专利名称：一种fgfr1高表达的重组hek293细胞及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及FGFR高表达的非癌细胞的构建，特别涉及一种基 于外源重组质粒的FGFR1高表达的重组HEK293细胞及其应用。
背景技术：
酪氨酸激酶受体(RTK)是一个庞大的家族，在生物体的生命活动中担当着非常重 要的作用。当配体与RTK结合后，能诱导受体构象变化，导致受体发生稳定的二聚化，二聚 化的受体相互交叉磷酸化，在受体激酶区内形成含有磷酸化酪氨酸位点的基序，并伴有PTK 的激活。酪氨酸特异的磷酸化使激酶区稳定在激活的构象，并为下游含有src癌基因家族 SH2区和结合磷酸化酪氨酸的功能区(phosphotyrosine binding domain, PTB)的信号转导 分子提供识别、停靠和结合的部位。这些信号转导蛋白又可进一步募集含有SH2、PTB、SH3 以及PH区的其他一些效应蛋白，在膜上组装成激活的信号转导的复合物，通过启动细胞内 的信号通路(如 PLC y -DAG-PKC 与 IP3_Ca2+ 释放、PI-3K-PKB 通路、Ras-Raf-MAPK 通路 等)调节细胞的生长、分化、运动、变形和代谢等，导致多种效应。成纤维生长因子受体(fibroblastgrowthfactorreceptor, FGFR)属于酪氨酸激 酶受体家族中的一类，目前已确定有4种独立基因分别编码FGFR1-FGFR4。与其它的酪氨酸 激酶受体一样，FGFR1-FGFR4都由三个结构域组成胞外配体结合结构域，单链跨膜结构域 及胞桨区。酪氨酸激酶受体FGFR通过FGFR转录本的选择性剪切产生很多FGFR亚型，各亚 型具有组织特异性和配体结合特异性。不同亚型的FGFR胞外区含有2-3个Ig样结构域，被定义为D1-D3结构域；也 分别称为Loop I、II、III，配体的特异性由LoopIII决定。在D1和D2的连接处有7-8 个酸性氨基酸残基组成的“酸性盒”，是所有FGFRs都具有的保守结构，与FGFR的功能 有关。在D2区有与肝素硫酸盐蛋白结合的保守序列，具有活性的碱性成纤维生长因子 (basicfibroblastgrowthfactor, bFGF)可以选择性地与载体蛋白肝素硫酸盐蛋白多糖 (HSPG)发生可逆性结合，这种载体蛋白能够将bFGF从胞外储蓄区转运到细胞膜受体FGFR 上，并且防止bFGF在这一过程中被降解或失活。D3区也有重要的生物学功能，可溶性的 分泌型FGFR可以选择性剪切D3结构域，剪切后的结构域能够改变它与配体结合的特性 (Cytokine & Growth factor reviews,2005,16(2) :139_149)。bFGFs/FGFR激活的信号转导途径主要包括以下几种(1)PKC路径。FGFR被激活 后，它不断地与磷酸脂酶C y (PLC-y)分子上的SH2结构域结合来快速吸纳该分子，激 活的PLC-Y水解其底物4，5_ 二磷酸磷脂酰肌醇，形成二酰基甘油(DAG)和三磷酸肌醇 (IP3)2个信号分子。IP3通过与细胞内特异受体结合而刺激细胞内的钙池释放Ca27钙调 蛋白依赖性蛋白激酶。此外，Ca2+与二酰基甘油都能激活蛋白激酶C。由PIP水解产生的 二级信号除了磷酸化和激活转录因子外，还激活了多种细胞内的反应(Cell，2000，103 (2) 211-225)。(2)Ras/Raf/MAP。FGF与FGFR结合后，使Gabl发生磷酸化，磷酸化的Gabl与 Grb2的SH3结构域结合，形成复合物。同时，Grb2/FRS2复合物促使磷酸化的Gabl募集含有SH2结构域的信号蛋白分子，包括Sos，Ras, Raf。Raf蛋白磷酸化后引起MAPKK信号通 路发生级连放大效应(Cytokine & Growth Factor Reviews, 2000,11 (4) :295_302)。