专利名称：抗结核杆菌esat-6单克隆抗体tbea8及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及抗结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶蛋白(ESAT-6) 的单克隆抗体的制备及应用，是利用细胞工程、抗体工程技术，获得分泌抗ESAT-6的单克 隆抗体的杂交瘤细胞系，通过同品系的小鼠诱导腹水，制备抗EAST-6的单克隆抗体TBEA8， 鉴定为IgG2b、κ型，再通过亲和纯化、电泳、免疫等技术实现对该抗体的应用。
背景技术：
结核早期诊断技术是一直困扰医学诊断领域的一个重要难题。20世纪，因抗生素 研究的发展和广泛应用，人类曾成功地控制了结核病。但是，由于抗药性不断出现与积累， 结核分枝杆菌对于21世纪的人类依然是一个现实威胁。更严重的是，近年来，全球人类免 疫缺陷病毒(HIV)和艾滋病(AIDS)的流行已成为全球结核病发病率及死亡率第三次回升 的主要原因，同时结核病也是AIDS病人最常见的机会感染和致死病因。结核病和艾滋病并 发的趋势，使得治疗难上加难。诊断是治疗的前提，如果能够早期诊断，结核病的危害会大 幅度减小。中国作为结核菌高感染率地区和HIV感染的快速增长地区，提高结核病及HIV/ AIDS合并结核感染的早期准确诊断水平刻不容缓。传统的早期诊断手段是结核菌素皮试。这是基于迟发型超敏反应原理的一种皮肤 试验。但是两个缺陷使得这种诊断方法的意义非常有限。其一该方法不能区分曾经感染 过结核杆菌的健康者与结核杆菌正在活动的发病者；其二 该方法不能区分结核杆菌的感 染者与卡介苗的注射者。所以，传统的早期诊断方法只能提供非常有限的参考信息，确诊往 往要等到病人出现结核病灶之后。而这时候再做治疗已经晚了，特别是对耐药结核杆菌，病 人预后很差。ELISP0T技术带来了结核病早期诊断的革命。其一，由于ELISP0T方法采用结核 分枝杆菌特异性的多肽，可以避免卡介苗注射者的交叉反应；其二，由于ELISP0T检测的 是病人当时的细胞免疫水平，可以有效区别健康的TB携菌者与发病的TB活动病人。但是 ELISP0T检测步骤繁琐，需要特殊仪器设备且试剂昂贵，在多数低收入的结核高负担国家和 地区较难推广。发展一种快速、灵敏的结核早期诊断方法已迫在眉睫。基于以上背景，本项目选定 目前公认的结核分枝杆菌特异抗原蛋白ESAT-6为靶抗原，利用现代生物信息学和分子生 物学技术，设计并合成几段候选的ESAT-6特异的抗原肽序列，采用融合杂交瘤技术建立稳 定分泌抗结核分枝杆菌特异抗原蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞系，并大量制备、纯化和鉴 定这些单克隆抗体。该单克隆抗体的成功获得，为建立新型的结核病诊断方法——基于免 疫学技术的诊断奠定物质基础。同时对疾病发病机理、诊断、预后及疗效判定等方面的研究 起到重要作用。本发明用到杂交瘤细胞技术。该技术将免疫小鼠的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融 合，以建立分泌均质抗体的杂交瘤细胞系，也称为单克隆抗体技术。该技术涉及到动物免 疫、细胞培养、细胞融合、细胞克隆培养和免疫测定等一系列方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种抗结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶蛋白(ESAT-6)的单 克隆抗体，具有 SEQ No. 1 的氨基酸序列Ser lie His Ser Leu LeuAsp Glu Gly Lys Gln Ser Leu0该单克隆抗体亚型为IgG2b、κ型，命名为杂交瘤细胞株ΤΒΕΑ8，能特异性识别结 核分枝杆菌早期分泌性抗原靶蛋白(ESAT-6)的aa 24-36SIHSLLDEGKQSL抗原肽序列。