专利名称：检测蛋鸡fmo3基因多态性的试剂盒及其方法
技术领域：
本发明涉及的是一种生物技术领域的试剂盒及其检测方法，特别是一种检测蛋鸡 FM03基因多态性的试剂盒及其方法。
背景技术：
随着人们物质生活水平的不断提高，人们对畜、禽产品品质的要求也越来越高。鸡 蛋作为人们膳食中重要的组成部分，高品质的鸡蛋越来越受到消费者的青睐。多年来，科学 家一直致力于研究如何改善和提高鸡蛋质量，以期为消费者提供更为营养和健康的产品。 人们发现，在食用的鸡蛋当中，有的鸡蛋“腥味”较淡，有的“腥味”较为浓烈，特别是饲喂添 加鱼粉和油菜籽的饲料时，某些品种鸡(如洛岛红等)的这种“腥味”性状尤为明显，但有 些个体饲喂不添加这些成份的饲料时，仍然会有该性状的出现。由于鸡蛋产品的特殊性，在 检测鱼腥味性状时会造成很大浪费。因此，弄清鸡蛋产生鱼腥味的内在机理，利用分子生物 学技术手段有效剔除“不利”性状并进行分子育种，具有重要的经济意义和应用价值。含黄素单氧化Sl 3 基因(Flavin-containing mono-oxygenase3gene, FM03gene) 俗称鱼腥味基因。在人上，该基因所编码的蛋白能够参与三甲胺(Trimethylamine，TMA) 的氧化，使其转变成无味的N-氧化三甲胺(Trimethylamine N-oxide, ΤΜΑ0)后随体液排 出体外，如该基因突变可导致TMA氧化能力降低，未氧化的TMA随体液排出，产生鱼腥味综 合症(Trimethylaminuria, TMAU) (Dolphin et al. , 1997 ；Cashman et al. , 1997 ；Treacy etal.，1998 ；Akerman et al.，1999 ；Hernandez et al. ,2002)。Lund6n 等(2002a，2002b) 研究发现，在奶牛中该基因第六外显子存在一个无义突变(Nonsense mutation)，导致基因 表达过程提前终止，引起突变个体生产的牛奶产生鱼腥味。Honkatukia等(2005)将FM03基因定位在鸡8号染色体上，该基因包含9个外显 子，cDNA 序列全长 1882bp (GenBank Accession Number :AJ431390)，编码 531 个氨基酸。 该基因自5，末端(GenBank Accession Number :AJ431390)第1034位脱氧核糖核苷酸存 在A > T突变，引起第329位氨基酸由苏氨酸(T)转变为丝氨酸(S)，故将此位点定义为 T329S。由于该突变引起该基因在进化上高度保守的五肽模块(Motif)FATGY发生改变，造 成TMA氧化能力障碍，导致TMA在鸡蛋中沉积(Lattard et al.，2001 ；Honkatukia et al.， 2005)。由于该表型属于非伴性遗传(Pearson et al.，1983)和隐性遗传(Bolton et al.， 1976 ；Honkatukia et al.，2005)，但存在依赖外在环境的加性效应(Bolton et al.，1976 ； Kretzschmar et al.，2007)，因此，利用传统育种手段很难有效剔除“不利”等位基因，随着 分子生物学技术的不断发展，从分子水平研究FM03基因的机理成为可能，以标记辅助选择 为代表的分子育种逐渐成为育种领域中重要选育方法之一。SNP(Single nucleotide polymophism)是指在染色体基因组水平上单个核苷酸 变异引起的DNA序列多态性。目前，关于检测单核苷酸多态性(SNP)的方法很多，如限制性 片段长度多态性(PCR-RFLP)、单链构象多态性(PCR-SSCP) ,DNA测序、DNA芯片以及TaqMan 探针等。PCR-RFLP方法具有操作简单、检测时间短、检测成本较低，重复性好等优点而被广