(3) JAK/STAT途径。FGF与FGFR结合后，FGFR的自身磷酸化使JAK活化，活化的JAKs使受体 磷酸化，再活化信号转导子和转录活化子蛋白(STAT)，STAT蛋白能使C端保存的酪氨酸残 基磷酸化。STATs被磷酸化后即脱离它所在的受体形成稳定的同源或异源的二聚体式并定 位于细胞核，与、干扰素激活部位(GAS)增强子家族成员结合并激活靶基因的转录(国际 病理科学与临床杂志，2007，27 (2) 125-129)。肿瘤的发生、发展和转移依赖于肿瘤血管形成，只有在新生血管形成以后，肿瘤才 能迅速生长，并进一步向周围浸润和进入血液循环向远处转移，而bFGF就是肿瘤血管形成 中主要的促血管生成因子之一。多种肿瘤的发生都与bFGF/FGFR相关，前列腺癌、胃癌、乳 腺癌、结肠癌、肺癌、肝癌、神经胶质瘤等肿瘤组织都大量表达FGFR。bFGF通过与受体FGFR结合，促进或抑制信号转导途径上的一些蛋白分子的激活， 导致细胞大量增殖，抑制细胞调亡的发生进而形成肿瘤(Journal of Hepatology, 2008, Available online 120ctober 1-10 ；Cellular Signalling,2008,20(6) :1061_1072)。目 前，寻找靶标开发抗肿瘤药物已成为治疗恶性肿瘤生长和转移的重要手段之一。在FGFR1 抑制剂的研发中，已有一些药物(如NP603, SU6668，PD173074, SU4984，SU5416)对肿瘤细 胞的生长有一定的抑制作用，但都因为抑制效果不明显或副作用大而不能成为抗肿瘤药物 应用于临床(Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 2007,17(17) :4812_4818)。研究其配体与受体的相互作用特异性位点为寻找合适的药物作用靶点有重要的 意义。以FGFR1为靶点，寻找抑制恶性肿瘤中FGFR1高表达的药物是研发抗肿瘤药物的重要 途径之一。目前对FGFR1基因的研究较多，但大部分研究只针对受体的胞外区，或胞内区部 分基因的载体构建，对全长序列FGFR1载体的构建及生物学特性研究及其应用未见报道。
发明内容
本发明解决的问题在于提供一种FGFR1高表达的重组细胞，在构建FGFR1全长 基因的真核表达载体pcDNA3. l(+)-FGFRl的基础上，转染HEK293细胞，获得稳定、高表达 FGFR1分子的重组HEK293细胞株。本发明是通过以下技术方案来实现一种FGFR1高表达的重组HEK293细胞，该重组细胞是以HEK293细胞为宿主细胞， 转染宿主细胞的外源性表达载体的是包含FGFR1全长基因的表达载体。所述的FGFR1全长基因的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 1所示。所述的包含FGFR1全长基因的表达载体是pcDNA3. 1 (+)-FGFR1，该表达载体是通 过BamHI酶切位点将FGFR1全长基因克隆入真核表达载体pcDNA3. 1⑴。所述的FGFR1高表达的HEK293-FGFR1重组细胞应用于以FGFR为靶点的药物筛 选。与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果1、本发明构建了成纤维生长因子受体FGFR1的真核表达载体 pcDNA3. 1 (+)_FGFR1，基因测序结果与基因库人FGFR1 —致；pcDNA3. 