抗 结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶蛋白(ESAT-6)的单克隆抗体杂交瘤细胞已由中国典型培 养物保藏中心保藏；地址中国武汉武汉大学；保藏日期2010年8月17日；培养物名称、 株号和符号(包括基因型)结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶蛋白(ESAT-6)单克隆抗体杂 交瘤细胞 TBEA8(IgG2b、κ 型)，保藏编号为:CCTCCN0 :C201081。本发明的第二个目的提供抗ESAT-6单克隆抗体的制备方法，通过以下步骤和技 术方案实现(1)动物的免疫选择6周龄的BALB/C小鼠，以抗原肽(ESAT-6的第24_36位氨 基酸，13肽SIHSLLDEGKQSL)对小鼠进行免疫。13肽SIHSLLDEGKQSL通过固相法合成，在美 国ABI公司的多肽合成仪(431A)上进行，采用Fmoc (9-芴甲氧羰基)方案，合成步骤按照 ABI公司的多肽合成操作手册进行。经高效液相色谱纯化，纯度> 95%，序列鉴定通过质谱 分析。(2)小鼠骨髓瘤细胞的培养培养小鼠骨髓瘤细胞SP2/0并使之保持良好的生长 状态用于细胞融合。(3)细胞融合采用聚乙二醇融合法。以BALB/C小鼠腹腔巨噬细胞作为饲养细胞， 在融合前一天，接种BALB/C小鼠腹腔巨噬细胞于96孔培养板，含20 % FCS的HAT培养基培 养一天。取(1)中小鼠的脾脏淋巴细胞和(2)中小鼠的骨髓瘤细胞，将上述两种细胞混合 离心，然后以聚乙二醇(PEG 6000)介导细胞融合，融合后的细胞适当稀释，接种至饲养细 胞培养板，适当条件培养。(4)杂交瘤细胞的筛选将上述培养物在HAT选择性培养基中培养。在细胞集落 长到大小合适时，吸取细胞培养上清液做抗体鉴定，筛选阳性克隆。(5)杂交瘤细胞的克隆化以有限稀释法克隆杂交瘤细胞，将稀释到一定密度的 细胞接种至96孔板，使每孔只有一个细胞生长。形成细胞集落的孔取培养上清液做酶联免 疫吸附实验(ELISA)，鉴定阳性克隆。重复有限稀释克隆若干次，直到杂交瘤细胞的阳性孔 率达到100%。将克隆化后的杂交瘤细胞扩大培养做抗体鉴定及理化性状分析。(6)单抗腹水的诱导在接种杂交瘤细胞前一周，给BALB/C小鼠腹腔注射降植烷 每只0. 5ml，然后每只接种5X IO6阳性杂交瘤细胞，10天后收集腹水离心，测定抗体效价， 并纯化单克隆抗体。(7)单克隆抗体的纯化利用Protein G亲和纯化法纯化腹水中的单克隆抗体。(8)本发明得到一个产生抗ESAT-6单克隆抗体的杂交瘤细胞系，即TBEA8，TBEA8 杂交瘤细胞系经3次克隆化，持续培养六月余，分泌抗体稳定。该细胞株经液氮冻存，复苏 后生长良好，抗体分泌未见衰退。ELISA间接法测得TBEA8培养上清效价为1 256，腹 水效价分别为1 16384。经单克隆抗体免疫球蛋白亚型分析显示该杂交瘤细胞产生的 抗体类型为IgG2b。TBEA8已在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏号是CCTCCNo.C201081。本发明提供产生单克隆抗体的杂交瘤细胞，它是由免疫的BALB/c小鼠脾细胞和 小鼠骨髓瘤细胞SP2/0经融合、筛选、克隆、传代和反复冻存、复苏后获得的小鼠杂交瘤细 胞系TBEA8，能稳定分泌抗ESAT-6的单克隆抗体TBEA8。