专利名称：表面固定有蛋白酶的带氨基的纳米磁性微球及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属生化分析技术领域，具体涉及一种表面固定有蛋白酶的带氨基的纳米磁性微球上及其制备方法和在蛋白酶解中的应用。
背景技术：
在蛋白质的鉴定分析中，蛋白质的酶解是关键的一步。传统的溶液酶解方法步骤烦琐、耗时长，不利于实现自动化操作。随着目前全球对生物体中蛋白质组学研究的大规模展开，迫切需要发展更有效、更简单的蛋白酶解技术。
固定化酶来代替传统的溶液酶解具有许多优点(1)提高酶稳定性，可重复使用；(2)提高单位体积的酶浓度，从而增加酶使用效率，减少酶解时间；(3)易于将固定化酶和底物、产物分离，肽谱中不出现酶的自水解峰；(4)可用于构造酶反应器，反复分批反应和连续反应，有利于实现通量化和自动化。磁性微球近年来吸引了越来越多地关注，将其作为固定化酶的载体，具有方便操作和重复性好的优点。纳米磁性微球是在以前的磁性微球的基础上诞生的。磁性微球指的是一种壳/核结构的微球，核由金属氧化物(如铁、钴、镍的氧化物)组成，壳由高分子材料组成，根据应用需要在磁性纳米核外包被不同的高分子材料。利用传统的方法制得的纳米磁性微球具有较好的单分散性和结晶度，然而，在经过表面修饰之前，这些采用热分解技术制得的纳米磁性微球仅在非极性溶剂里具有很好的分散性，这大大阻碍了它们在生物技术领域的应用。最近，有文献报道了一种一步合成带氨基的纳米磁性微球的方法，所制得的磁性微球粒径分布广；具有超顺磁性；并在水中具有良好的单分散性；在生物技术领域具有广阔的应用前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种表面固定有蛋白酶带氨基的纳米磁性微球及其制备方法和在蛋白酶解中应用。
本发明提出的在带氨基的纳米磁性微球上固定蛋白酶的方法，具体步骤如下(1)将干燥的粒径在15-200纳米间的带氨基磁性微球分散于50mM醋酸胺缓冲液(记为CB，其组成NH4OAc为50mM，CaCl21mM，MnCl21mM，pH 8.0-8.5)中，磁性微球在溶液中的含量为1-10mg/mL；(2)用磁铁吸住纳米磁性微球，移去CB，将其重新分散于戊二醛(GA)的CB溶液中(该溶液中，GA的重量含量为5％-10％，pH 6.5-7.0)，并在室温下活化1-3小时；
(3)将被GA活化的纳米磁性微球分散于蛋白酶的CB溶液中并在室温下浸泡3-5小时以固定酶，其中CB溶液中蛋白酶的含量为2-5mg/mL，NaCNBH3的重量含量为0.8-1.2％；(4)将固定了蛋白酶的纳米磁性微球分散于甘氨酸的CB溶液中并在室温下浸泡1-2小时以封闭磁性微球上未固定酶的醛基，其中CB溶液中甘氨酸的含量为0.5％-1.0％，NaCNBH3的重量含量为0.8-1.2％。
由上述方法制备的固定酶的纳米磁性微球具有超顺磁性，即磁粒只有在外磁场作用下才表现出强的磁性，而当外磁场撤去后，则不再有磁性，其饱和磁化强度高，剩磁和矫顽力小。一般近似球形，粒度大小可根据需要的不同在15-200nm范围内选择，制得的纳米磁性微球粒径比较均匀，粒度分布范围比较窄，在±10％之内。纳米磁性微球可较好地分散于水溶液中，不易沉淀与相互凝絮。蛋白酶的固定量为50-100μg/mg。
本发明中，所述纳米磁性微球为通常指的壳/核结构的纳米微球，其核由金属氧化物(如铁、钴、镍等的氧化物)组成，壳由高分子材料组成。
本发明制备的纳米磁性微球可应用于蛋白酶解，包括蛋白质溶液酶解、蛋白质芯片酶解和蛋白质靶上酶解等。
本发明的固定有蛋白酶的纳米磁性微球在蛋白质溶液酶解中的应用，具体包括如下步骤(1)待酶解的蛋白质溶液在90-100℃下热变性15-30分钟；(2)将表面固定有蛋白酶的纳米磁性微球分散于CB中，加入已变性的蛋白质，在30-40℃下酶解0.5-2小时，其中磁性微球在CB溶液中的含量为1-3mg/mL；(3)用磁铁吸住磁性微球后，将上清液点到靶板上；(4)再将含有α-氰基-4-羟基肉硅酸(CHCA)的乙腈溶液点在样品靶上，干燥后送入质谱仪进行分析。
本发明的固定有蛋白酶的纳米磁性微球在蛋白质芯片酶解中的应用，具体包括如下步骤(1)将磁铁置于芯片微通道的下方；(2)表面固定酶的磁性微球分散液在泵的推动下流过芯片微通道；(3)磁性微球在磁场作用下被固定于芯片微通道内，形成1-3mm的填充床。