1 (+)_FGFR1载体脂质 体法转染HEK293细胞，经过筛选获得了获得稳定、高表达FGFR1分子的重组HEK293-FGFR1细胞株；与现有只含FGFRl胞外区或部分基因序列构建的重组细胞相比，本发明构建的包 含FGFRl基因全长的重组HEK293-FGFR1细胞株表面能够稳定的表达FGFRl分子，而且具有 完整的分子活性FGFRl具有细胞增殖作用，重组HEK293-FGFR1细胞生长速度显著超过HEK293 ；FGFRl的细胞信号转导作用，以FGFRl受体特异性配体FGF-2作为刺激因子，诱导 作用HEK293-FGFR1细胞不同时间后，Western blot法检测细胞内磷酸化FGFRl及ERK蛋 白的表达量，结果显示与FGF-2结合后P-FGFR1、P-ERK得到表达，表明转染后的FGFRl具有 生物活性功能，激活了通路蛋白ERK。
2、作为宿主细胞的HEK293细胞为原代人胚肾细胞转染5型腺病毒(Ad5)DNA的永 生化细胞，该细胞本身含有的各种受体表达量相对较低；而重组后的HEK293-FGFR1细胞表 达的FGFRl受体的相对表达量比HEK293明显增高，相对于其他细胞表面分子占据表达优势 地位，在结合其配体方面处于有利地位；这样就大大提高了筛选以FGFRl为靶点药物的灵 敏性及特异性；细胞膜色谱法检测HEK293-FGFR1细胞对吉非替尼有一定的保留，可以应用以 FGFR为靶点的药物筛选；同时能够为进一步研究FGFRl生物学特性及其通路蛋白的差异性以及发现功能 蛋白的有效性提供较好的细胞模型。
图1是pcDNA3. 1⑴载体的质粒图谱；图2是纯化的FGFRl基因电泳检测图谱；图3是pcDNA3. 1 (+) -FGFRl载体转染大肠杆菌DH5 α经质粒提取后用BamHI和 EcoRI酶切鉴定图；图4是DMEM培养基加G418筛选阳性细胞的培养图；图5是HEK293-FGFR细胞的FGFR表达水平的RT-PCR检测图；图6是流式细胞术检测FGFR在各种细胞膜上的表达量，横坐标代表所测FGFR分 子的荧光强度(即“荧光道数”)，纵坐标代表细胞的相对数；图7是免疫荧光染色定性鉴定FGFRl在HEK293-FGFR1细胞中的表达图；图8是HEK293-FGFR1和ΗΕΚ293细胞生长曲线图；图9是FGF-2作用于HEK293-FGFR1细胞不同时间后，westernblot检测FGFRl信 号转导通路关键蛋白ERK、P-FGFRl及P-ERK的表达量；图10是MTT实验检测吉非替尼对HEK293-FGFR1细胞的抑制作用并绘制的量效曲 线图；图11是采用细胞膜色谱HEK293-FGFR1细胞对吉非替尼的保留图。
具体实施例方式本发明在构建FGFRl全长基因的真核表达载pcDNA3. 1 (+)-FGFRl的基础上，转染 HEK293细胞，获得稳定、高表达FGFR分子的重组HEK293-FGFR细胞株。下面对本方面做详细的说明，所述是对本发明的解释而不是限定。本发明是以pcDNA3. 1(+)为基础载体，(来源于西安交通大学第一附属医院所 赠)，其质粒图谱如图1所示，本发明选择BamHI酶切位点作为连接外源基因的多克隆位点； BamHI.EcoR I酶切位点作为载体构建的检测位点。1)构建真核表达载体 pcDNA3· 1 (+) -FGFRl a、设计包含酶切位点的引物对，以pCMV-SP0RT6-FGFRl质粒(含有FGFRl基因 cDNA全长序列，购自Open Biosystems公司，美国)为模板，PCR扩增FGFRl基因全长，所述 的引物对为上游弓丨物:cgggatccat gtggagctgg aag 23bp下游弓丨物:cgggatcctc agcggcgttt gagt 24bp其中，上游引物中RRatcc为BamHI酶切位点，本发明是通过单酶切位点将FGFRl 基因克隆入表达载体；另设一酶切位点gaattc为EcoRI酶切位点，用于后续重组子的酶切鉴定；PCR 反应体系为DNA 聚合酶(2. 5U/μ L) 0.25 μ L ;5 X Buffer 5yL;dNTP 混合物 2μ L ；上游引物(sense，10ymol/L)0. 