本发明的另一个目的是提供该单克隆抗体TBEA8在结核分枝杆菌早期分泌性抗 原靶蛋白检测和样本中的ESAT-6蛋白的表达水平进行定性和定量中的应用，通过下述途 径实现①以单克隆抗体TBEA8为探针，用SDS-PAGE电泳通过免疫印迹方法(Western Blot)方法，对结核杆菌及其培养物、各种体液样本、基因重组及人工合成样本中的ESAT-6 蛋白的情况进行鉴定。②以单克隆抗体TBEA8为结合抗体，用免疫沉淀方法来鉴定上①所述试验样本中 ESAT-6的表达。③以单克隆抗体TBEA8作为包被抗体或检测抗体，通过酶联免疫吸附试验 (ELISA)对结核杆菌培养物、各种体液样本、基因重组及人工合成样本中的ESAT-6蛋白的 表达水平进行定性和定量分析。本发明的优点在于提供了一种抗结核分枝杆菌特异抗原ESAT-6的单克隆抗体， 尚未见文献报道。制备方法简单易行，更为重要的是该方法制备的单克隆抗体可以有多种 用途，如对临床和实验室的结核分枝杆菌的细菌培养物、结核分枝杆菌、临床体液样本、基 因重组蛋白中ESAT-6分子表达情况进行定性和定量分析，以及各种研究用途。说明书附1为单克隆抗体TBEA8的免疫球蛋白亚型分析。图2采用免疫沉淀和Western-blot方法检测重组ESAT-6/CFP-10融合蛋白、结核 分枝杆菌和其它分枝杆菌及其培养上清液等样本中ESAT-6蛋白的表达。图3用单抗作为包被抗体，重组ESAT-6/CFP-10融合蛋白作为标准抗原的酶联免 疫吸附试验标准反应曲线。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。实施例1.抗ESAT-6的单克隆抗体的制备方法(1)小鼠的免疫首次免疫，将交联KLH的ESAT-6的13肽(序列 aa24-36SIHSLLDEGKQSL)以弗氏完全佐剂乳化，第2、3次以不完全佐剂乳化，每BALB/C小鼠 0. 2ml (含ESAT-6抗原肽200 μ g)，背部皮内多点注射，每两周一次。6周后加强免疫一次， 于3天后进行细胞融合。(2)小鼠骨髓瘤细胞SP2/0的培养把来自BALB/C小鼠的SP2/0骨髓瘤细胞株以 含10% FBS-DMEM培养基培养传代，在含5% CO2饱和湿度的37°C孵箱中培养。融合前一天 传代以保证融合时细胞进入对数生长期。(3)细胞融合以BALB/C小鼠腹腔巨噬细胞作为饲养细胞，在融合前一天，接种 BALB/C小鼠腹腔巨噬细胞于96孔培养板，含20 % FCS的HAT培养基培养一天，次日取脾脏，置200目不锈钢筛网中，剔除脂肪和结缔组织，撕开包膜，分离脾细胞，离心洗涤细胞1 2次后用培养液重悬。收集小鼠SP2/0骨髓瘤细胞，离心，洗涤2次后用培养液重悬，作为 待融合的SP2/0细胞。以1. OX IO8个免疫小鼠脾淋巴细胞与1. OX IO7个小鼠骨髓瘤细胞 SP2/0混合，在50% PEG6000作用下融合。两种细胞混合后洗涤一次，离心弃上清，轻弹管 壁悬开细胞(勿加液体)用37°C预温的50% PEG6000(pH 8. 0) 0. 8ml于60 90秒内逐滴 加入细胞沉淀中，其间轻轻振摇离心管，但勿吹打，静置1分钟，然后按先慢后快的原则，于 第1分钟内加完Iml无血清RPMI 1640，于第2分钟内加完2ml无血清RPMI 1640，于第3 分钟内加完7ml无血清RPMI 1640，以后1分钟内逐渐加入37°C预温的无血清RPMI1640培 养基30 40ml。800转/分钟低速离心5 10分钟。然后加入20% FCS HAT培养基，分 别接种到加有饲养细胞的96孔培养板，一般每次融合的细胞铺4块板，置37°C 5% CO2孵 才苜中培养。