3泛应用。2008年，中国农业大学(专利申请号200810055748. 6)采用PCR-RFLP方法分析 了白莱航蛋鸡、东乡绿壳蛋鸡和H褐壳蛋鸡三个品种鸡群FM03基因T329S位点的基因型分 布。但在绿壳蛋鸡中，由于距T329S位点附近上游第4042位脱氧核糖核苷酸存在G > A的 突变，引起自5，末端第4040位与4041位脱氧核糖核苷酸之间产生一个新的BsrI限制酶 切位点，同时在T329S下游4315位和4316位脱氧核糖核苷酸之间存在一个固有的BsrI限 制酶切位点(GenBank Accession Number :NC_006095)，该方法中的引物将这三个位点包含 其中，利用该方法在判定部分绿壳蛋鸡个体T329S位点突变等位基因时，对含有4042位脱 氧核糖核苷酸突变个体基因型进行检测可能会由于酶切条带混乱和复杂而产生异议。鉴于 此，本发明基于一套新的引物，避开了第4042位脱氧核糖核苷酸多态性带来的干扰，建立 了一套新的T329S位点多态性的PCR-RFLP技术检测体系，
发明内容
本发明的目的在于针对现有检测方法的不足，提出一种检测蛋鸡FM03基因多态 性的试剂盒及其方法。本发明涉及检测蛋鸡FM03基因多态性的试剂盒，该试剂盒包括碱基序 列如下的正向引物和反向引物正向引物5，-CGGTGTTGAATGATGAC-3’反向引物 5，-GCATTTGTAGAGGGTAG-3，；dNTPs ；DNA 聚合酶及其相应 10XPCR 缓冲液(10XPCR 缓冲液 包括200mM Tris-HCl ；200mM KCl ；IOOmM(NH4)2SO4 ； 15mM MgCl2)；限制性核酸内切酶 BsrI 及其相应的IOX酶切缓冲液(10 X酶切缓冲液包括100mM Tris-HCl ； IOOmM MgCl2 ； Img/ ml BSA)。所述试剂盒中试剂均可通过生物公司或试剂公司购买得到。本发明涉及上述试剂盒检测蛋鸡FM03基因多态性的方法，包括以下步骤(1)基因组DNA的提取采集鸡翅膀根部静脉血，利用DNA提取试剂盒提取基因组 DNA，DNA样品被稀释成IOOng/ μ 1备用；(2)特异性PCR扩增利用步骤(1)中提取的基因组DNA为模板进行特异性PCR扩 增；(3)酶切使用限制性内切酶对步骤(2)中的PCR产物进行酶切；(4)电泳将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，对基因型进行判定。所述步骤(2)中使用的特异性引物包括正向引物和反向引物，如下所示正向引物5，-CGGTGTTGAATGATGAC-3，反向引物5，-GCATTTGTAGAGGGTAG-3，，步骤(3)中所述的限制性内切酶为BsrI内切酶。步骤(2)中PCR扩增反应体系为鸡基因组DNA 100ng、10XPCR缓冲液2. 0 μ 1、 dNTPs (10mmol/L)混合物 0.4 μ 1、Taq DNA 聚合酶(2. 5U/μ 1) 0. 4 μ 1、正向引物 6. Opmol、 反向引物6. Opmol、用ddH20补充混合液至20. 0μ 1。所述20. 0 μ 1 PCR扩增反应体系下，94°C预变性5min ；后进入循环程序94°C变性 30s、56°C退火30s、72°C延伸45s，共计32个循环；72°C延伸IOmin。所述步骤(3)在10. 0 μ IBsrI酶切体系中进行，10. 0 μ IBsrI酶切体系包括步骤 (2)中PCR扩增产物8. 5 μ 1、10 X酶切缓冲液1. 0μ 1、内切酶BsrI (10U/μ 1)0. 5 μ 1。
4