5μ L ；下游引物(antisense, 10 μ mol/L) 0. 5 μ L ；模 板(cDNA) 2 μ L ；ddH20 14. 75 μ L ；Total :25 μ L。PCR的反应条件为95°C预变性2min ；98°C变性10s，62. 5°C退火15s，72 °C延伸 3min,循环35次；72°C延伸5min ；回收PCR产物，将目的基因FGFRl纯化，对纯化的FGFRl做 凝胶电泳检测，结果如图2所示，其中，泳道1为Marker，泳道2为纯化的2463bp的FGFRl 全长基因片段。b、将纯化的FGFRl、pcDNA3. 1 (+)载体在K缓冲液(K Buffer, Takara生物公司试 剂)作用下，分别BamHI酶切过夜；酶切体系如下BamHI 2 μ L ;10XH Buffer 2 μ L ；目的 基因 FGFR 片段或载体 pcDNA3. 16 μ L ；ddH20 10 μ L ；Total 20 μ L。分别纯化回收带黏性末端的2463bp的FGFRl片段和5428bp的pcDNA3. 1 (+) 载体片段，然后通过T4DNA连接酶连接，16 °C条件下反应16小时，构建真核表达载体 pcDNA3. 1(+)-FGFRl。将所得载体常规转化大肠菌DH5a，在含氨苄青霉素的LB琼脂平板中37°C培养，挑 取阳性克隆提取质粒，并进行电泳检测和测序。质粒酶切鉴定用BamHI于30°C酶切4h， EcoRI 37°C酶切4h，然后琼脂糖凝胶电泳检测。结果如图3所示，其中泳道M为maker ；泳道1为EcoRI酶切；泳道2为BamHI酶 切；泳道3为PCR扩增的FGFRl基因；泳道4为未酶切质粒pcDNA3. 1 (+) -FGFRl ；EcoRI酶 切后片段大小为5985bp和1906bp，BamHI酶切后片段大小为5428bp和2463bp，未酶切质 粒大小为7891bp ；酶切结果表明目的片段和pcDNA3. 1 (+)载体成功连接。将酶切和PCR检测鉴定正确的质粒进行测序，FGFRl全长基因片段的测序结果 如SEQ. ID. NO. 1所示，测序结果与基因库NCBI中的FGFRl序列(Transcript variant 2) 进行对比，分别在631bp和986bp处有两个碱基突变，上述2处突变后氨基酸残基性能 相同，而且突变位点不在功能区，且其突变不影响FGFRl蛋白的表达，至此真核表达载体 pcDNA3. 1 (+) -FGFRl 构建成功。2) pcDNA3. 1 (+) -FGFRl 表达载体转染 HEK293 细胞
c、采用脂质体2000将质粒转入HEK293细胞(脂质体2000购自美国GIBC0， Invitrogen公司，按照脂质体2000试剂盒说明书操作)，DMEM培养基(Dulbecco ‘ s Modified Eagle Media)加G418浓度800mg/L筛选14天，挑取G418抗性单克隆传代培养， 4周后调整G418浓度为300mg/L的DMEM培养基培养，得到含pcDNA3. 1⑴-FGFR1阳性转染 的克隆细胞株。 DMEM培养基加G418筛选阳性细胞14天后，作为对照的HEK293细胞培养图如图4a 所示，HEK293-FGFR1阳性细胞的细胞培养图如图4b所示；未转染质粒pcDNA3. 1 (+)_FGFR1 的HEK293细胞全部死亡，转染有质粒pcDNA3. 1 (+) -FGFR1的HEK293细胞部分出现死亡，存 活细胞与转染质粒含有抗G418抗性基因有关；表明质粒pcDNA3. l(+)-FGFRl成功转入宿主 细胞 HEK293。