(4)待酶解的蛋白质溶液在90-100℃下热变性15-30分钟；(5)将蛋白溶液用泵推入基于功能化磁性微球的芯片酶反应器中，两端密封，在20-60℃下酶解2-10分钟；(6)将基于功能化磁性微球的芯片酶反应器中的酶解产物用泵推出，收集后点在靶板上；(7)再将含有α-氰基-4-羟基肉硅酸(CHCA)的乙腈溶液点在样品靶上，干燥后送入质谱仪进行分析。
本发明的固定有蛋白酶的纳米磁性微球在蛋白质靶上酶解中的应用，具体包括如下步骤(1)待酶解的蛋白质溶液在90-100℃下热变性15-30分钟；(2)将1μL表面固定有蛋白酶的磁性微球分散液点到MALDI靶板上；(3)将1μL待酶解的蛋白溶液点到同一个靶点上；(4)在20-60℃下酶解2-10分钟；(5)用磁铁吸走纳米磁性微球；(6)再将含有α-氰基-4-羟基肉硅酸(CHCA)的乙腈溶液点在样品靶上，干燥后送入质谱仪进行分析。
具体实施例方式
下面通过实施例对本发明作进一步具体描述。
实施例1.在带氨基的纳米磁性微球表面固定蛋白酶(1)将1mg干燥的粒径为500nm的带氨基的纳米磁性微球分散于200μL 50mM醋酸胺缓冲液(CB，CaCl21mM，MnCl21mM，pH 8.3)中；(2)用磁铁吸住纳米磁性微球，移去CB，将其重新分散于200μL戊二醛(GA)的CB溶液中(GA 5％-10％，pH 6.8)，并在室温下活化1.5小时；(3)将被GA活化的纳米磁性微球分散于200μL蛋白酶的CB溶液中并在室温下浸泡3h以固定酶，其中CB溶液中蛋白酶的含量为5mg/mL，NaCNBH3的含量为1％；(4)将固定了蛋白酶的纳米磁性微球分散于200μL甘氨酸的CB溶液中并在室温下浸泡1小时以封闭磁性微球上未固定酶的醛基，其中CB溶液中甘氨酸的含量为0.5％-1.0％，NaCNBH3的含量为1％。
经测试，每毫克带氨基的纳米磁性材料上固定的蛋白酶的量为50-100微克。
实施例2.将固定了蛋白酶的纳米磁性微球应用于蛋白质溶液酶解(1)0.2mg/mL的细胞色素C的CB溶液在95℃下热变性15分钟；(2)1mg固定了蛋白酶的纳米磁性微球分散于1mLCB中，去10μL磁性微球分散液加入10μL已变性的细胞色素C溶液，在37℃下酶解1小时，其中磁性微球在CB溶液中的含量为1-3mg/mL；(3)用磁铁吸住磁性微球后，将上清液点到靶板上；
(4)再将含有α-氰基-4-羟基肉硅酸(CHCA)的乙腈溶液点在样品靶上，干燥后送入质谱仪进行分析。
质谱分析的结果与传统溶液酶解得到的结果相似，细胞色素C匹配上的肽段个数为12，氨基酸个数为81，肽段覆盖率为77％。
实施例3.将固定了蛋白酶的纳米磁性微球应用于蛋白质芯片酶解(1)将磁铁置于芯片微通道的下方；(2)固定酶的磁性微球分散液在泵的推动下流过芯片微通道；(3)磁性微球在磁场作用下被固定于芯片微通道内，形成1-3mm的填充床。
(4)0.2mg/mL的细胞色素C的CB溶液在95℃下热变性15分钟；(5)将0.5μL已变性的细胞色素C溶液用泵推入基于功能化磁性微球的芯片酶反应器中，两端密封，在50℃下酶解5分钟；(6)将基于功能化磁性微球的芯片酶反应器中的酶解产物用泵推出，收集后点在靶板上；(7)再将含有α-氰基-4-羟基肉硅酸(CHCA)的乙腈溶液点在样品靶上，干燥后送入质谱仪进行分析。
质谱分析的结果显示，细胞色素C匹配上的肽段个数为9，氨基酸个数为81，肽段覆盖率为77％。
实施例4.将固定了蛋白酶的纳米磁性微球应用于蛋白质靶上酶解(1)将1μL固定了蛋白酶的磁性微球分散液点到MALDI靶板上；(2)0.2mg/mL的细胞色素C的CB溶液在95℃下热变性15分钟；(3)将1μL已变性的细胞色素C溶液点到同一个靶点上；(4)在50℃下酶解5分钟；(5)用磁铁吸走纳米磁性微球；(6)再将含有α-氰基-4-羟基肉硅酸(CHCA)的乙腈溶液点在样品靶上，干燥后送入质谱仪进行分析。
质谱分析的结果显示，细胞色素C匹配上的肽段个数为13，氨基酸个数为80，肽段覆盖率为76％。
权利要求
1.一种表面固定有蛋白酶的带氨基的纳米磁性微球，其特征在于所述微米磁性微球带有氨基且固定有蛋白酶，蛋白酶的固定量为50-100μg/mg，粒径为15-200nm。
