隆细胞系在RPM1641培养基上进行培养，对上清进行Western Blotting实验，根据染色反应判断表达强度，挑选出表达强的克隆作为候选细胞株，得到表达强度较高的候选克隆9个，即1B4、2D4、3F7、5E3、7C9、6D2、4D9、2H7、3H6。
实施例4单克隆抗体的纯化本实施例用硫酸铵沉淀法来纯化单克隆抗体。将上述单抗的纯化采用Protein A亲和层析柱从细胞培养上清中直接分离纯化。培养上清经过简单离心，除去细胞残片后即可直接进行protein A亲和层析。
将protein A填料按照每100毫升上清1毫升的比例加入填料后，在4度慢速搅拌24小时。然后在100mM pH8.2的Tris-H2SO4缓冲液中漂洗4次后，用含250mM氯化钠的同样缓冲液洗脱后进行硫酸铵分步沉淀，起始浓度为35％饱和度，终止浓度63％饱和度。4度处理12小时后高速离心，取沉淀，重新溶于上述不含氯化钠的缓冲液中，并于同样缓冲液透析过夜后浓缩10倍，待用。
上述样品经HPLC检定纯度以及Follin酚法定量蛋白质含量，结果发现经过纯化的重组蛋白，其纯度可达90％以上，并具有显著生物活性。
以上亲和层析的产物再次经过分子筛层析，获得了纯度＞98％的样品。这些样品可以用于以下的进一步分析与研究。
实施例5抗体基因在CHO细胞中的表达强度和亲和力测定(a)表达强度将上述筛选得到的高表达候选克隆培养于10cm的组织培养皿，采用ELISA法测量抗体的表达量羊抗人IgG(Fc)包被于ELISA板，4℃过夜，经2％BSA于37℃封闭2小时，加入待测的培养上清和标准品(人IgGl)，37℃孵育2小时，加入HRP-羊抗人IgG(K)进行结合反应，37℃孵育1小时，加入TMB于37℃作用10分钟，最后用H2SO4终止反应，测A450值。测得上述9个候选克隆的表达量如下
表2抗体基因在CHO细胞中表达强度
从表2可以看出，编号为5E3和4D9的细胞株的表达水平具有很高的表达水平(约100ug/毫升或更高)，已经超出了国内外单抗类的表达水平(国外现在一般是10-80ug/ml)。
(b)亲和力测定按以下方法对各克隆的细胞培养液进行纯化。10000rpm离心除去细胞和细胞碎片，100Kd截留分子量的滤膜超滤浓缩至1/10体积，超滤缓冲液是100mMTris-HCl，pH7.5。过SPA-sepharose亲和层析柱，上样液为100mM Tris-HCl，pH7.5，洗脱液为100mM Tris-HCl，pH7.5，100mM NaCl。分子筛(SephadexG200)层析。洗脱液为100mM Tris-HCl，pH7.5。得纯品。
亲和力测定采用Scatchard分析法(Munson et al，1980，Anal.BioChem.，107220)进行，结果表明，5E3和4D9两株单抗的亲和力分别达到4.5×10-9和1.58×10-8。
上述结果表明，5E3和4D9两株单克隆抗体的亲和力已经分别达到0.1nM和1nM的水平，具有很高的亲和力。
实施例6CD52单克隆抗体基因的序列确定对上述细胞株5E3和4D9的抗CD52单克隆抗体基因进行DNA测序。即用人源抗体可变区通用引物，进行PCR扩增，获得的轻链和重链可变区委托上海生工公司进行PCR测序。
结果显示在序列表中。对于单克隆抗体5E3而言，SEQ ID NO1和SEQID NO3分别是本发明获得的高活性高表达CD52单克隆抗体5E3的重链可变区和轻链可变区的DNA编码序列；SEQ ID NO2和SEQ ID NO4分别是根据上述DNA编码序列推测的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列。
对于单克隆抗体4D9而言，SEQ ID NO11和SEQ ID NO13分别是本发明获得的高活性高表达CD52单克隆抗体5E3的重链可变区和轻链可变区的DNA编码序列；SEQ ID NO12和SEQ ID NO14分别是根据上述DNA编码序列推测的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列。
注SEQ ID NO5和SEQ ID NO15的序列相同。
实施例75E3和4D9所产生的单克隆抗体的生物学活性检测用常规方法分离人外周血淋巴细胞，调整细胞密度为2×106细胞/毫升。将两人PBMC(同种异体双向MLR)等体积混合，以2×105细胞/孔的密度接种“U”型96孔培养板。加入不同体积的纯化融合蛋白，设置等体积相应空载体转染上清或培养基作对照，每组3个孔，37癈、5％CO2培养5天，终止培养前16小时加入3H-TdR(终浓度5μCi/ml)。收集细胞于0.45微米微孔滤膜上，烘干，用液体闪烁计数仪测DPM值。统计学处理结果以平均值±标准偏差表示，用Microsoft Excel统计程序进行均数差异显著性分析。
在MLR反应体系中，分别加入1微升、5微升和10微升经抗CD52单克隆抗体表达载体或空载体转染、Protein A纯化的CHO细胞上清。结果表明，即使加入1微升Protein A纯化的细胞上清也能显著抑制人外周血MLR，抑制率为66％～75％；而加入同样体积的空载体转染的CHO细胞上清，则无此作用。经单因素方差分析，其差异达到非常显著的水平，结果见表3。
表3纯化CD52单克隆抗体对人MLR中淋巴细胞增殖的影响(DPM，n＝3)
MLR实验表明该蛋白具有抑制免疫应答反应的活性，5E3具有较强的抑制作用，4D9次之。以上结果表明在CHO细胞中表达了有生物学活性的抗CD52单抗。此外，本发明的抗CD52抗体可用于治疗慢性淋巴细胞白血病。
应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表<110>马，菁<120>抗CD52单克隆抗体、其编码序列及应用<130>027427<160>20<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>363<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(363)<223>抗CD52抗体重链的编码序列<400>1caggtccaac tgcaggagag cggtccaggt cttgtgagac ctagccagac cctgagcctg 60acctgcaccg tgtctggcag caccttcagc gatttctaca tgaactgggt gagacagcca 120cctggacgag gtcttgagtg gattggattt attagagaca aagctaaagg ttacacaaca 180gagtacaatc catctgtgaa ggggagagtg acaatgctgg tagacaccag caagaaccag 240ttcagcctga gactcagcag cgtgacagcc gccgacaccg cggtctatta ttgtgcaaga 300gagggccaca ctgctgctcc ttttgattac tggggtcaag gcagcctcgt cacagtctcc 360tca363<210>2<211>121<212>PRT<213>人工序列
<220>