步骤(3)中所述的PCR产物包括自5’末端(GenBank Accession Number AJ431390)第1034位脱氧核糖核苷酸即T329S位点脱氧核糖核苷酸(GenBank Accession Number NC_006095自5’末端第4181位脱氧核糖核苷酸)，根据该位点脱氧核糖核苷酸是野 生型A还是突变型T对基因型进行判定，如果酶切产物为146bp和78bp两种片段，显示检 测个体基因型为AA型，为野生型纯合体，电泳结果为两条带；如果酶切产物为224bp、146bp 和78bp三种片段，显示检测个体基因型为AT型，为杂合体，电泳结果为三条带；如果酶切产 物为224bp —种片段，显示检测个体基因型为TT型，为突变型纯合体，电泳结果为一条带。本发明针对现有检测方法的不足，设计了新的特异性引物，优化了检测步骤；本发 明聚合酶链反应结合限制性片段长度多态性(Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism,PCR-RFLP)检测技术重复性好，操作简单、灵活，结果判断 准确、明了，检测效率高，检测成本低，特别适用于已知突变位点的检测，具有良好的应用前 景。本发明检测方法可有效剔除“不利”等位基因，解决了传统育种手段较难剔除该等位基 因的问题，加速育种进程，降低育种费用，在无鱼腥味蛋鸡配套系选育工作中具有非常广阔 的应用前景。
图1是FM03基因含T329S位点(A > T) PCR产物酶切后电泳图；图2是FM03基因含T329S位点部分PCR扩增产物测序峰图；图3是FM03基因含T329S位点部分PCR扩增产物克隆测序峰图；图4是PCR扩增产物全长克隆测序峰图。
具体实施例方式下面结合附图对本发明的实施例作详细说明以下实施例在以本发明技术方案为 前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施 例。实施例1检测蛋鸡FM03基因多态性检测方法的建立。本实施例选择自建绿壳蛋鸡801、802品系和国外引进白莱航蛋鸡品系为实验材 料，检测FM03基因多态性的检测方法包括如下步骤(1)基因组DNA的提取采集鸡翅膀根部静脉血，利用DNA提取试剂盒提取基因组DNA，DNA样品被稀释成 IOOng/μ 1 备用；(2)特异性PCR扩增利用步骤(1)中提取的基因组DNA为模板进行特异性PCR扩增；PCR扩增反应中使用的引物根据GenBank公布的FM03基因序列(GenBank Accession Number :NC_006095)，利用Premier5. 0软件设计，引物特异扩增片段包含T329S 位点在内，即GenBank Accession Number NC_006095的自5，末端第4181位脱氧核糖核苷 酸，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，引物包括正向引物和反向引物，引物碱基序列 如下
正向引物5，-CGGTGTTGAATGATGAC-3，反向引物5，-GCATTTGTAGAGGGTAG-3，；PCR扩增体系基因组DNAIOOng10 X PCR 缓冲液2. 0 μ 1dNTPs(10mmol/L)混合物0. 4 μ 1Taq DNA 聚合酶(2. 5U/ μ 1)0. 4 μ 1正向引物6. Opmol反向引物6. Opmol用ddH20补充混合液至20. 0 μ 1。PCR反应条件为94°C预变性5min ；后进入循环程序94°C变性30s、56°C退火 30s、72°C延伸45s，共计32个循环；72°C延伸lOmin，4°C保存待用。(3) RFLP 分析使用限制性内切酶BsrI对步骤(2)中的PCR产物进行酶切；限制性内切酶BsrI 识别序列如下5' -ACTG GN 1 -3'3，-TGAC t CN-5，箭头“ 1 ”和“ t ”表示限制性内切酶BsrI酶切位点，“N”代表任何脱氧核糖核苷酸。BsrI酶切反应体系PCR 产物8. 5 μ 1IOX酶切缓冲液Ι.