d、对转染细胞株的RT-PCR检测采用TRIZ0L试剂盒分别提取未转染和转染的细胞总RNA，并以总RNA为模板采用 Fermentas公司的cDNA合成试剂盒进行反转录，得到cDNA ；分别以所得cDNA为模板，PCR扩增FGFR1基因全长，PCR扩增条件与上述FGFR1 基因的PCR扩增方法相同，RT-PCR检测FGFR1在HEK293-FGFR1细胞中基因水平的表达， 结果如图5所示，其中，泳道M为Marker，泳道1为未转染的HEK293细胞，泳道2为重组 HEK293-FGFR1细胞，泳道3为转染空质粒作阴性对照；与泳道1、3相比，泳道2得到了 2463bp左右的条带，泳道1和3均没有得到相应 的条带，RT-PCR检测结果表明重组HEK293-FGFR细胞的FGFR1得到表达。e、流式细胞术检测HEK293-FGFR1细胞株中FGFR1的表达用胰酶消化贴壁培养的HEK293-FGFR1细胞，离心收集，计数。用冰预冷的PBS以 lOOOrpm离心5min洗涤三次。用冰预冷的含10% FBS、1 % NaN3的PBS重悬细胞，使其浓度 为1\107个/11^;取100 ilL细胞悬液到EP管中，离心弃上清。以含3%牛血清白蛋白的PBS以1 2000稀释小鼠抗FGFR1多克隆抗体为一抗， 取100i! L加入到细胞中，室温孵育45min ；对照组加入不含抗体的等量抗体稀释液。离心弃 上清，用冰预冷的PBS以lOOOrpm离心5min，重复洗涤三次。用含3% BSA的PBS以1 50 稀释异硫氰酸荧光素标记山羊抗小鼠IgG作为二抗，加入细胞中室温避光孵育45min。离心 弃上清，冰预冷的PBS离心洗涤三次。用lmL含3% BSA、1 % NaN3的PBS重悬细胞，使细胞 终浓度为1 X 106个/mL，用于流式细胞仪检测，结果如图6所示其中，图A为HEK293细胞的阴性对照，图B为癌细胞MCF7的FGFR1表达量的检 测图，图C为转染空载体的HEK293的FGFR1表达量的检测图，图D为HEK293-FGFR1的 FGFR1表达量的检测图，图中横坐标标注的Ml是以阴性细胞为准标出的，落在Ml右侧的 细胞越多，说明细胞表达的FGFR1含量越高，对比图A、图C可见转染空载体的HEK293的 FGFR1表达量与阴性对照相比，FGFR1的表达量基本一致，对比图A、图C与图D，可见重组的 HEK293-FGFR1的FGFR1表达量明显增加；对比图B、图D可见，HEK293-FGFR1细胞与MCF7 细胞的FGFR1表达量相比也明显增加。流式细胞术检测图具体数据为，转染前细胞的平均荧光强度为12.78% 士0. 23%，转染重组后的平均荧光强度为37. 89% 士 1. 64%，表达量比转染前高出2. 4倍。而且，高表达细胞株平均阳性细胞率为59. 58% 士 1.09%，未转染HEK293细胞阳
7性细胞率为3. 07% 士0. 18%，转染空载体pcDNA3. 1(+)的HEK293细胞阳性细胞率3. 24% 士0. 39%，可见最高表达FGFR1受体细胞株较转染前提高19倍。同时对A431细胞，CAC0-2细胞，MCF7细胞，A549细胞表面FGFR1受体表达量用 流式细胞术检测，MCF7细胞表达量最高，平均阳性细胞率为7. 48% 士0. 57%，低于重组的 HEK293-FGFR1的平均阳性细胞率。f、免疫荧光染色定性鉴定FGFR1在HEK293-FGFR1细胞中的表达取对数生长期的重组HEK293-FGFR1细胞，0. 25%胰蛋白酶消化，按1 X 105个/孔 接种于放有多聚赖氨酸预处理的无菌盖玻片的6孔板中，培养24h细胞贴壁后，弃去培养 基，用PBS轻轻洗涤爬有细胞的盖玻片三次。其中一抗、二抗同流式细胞检测的试剂，染色方法也同流式细胞检测的染色方法， 检测使用的是共聚焦显微镜(Leica TCS-SP2，德国)。结果如图7所示，其中，荧光分布于细 胞膜，一抗为鼠源性单克隆FGFR1，二抗为有绿色荧光标记的、抗鼠源性的IgG。