<221>MISC FEATURE<222>(1)..(121)<223>抗CD52抗体重链的氨基酸序列<400>2Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln1 5 10 15Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Phe20 25 30Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Lys Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro50 55 60Ser Val Lys Gly Arg Val Thr Met Leu Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln65 70 75 80Phe Ser Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr85 90 95Tyr Cys Ala Arg Glu Gly His Thr Ala Ala Pro Phe Asp Tyr Trp Gly100 105 110Gln Gly Ser Leu Val Thr Val Ser Ser115 120<210>3<211>324
<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(324)<223>抗CD52抗体轻链的编码序列<400>3gacatccaga tgacccagag cccaagcagc ctgagcgcca gcgtgggtga cagagtgacc 60atcacctgta aagcaagtca gaatattgac aaatacttaa actggtacca gcagaagcca 120ggtaaggctc caaagctgct gatctacaat acaaacaatt tgcaaacggg tgtgccaagc 180agattcagcg gtagcggtag cggtaccgac ttcaccttca ccatcagcag cctccagcca 240gaggacatcg ccacctacta ctgcttgcag catataagta ggccgcgcac gttcggccaa 300gggaccaagg tggaaatcaa acgt 324<210>4<21l>108<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(108)<223>抗CD52抗体轻链的氨基酸序列<400>4Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Ile Asp Lys Tyr20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45Tyr Asn Thr Asn Asn Leu Gln Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Ile Ser Arg Pro Arg85 90 95Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 105<210>5<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>MISC FEATURE<222>(1)..(5)<223>重链CDR1<400>5Asp Phe Tyr Met Asn1 5<210>6<211>19<212>PRT<213>人工序列
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(19)<223>重链CDR2<400>6Phe Ile Arg Asp Lys Ala Lys Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro Ser1 5 10 15Val Lys Gly<210>7<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(10)<223>重链CDR3<400>7Glu Gly His Thr Ala Ala Pro Phe Asp Tyr1 5 10<210>8<211>11<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(11)<223>轻链CDR1
<400>8Lys Ala Ser Gln Asn Ile Asp Lys Tyr Leu Asn1 5 10<210>9<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(7)<223>轻链CDR2<400>9Asn Thr Asn Asn Leu Gln Thr1 5<210>10<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(9)<223>轻链CDR3<400>10Leu Gln His Ile Ser Arg Pro Arg Thr1 5<210>11<211>363
<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(363)<223>抗CD52抗体重链的编码序列<400>11caggtgcagc tgcaggagtc cggccccggc ctggtgcgcc cctcccagac cctgttcctg 60acctgcaccg tgtccggctc caccttctcc gacttctaca tgaactgggt gcgcttcccc 120cccggccgcg gcgccgagtg gatcggcttc atccgcgaca agggcaaggg ctacacctcc 180gagtacaacc cctccgtgaa gggccgcgtg accatgtccc gcgacaactc caagaactcc 240ttctccctgc gcctgtccac ccgcaccgcc cccgacaccg ccgtgtacta ctgcgcccgc 300gagggccaca acctggcccc cttcgactac tggggcatcg gctccctggt gaccgtgtcc 360tcc363<210>12<211>121<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(121)<223>抗CD52抗体重链的氨基酸序列<400>12Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln1 5 10 15Thr Leu Phe Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ser Thr Phe Ser Asp Phe