(4)杂交瘤细胞的筛选每隔4天换1/2培养液(HAT) —次，10天后改用含HT培 养液。融合后的杂交瘤细胞在含HT的选择性培养液中大约持续培养两周。在细胞集落长 到适当大小时(在10倍物镜下观察，细胞克隆大小以占满一个视野为宜)，吸取培养液上 清，适当稀释后做ELISA，筛选阳性克隆。采用ELISA间接法筛选阳性杂交瘤克隆。主要步 骤①0. OlM pH9. 6碳酸盐缓冲液稀释ESAT-6/CFP-10重组融合蛋白，以及合成的ESAT-6 特异多肽，浓度200ng/ml，分别于96孔酶标板加入0. Iml/孔包板，4 °C过夜；②0. OlM pH7. 4PBS-Tween 20洗板三次；③用2% BSA-0. OlM pH 7. 2的PBS封闭1小时；④同上洗 板；⑤加入1 5稀释的杂交瘤培养上清，0.1ml/孔，同时设阳性对照(免疫小鼠的血清)、 阴性对照(SP2/0培养上清液)和空白对照，室温反应2小时；⑥洗板；⑦加1 5000稀释 的羊抗小鼠Ig(G+M)-HRP，0. 1ml/孔，室温反应1小时；⑧洗板；⑨加入底物(TMB)室温避光 反应5 10分钟；⑩2M H2S04终止反应；450nm测定其OD值，以P/N≥2. 1为阳性。(5)杂交瘤细胞的克隆化杂交瘤细胞的克隆化培养按有限稀释法进行，选择抗 体检测阳性(ESAT-6/CFP-10重组融合蛋白和合成的ESAT-6特异多肽均阳性)的杂交瘤孔 细胞作适当增殖后，准确计数细胞。用完全1640培养基稀释成10个/ml的细胞悬液接种 到已有饲养细胞的96孔培养板中，每孔0. 1ml，7-10天后观察细胞生长情况，并检测上清 液中抗体水平，选择5个抗体滴度最高的，呈单个克隆细胞生长的培养孔，作再次克隆化培 养。此方法可重复多次，直至单克隆孔抗体检测阳性率为100%。(6)诱生腹水在接种杂交瘤细胞前一周，给BALB/C小鼠腹腔注射降植烷每只 0. 5ml，然后每只接种5. OX 1O6阳性杂交瘤细胞，10天后收集腹水测定抗体效价。(7)单克隆抗体的纯化采用亲和纯化法(Protein G交联的S印harose)纯化腹水 中单克隆抗体。①腹水用冷Binding Buffer (结合缓冲液)稀释3倍后，于4°C 1OOOOrpm 离心15分钟去除沉淀物。②将预装有S印harose-Protein G的亲和纯化柱用10倍柱床体 积的Binding Buffer充分流洗。③将稀释的腹水上柱，控制流速8 10滴/分钟。④将 流穿的腹水重复上柱一次。⑤用20倍柱床体积的Binding Buffer充分洗涤，直至流穿液 A280吸光值小于0.01。⑥用Elution Buffer (洗脱缓冲液)洗脱结合的单克隆抗体，控制 流速8 10滴/分钟，收集洗脱液于预加有0. 1ml的磷酸钾缓冲液(PH7. 9,0. 5M)的收集 管中，每管收集0. 5ml含抗体的洗脱液，共收集20管以上。⑦于A280nm检测每管洗脱液的吸光度，并收集吸光值大于0.2的洗脱液。⑧将收集的洗脱液置于透析卡中，并于0. 1MPH7.0的PBS中透析。每隔6小时换液一次，共透析24小时。⑨将透析后的抗体溶液稀释 (1 100)后，于280nm测蛋白含量。⑩将纯化的抗体分装于小管中，置于低温冰箱备用。(8)单克隆抗体的亚型鉴定采用Serotec公司的小鼠单克隆抗体免疫球蛋白分 型试剂盒分析。将纯化的单抗作适当稀释后进行检测，操作严格按试剂盒说明书进行。