FGFR1与一 抗、二抗结合形成免疫复合物并发出荧光，FGFR1表达越高，与之结合的一抗、二抗就越多， 所发出的荧光就越显著；与图7a所表示的HEK293细胞相比，图7b所代表的HEK293-FGFR1 细胞的荧光明显显著。3)HEK293-FGFR1细胞生长及活性分析g、HEK293-FGFR1细胞和HEK293细胞生长曲线的绘制取生长状态良好接近汇合的细胞，用0. 25%胰酶消化，用新培养基制成细胞悬液， 计数。根据细胞计数结果稀释细胞悬液至浓度为IX 104个/mL，接种96孔板，每板200 yL， 共接种11板，37°C培养箱中培养，每天取出一板MTT法测定0D值，连续测11天，期间4_5 天换一次培养基。以天数为横坐标，0D值为纵坐标，绘制生长曲线，如图8所示可以看出HEK293-FGFR1细胞生长速度显著超过HEK293，这表明重组的细胞表达 的FGFR1具有分子活性，促进了重组细胞的细胞增殖。h、HEKK293-FGFR1细胞和HEK293细胞周期的测定取对数生长期的细胞，按lX106/mL以2mL体积接种于6孔板内，培养48h后， 0. 25%胰酶消化，离心收集细胞，弃上清，用预冷PBS洗细胞两次，加入预冷70 %乙醇，于 4°C固定过夜。离心收集细胞，以lmL的PBS洗细胞一次，加入500 u LPBS含50 y g/mL溴化 乙锭(PI)，100 u g/mL RNase A, 4°C避光孵育30分钟。以标准程序用流式细胞仪检测，一般 计数2-3万个细胞，结果显示HEK293-FGFR1细胞的S期细胞数量最多，占72. 57%，其G2/ G1也显著高于HEK293细胞株，说明含该目的基因FGFR1的细胞增殖旺盛。i、ffesternblot 检测 p-FGFRl、p-ERK 及 ERK 的表达量用FGFR1 受体特异性配体 FGF-2 作用 HEK293-FGFR1 细胞 Omin，15min, 30min, 45min后，用裂解液RIPA裂解细胞后提取总蛋白，用BCA法测定蛋白含量。经电泳、转膜、免疫染色(一抗兔抗人FGFR1多克隆抗体，购于abeam公司；二抗 山羊抗兔，购于pierce公司)和显影，实验结果如图9所示无任何刺激的HEK293-FGFR1 (Control)显示为空白，也即阴性对照组无目标蛋白 P-FGFRl、P-ERK 和 ERK 的表达；实验组加FGF-2刺激不同时间后目标蛋白表达量也有不同，P-FGFR1在30min时表 达量明显都高于15min和45min时，P-ERK和ERK在15min时表达量均高于30min和45min时；在FGF-2 (50ng/mL)刺激下，HEK293-FGFR1细胞中FGFRl及下游的ERK蛋白磷酸化水平
明显提高；
从Westernblot的结果得出，HEK293-FGFR1细胞中重组表达的FGFRl能够磷酸化 激活，并开启下游ERK信号通路，具有生物活性。j、MTT法分析吉非替尼对HEK293-FGFR1增殖的影响取对数生长期HEK293-FGFR1细胞，0. 25%胰蛋白酶消化，计数，按1X IO4个/孔浓 度接种于96孔培养板内，每孔体积200 μ L0 37°C,5% CO2、饱和湿度条件下培养24h后，加入 吉非替尼溶液溶液20 μ L，使吉非替尼终浓度分别为0. 1,0. 5,2. 5,5,12. 5、25、50 μ mol/L，对 照组加入等量药物溶剂。每个浓度6个复孔。继续培养48h后，小心吸弃孔内培养液，每孔 加入无血清培养基200 μ L，然后加入5mg/mL MTT溶液20 μ L，37°C孵育4h，终止培养。小心 吸弃孔内培养液上清，每孔加入150 μ L DMS0,振荡lOmin，使结晶物充分溶解，用酶标仪测定 490nm波长下各孔吸光度。取各复孔吸光度平均值，根据下式计算吉非替尼对细胞的抑制率