20 25 30Tyr Met Asn Trp Val Arg Phe Pro Pro Gly Arg Gly Ala Glu Trp Ile35 40 45Gly Phe Ile Arg Asp Lys Gly Lys Gly Tyr Thr Ser Glu Tyr Asn Pro50 55 60Ser Val Lys Gly Arg Val Thr Met Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Ser65 70 75 80Phe Ser Leu Arg Leu Ser Thr Arg Thr Ala Pro Asp Thr Ala Val Tyr85 90 95Tyr Cys Ala Arg Glu Gly His Asn Leu Ala Pro Phe Asp Tyr Trp Gly100 105 110Ile Gly Ser Leu Val Thr Val Ser Ser115 120<210>13<211>324<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(324)<223>抗CD52抗体轻链的编码序列<400>13gacatccaga tgacccagtc cccctcctcc ctgtccgcct ccgtgggcga ccgcgtgacc 60atctcctgca agctgtccca gaacatcgac aagtacatca actggtacca gcagaagccc120
ggcgagtccc ccaagctgct gatctacaac accaacaacg cccagaccgg cgtgcccttc180cgcttctccg gctccggcac cggcaccgac tccaccctga ccatctccac cctgcagccc240gaggacgtgg ccaccttcta ctgcctgcag cacatcaccc gcccccgcac ctccggccag300ggcaccaagg tggagatcaa gcgc 324<210>14<211>108<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(108)<223>抗CD52抗体轻链的氨基酸序列<400>14Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Lys Leu Ser Gln Asn Ile Asp Lys Tyr20 25 30Ile Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Glu Ser Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45Tyr Asn Thr Asn Asn Ala Gln Thr Gly Val Pro Phe Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Thr Gly Thr Asp Ser Thr Leu Thr Ile Ser Thr Leu Gln Pro65 70 75 80Glu Asp Val Ala Thr Phe Tyr Cys Leu Gln His Ile Thr Arg Pro Arg
85 90 95Thr Ser Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 105<210>15<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(5)<223>重链CDR1<400>15Asp Phe Tyr Met Asn1 5<210>16<211>19<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(19)<223>重链CDR2<400>16Phe Ile Arg Asp Lys Gly Lys Gly Tyr Thr Ser Glu Tyr Asn Pro Ser1 5 10 15Val Lys Gly
<210>17<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(10)<223>重链CDR3<400>17Glu Gly His Asn Leu Ala Pro Phe Asp Tyr1 5 10<210>18<211>11<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(11)<223>轻链CDR1<400>18Lys Leu Ser Gln Asn Ile Asp Lys Tyr Ile Asn1 5 10<210>19<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(7)<223>轻链CDR2<400>19Asn Thr Asn Asn Ala Gln Thr1 5<210>20<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(9)<223>轻链CDR3<400>20Leu Gln His Ile Thr Arg Pro Arg Thr1 权利要求
1.一种单克隆抗体VH链，其特征在于，它的互补决定区CDR具有选自下组的CDR的氨基酸序列SEQ ID NO5所示的CDR1，SEQ ID NO6或16所示的CDR2，SEQ ID NO7或17所示的CDR3。
2.如权利要求1所述的单克隆抗体VH链，其特征在于，它具有SEQ ID NO2或12所示的氨基酸序列。
3.一种单克隆抗体VL链，其特征在于，它的互补决定区CDR具有选自下组的CDR的氨基酸序列SEQ ID NO8或18所示的CDR1，SEQ ID NO9或19所示的CDR2，SEQ ID NO10或20所示的CDR3。
4.如权利要求3所述的单克隆抗体VL链，其特征在于，它具有SEQ ID NO4或14所示的氨基酸序列。
5.一种单克隆抗体，其特征在于，其VH链具有SEQ ID NO2或12所示的氨基酸序列，且其VL链分别具有SEQ ID NO4或14所示的氨基酸序列。
6.如权利要求5所述的单克隆抗体，其特征在于，它是人源化的单克隆抗体。
7.一种DNA分子，其特征在于，它编码选自下组的蛋白质权利要求1所述的单克隆抗体VH链；权利要求3所述的单克隆抗体VL链；权利要求5所述的单克隆抗体。
8.如权利要求7所述的DNA分子，其特征在于，它具有选自下组的DNA序列SEQ ID NO1、3、11或13。
9.一种药物组合物，其特征在于，它含有单克隆抗体和药学上可接受的载体，所述单克隆抗体的VH链和VL链分别具有SEQ ID NO5-7和SEQ ID NO8-10所示的互补决定区。
10.如权利要求9所述的药物组合物，其特征在于，所述单克隆抗体的VH链具有SEQ ID NO2或12所示的氨基酸序列，且其VL链分别具有SEQ ID NO4或14所示的氨基酸序列。
全文摘要
本发明提供了一种抗CD52的特异性单克隆抗体。该单克隆抗体稳定性好、特异性强，特别适用于预防和治疗移植排斥反应以及治疗慢性淋巴细胞白血病。本发明还提供了所述单克隆抗体的制备方法以及含有所述单克隆抗体的药物组合物。
文档编号C12N15/11GK1508155SQ0215517
公开日2004年6月30日 申请日期2002年12月18日 优先权日2002年12月18日
发明者马菁, 马 菁 申请人:马菁, 马 菁