ΟμΙ内切酶 BsrI(10U/y 1)0. 5 μ 1总体积ΙΟ.ΟμΙ混合体系置于65°C恒温水浴温孵3 6小时。(4)电泳分析将步骤(3)中的酶切产物在新鲜制备的2. 096琼脂糖凝胶电泳，电泳缓冲液为 1.0XTAE,电泳电压为8V/cm，电泳时间为30 40min。使用Tanon_2500凝胶成像系统观 察、拍照，结果如图1所示。由图1可见，电泳结果呈现不同的带型，其中产生两条电泳条带泳道中的片段大 小分别为146bp和78bp，如图1中2号至6号泳道所示，显示检测个体为AA基因型，为野生 型纯合体；产生三条电泳条带泳道中的片段大小分别为224bp、146bp和78bp，显示检测个 体为AT基因型，为杂合体，如图1中1号和7号泳道所示；所检测的群体中未发现TT基因 型的存在，因此没有出现只有一种片段即224bp的电泳结果。(5) PCR产物测序和克隆测序及序列分析将步骤(4)中出现的不同基因型个体的PCR产物进行测序，同时进行克隆测序，一 方面确定PCR扩增产物为目的条带，另一方面与PCR产物测序结果进行相互佐证，确保基因 型判定的准确性。PCR产物回收采用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(天根生化科技有限公司)，根据说 明进行操作；PCR产物克隆载体为PMD18-T (大连宝生物工程有限公司)，转化细胞为DH5 α感受态细胞(上海索莱宝生物科技有限公司)，将筛选出的阳性克隆和PCR产物进行测序， 序列测定由上海生工生物工程技术有限公司完成。T329S位点测序结果如图2和图3，标示 下划线的脱氧核糖核苷酸为T329S位点脱氧核糖核苷酸，PCR扩增产物为目的产物如图4。由上可知，本实施例结果完全正确。实施例2不同品种鸡FM03基因T329S位点基因型及等位基因频率分布。利用检测蛋鸡FM03基因多态性的检测试剂盒对不同品种鸡进行检测。检测蛋 鸡FM03基因多态性的检测试剂盒包含碱基序列如下的正向引物和反向引物正向引物 5，-CGGTGTTGAATGATGAC-3，，反向引物5，-GCATTTGTAGAGGGTAG-S^dNTPs ；DNA 聚合酶及其 相应10XPCR缓冲液；限制性核酸内切酶BsrI及其相应的IOX酶切缓冲液。按照实施例 1中步骤(1)提取的待检测鸡只基因组DNA为模板；按照实施例1中步骤(2)进行特异性 PCR扩增；按照实施例1中步骤(3)进行RFLP分析；按照实施例1中步骤(4)进行电泳分 析。两个不同品种鸡FM03基因T329S位点基因型及等位基因频率分布情况如表1所 示表1 从表1可以看出，绿壳蛋鸡中含有突变等位基因T的存在，这与国内已有报道结果 不一致(张龙超，2007)，这可能是由于虽然同为绿壳蛋鸡，但是其群体来源和遗传背景等 存在较大差异造成的；通过对本实施例中含有T突变等位基因个体和不含T突变等位基因 个体进行RFLP对比分析(附图1)和序列对比分析(附图2和附图3)，证明本检测结果是准 确和可靠的；本实施例中检测的绿壳蛋鸡FM03基因T329S位点没有发现TT纯合基因型的 存在。白莱航蛋鸡品系中没有T突变等位基因的存在，这与已有报道相符(张龙超，2007)， 说明检测结果是可靠的。 在绿壳蛋鸡中，虽然没有发现可引起鱼腥味鸡蛋的TT纯合基因型的存在，但是由 于T突变等位基因的存在，可以推测其后代产生TT纯合基因型的可能性仍然存在，因此通 过分子手段育种进行T等位基因的剔除是必要和可行的。
权利要求
一种检测蛋鸡FMO3基因多态性的试剂盒，其特征在于，包括碱基序列如下的正向引物和反向引物正向引物5’ CGGTGTTGAATGATGAC 3’反向引物5’ GCATTTGTAGAGGGTAG 3’；dNTPs；DNA聚合酶及其相应10×PCR缓冲液；限制性核酸内切酶BsrI及其相应的10×酶切缓冲液；所述的PCR缓冲液为200mM Tris HCl；200mM KCl；100mM(NH4)2SO4；15mM MgCl2；所述的酶切缓冲液为100mM Tris HCl；100mM MgCl2；1mg/ml BSA。