抑制率(ο/ο) ^ξΙ^ΙΙ^οοο, Iv 对照组吸光度值J以药物浓度的负对数为横坐标，细胞生长抑制率为纵坐标作图，得到抑制作用曲 线，如图10所示随着吉非替尼浓度的增大，吉非替尼对HEK293-FGFR1细胞的抑制作用 明显增强；经计算吉非替尼半数抑制浓度IC50为65. 896 μ mol/L ；这说明重组细胞表达的 FGFRl受体与配体吉非替尼结合后，抑制了 FGFRl高表达的重组细胞的生长。5)细胞膜色谱检测HEK293-FGFR细胞对吉非替尼的保留高表达FGFRl的HEK293-FGFR1细胞膜色谱柱经平衡后进行样品检测，结果发现吉 非替尼在该细胞膜上有很好的保留，同时以未转染的HEK293细胞作为阴性对照。HEK293-FGFR1细胞膜对吉非替尼的保留如图11所示，横坐标为时间(分钟)，纵 坐标为保留量(洗脱量)；冊1(293呼6 1 1细胞膜对吉非替尼具有一定的保留，水洗脱在3.2 分钟的时候达到峰值，HEK293-FGFR1细胞株在细胞膜色谱分析筛选针对FGFR靶点或者能 与FGFR结合的药物，具有一定的亲和力、高灵敏度，说明HEK293-FGFR1细胞可用于以FGFR 为靶点的药物筛选。核苷酸序列表<110>西安交通大学<120> 一种FGFRl高表达的重组HEK293细胞及其应用<160>1<210>1<211>2463<212>DNA<213> 人 FGFRl 全长基因<400>1atgtggagct ggaagtgcct cctcttctgg gctgtgctgg tcacagccac actctgcacc 60gctaggccgt ccccgacctt gcctgaacaa gcccagccct ggggagcccc tgtggaagtg 120gagtccttcc tggtccaccc cggtgacctg ctgcagcttc gctgtcggct gcgggacgat 180
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tga246权利要求
一种FGFR1高表达的重组HEK293细胞，其特征在于，该重组细胞是以HEK293细胞为宿主细胞，转染宿主细胞的外源性表达载体的是包含FGFR1全长基因的表达载体。
2.如权利要求1所述的FGFRl高表达的重组HEK293细胞，其特征在于，所述的FGFRl 全长基因的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 1所示。
3.如权利要求1所述的FGFRl高表达的重组HEK293细胞，其特征在于，所述的包含 FGFRl全长基因的表达载体是pcDNA3. 1 (+)-FGFRl，该表达载体是通过BamHI酶切位点将 FGFRl全长基因克隆入真核表达载体pcDNA3. 1 (+)。
4.权利要求3所述的FGFRl高表达的HEK293-FGFR1重组细胞应用于以FGFR为靶点的 药物筛选。
全文摘要
本发明公开了一种FGFR1高表达的重组HEK293细胞及其应用，该重组细胞是以HEK293细胞为宿主细胞，转染宿主细胞的外源性表达载体的是包含FGFR1全长基因的表达载体。与现有只含FGFR1胞外区或部分基因序列构建的重组细胞相比，本发明构建的包含FGFR1基因全长的重组HEK293-FGFR1细胞株表面能够稳定的表达FGFR1分子，而且具有完整的分子活性。细胞膜色谱法检测HEK293-FGFR1细胞对吉非替尼有一定的保留，可以应用以FGFR为靶点的药物筛选。
文档编号C12N5/10GK101875916SQ200910246588
公开日2010年11月3日 申请日期2009年11月27日 优先权日2009年11月27日
发明者周亚丽, 孙萌, 张彦民, 李淼, 罗文娟, 贺浪冲 申请人:西安交通大学