2.一种如权利要求1所述的表面固定有蛋白酶的带氨基的纳米磁性微球的制备方法，其特征在于具体步骤如下(1)将粒径为15-200纳米的带氨基磁性微球分散于醋酸铵缓冲液中，记该缓冲液为CB，磁性微球在CB中的含量为1-10mg/mL(2)用磁铁吸住纳米磁性微球，移去CB，将其重新分散于戊二醛的CB溶液中，并在室温下活化1-3小时，所述戊二醛的CB溶液中戊二醛的含量为5％-10％，pH值为6.5-7.0；活化时间为1-3小时；(3)将被戊二醛活化的纳米磁性微球分散于含蛋白酶的CB溶液中并在室温下浸泡3-5小时以固定酶，其中，所述蛋白酶的CB溶液中，蛋白酶的含量为2-5mg/mL，NaCNBH3的含量为0.8-1.2％；浸泡时间为3-5小时；(4)将固定了蛋白酶的纳米磁性微球分散于甘氨酸的CB溶液中，并在室温下浸泡1-2小时以封闭磁性微球上未固定酶的醛基；所述甘氨酸的CB溶液中，甘氨酸的含量为0.5％-1.0％，NaCNBH3的含量为0.8-1.2％；浸泡时间为1-2小时。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述醋酸铵缓冲液的组成为NH4OAc为50mM，CaCl2为1mM，MnCl2为1mM，pH值为8.0-8.5。
4.一种如权利要求1所述的表面固定有蛋白酶的带氨基的纳米磁性微球在蛋白质溶液酶解、蛋白质芯片酶解或蛋白质靶上酶解中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于应用于蛋白质溶液酶解的具体步骤如下(1)待酶解的蛋白质溶液在90-100℃下热变性15-30分钟；(2)固定有蛋白酶的纳米磁性微球分散于CB中，加入已经热变性的蛋白质，在30-40℃下酶解0.5-2小时，其中，磁性微球在CB溶液中的含量为1-3mg/ml；(3)用磁铁吸住磁性微球后，将上清液点到靶板上；(4)再将含有α-氰基-4-羟基肉硅酸的乙腈溶液点在样品靶上，干燥后送入质谱仪进行分析。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于应用于蛋白质芯片酶解的具体步骤如下(1)将磁铁置于芯片微通道的下方；(2)表面固定酶的磁性微球分散液在泵的推动下流过芯片微通道；(3)磁性微球在磁场作用下被固定于芯片微通道内，形成1-3mm的填充床；(4)待酶解的蛋白质溶液在90-100℃下热变性15-30分钟；(5)将蛋白溶液用泵推入基于功能化磁性微球的芯片酶反应器中，两端密封，在20-60℃下酶解2-10分钟；(6)将基于功能化磁性微球的芯片酶反应器中的酶解产物用泵推出，收集后点在靶板上；(7)再将含有α-氰基-4-羟基肉硅酸的乙腈溶液点在样品靶上，干燥后送入质谱仪进行分析。
7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于应用于蛋白质靶上酶解的具体步骤如下(1)待酶解的蛋白质溶液在90-100℃下热变性15-30分钟；(2)将1μL表面固定有蛋白酶的磁性微球分散液点到MALDI靶板上；(3)将1μL待酶解的蛋白溶液点到同一个靶点上；(4)在20-60℃温度下酶解2-10分钟；(5)用磁铁吸走纳米磁性微球；(6)再将含有α-氰基-4-羟基肉硅酸的乙腈溶液点在样品靶上，干燥后送入质谱仪进行分析。
全文摘要
本发明属生化分析技术领域，具体为一种表面固定有蛋白酶的带氨基的纳米磁性微球及其制备方法和在蛋白质酶解中的应用。所述磁性纳米微球经一步水热法合成，表面带有氨基，具有超顺磁性，平均粒径大小为15－200nm。使用戊二醛作为交联剂，在所得的带氨基的纳米磁性微球表面固定了蛋白酶，并利用其对蛋白质进行了溶液酶解、芯片酶解和靶上酶解。本发明使用的带氨基的纳米磁性微球固定酶的方法简单，固定酶后酶解效率高、酶解速度快，十分适合应用于复杂生物样品中蛋白的快速分离鉴定，在蛋白质组学研究等领域有良好的实用价值和应用前景。
文档编号C12Q1/00GK1975429SQ200610147250
公开日2007年6月6日 申请日期2006年12月14日 优先权日2006年12月14日
发明者邓春晖, 李嫣, 张祥民, 徐秀青 申请人:复旦大学