2.一种如权利要求1所述的试剂盒检测蛋鸡FM03基因多态性的方法，其特征在于，包 括以下步骤(1)基因组DNA的提取采集鸡翅膀根部静脉血，利用DNA提取试剂盒提取基因组DNA， DNA样品被稀释成lOOng/μ 1备用；(2)利用步骤(1)中提取的基因组DNA为模板进行特异性PCR扩增；(3)使用限制性内切酶对步骤(2)中的PCR产物进行酶切；(4)将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，对基因型进行判定。
3.如权利要求2所述的检测蛋鸡FM03基因多态性的方法，其特征是，步骤⑵中PCR 扩增反应体系为鸡基因组DNA 100ng、10 XPCR缓冲液2· 0μ 1、dNTPs (1 Ommol/L)混合物 0. 4 μ l.Taq DNA 聚合酶(2. 5U/μ 1) 0. 4 μ 1、正向引物 6. Opmol、反向引物 6. Opmol、用 ddH20 补充混合液至20.0 μ 1。
4.如权利要求3所述的检测蛋鸡FM03基因多态性的方法，其特征是，所述20.Ομ PCR 扩增反应体系下，94°C预变性5min ；后进入循环程序94°C变性30s、56°C退火30s、72°C延 伸45s，共计32个循环；72°C延伸IOmin。
5.如权利要求2所述的检测蛋鸡FM03基因多态性的方法，其特征是，所述步骤(2)中 使用的特异性引物包括正向引物和反向引物，如下所示正向引物5’ -CGGTGTTGAATGATGAC-3，反向引物5’ -GCATTTGTAGAGGGTAG-3，。
6.如权利要求2所述的检测蛋鸡FM03基因多态性的方法，其特征是，所述步骤(3) 在10. OylBsrI酶切体系中进行，10. 0 μ IBsrI酶切体系包括步骤(2)中PCR扩增产物 8. 5 μ IUOX 酶切缓冲液 1. 0μ 1、内切酶 BsrI(10U/y 1)0. 5 μ 1。
7.如权利要求2所述的检测蛋鸡FM03基因多态性的方法，其特征是，步骤⑶中所述 的限制性内切酶为BsrI内切酶。
8.如权利要求2所述的检测蛋鸡FM03基因多态性的方法，其特征是，步骤⑶中所述 的PCR产物包括自5’末端第1034位脱氧核糖核苷酸即T329S位点脱氧核糖核苷酸，根据 该位点脱氧核糖核苷酸是野生型A还是突变型T对基因型进行判定如果酶切产物为146bp和78bp两种片段，显示检测个体基因型为AA型，为野生型纯合 体，电泳结果为两条带；如果酶切产物为224bp、146bp和78bp三种片段，显示检测个体基因型为AT型，为杂合 体，电泳结果为三条带；如果酶切产物为224bp —种片段，显示检测个体基因型为TT型，为突变型纯合体，电泳 结果为一条带。
全文摘要
一种生物技术领域的检测蛋鸡FMO3基因多态性的试剂盒及其方法。试剂盒包括碱基序列如下的正向引物和反向引物正向引物5’-CGGTGTTGAATGATGAC-3’反向引物5’-GCATTTGTAGAGGGTAG-3’；dNTPs；DNA聚合酶及其10×PCR缓冲液；限制性核酸内切酶BsrI及其相应的10×酶切缓冲液。本发明解决了传统育种手段较难剔除该等位基因的问题，加速育种进程，降低育种费用，在无鱼腥味蛋鸡配套系选育工作中具有非常广阔的应用前景。
文档编号C12Q1/68GK101899524SQ20101025556
公开日2010年12月1日 申请日期2010年8月17日 优先权日2010年8月17日
发明者张向喆, 杨长锁, 潘玉春, 王起山, 陈强 申请人:上海交通大学