试验 结果为TBEA8杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体为IgG2b、κ型，具有SEQ No. 1的氨基酸序列 Ser lie His Ser Leu Leu Asp Glu Gly Lys GlnSer Leu，命名为杂交瘤细胞株 TBEA8，能 特异性识别结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶蛋白(ESAT-6)的aa 24-36 SIHSLLDEGKQSL抗 原肽序列。抗结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶蛋白(ESAT-6)的单克隆抗体杂交瘤细胞已 由中国典型培养物保藏中心保藏；地址中国武汉武汉大学；保藏日期2010年8月17日； 保藏编号为CCTCC NO :C201081o结果参见附
图1。实施例2.用该单克隆抗体进行ESAT-6的鉴定(定性)检测本发明制备的抗ESAT-6单克隆抗体可以用来鉴定的(定性检测)，鉴定方法可以 通过下述两种方法实现1.免疫印迹法 Western Blotting 重组 ESAT-6 和 ESAT-6/CFP-10 融合蛋白以及 结核分枝杆菌全蛋白裂解液用该单抗进行Western Blotting检测，在相应位置呈现目的条 带，表明检测到ESAT-6蛋白的表达。具体步骤(I)SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳方法参见F.奥斯伯等《精编分子生物学实验指南》 (科学出版社1998)。采用15%分离胶和5%浓缩胶，电泳条件为电压150V，溴酚蓝染料带 距离胶底边1. 5厘米左右终止电泳。(2)电转移方法参见F.奥斯伯等《精编分子生物学实验指南》(科学出版社 1998)。用电转移方式将其转移至PVDF (0.22 μ m)膜上。(3)免疫印迹电转膜结束后，膜在5%脱脂奶粉封闭液中室温封闭1小时后，用本 发明制备的单抗TBEA8作为一抗，室温孵育2小时或4°C反应过夜，用TBST (TBS加入0. 5% Tween-20)洗涤3次，每次lOmin。以辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG作为二抗，室温反 应2h，用上述方法洗涤后用ECL作用lmin，于全自动化学发光成像仪(Bio-Rad VersaDoc 5000MP)曝光成像。2.免疫沉淀法(IP)将重组ESAT-6和ESAT_6/CFP_10融合蛋白、结核分枝杆菌全 蛋白裂解液、结核分枝杆菌培养上清液、临床结核病人结核性胸水与该单抗进行免疫沉淀 反应，后经western-blot检测，在相应位置呈现目的条带，表明检测到ESAT-6蛋白的表达。 具体步骤①取Iug的重组蛋白或IOOug结核分枝杆菌裂解蛋白，500ul结核分枝杆菌培养上 清液或临床结核病人结核性胸水加纯化的Iug抗ESAT-6单克隆抗体TBEA8，4°C缓慢摇动2 小时；再加入20微升充分重悬的Protein G Agarose，4°C缓慢摇动过夜。②2500rpm离心5分钟，小心吸除上清，注意不能吸掉Protein G Agarose。③用0.5-1毫升TBST洗涤沉淀5次。④完成最后一次洗涤后，去除上清，加入40微升IX SDS-PAGE电泳上样缓冲液重 悬沉淀，瞬时高速离心把样品离心至管底。⑤100°C或沸水浴处理3-5分钟，取部分样品用于SDS-PAGE电泳，暂时不用的样品-20°C保存。⑥电泳结束后，将蛋白转移至PVDF膜。⑦转膜结束后，将膜置于5%脱脂奶粉封闭液，室温封闭1小时。⑧加兔抗ESAT-6多抗，室温反应2小时。⑨洗膜4次后加抗兔IgG-HRP，室温反应1小时。⑩洗膜4次后ECL显色，VersaDoc 5000全自动化学发光成像仪曝光成像。结果参见附图2，其中M:蛋白分子量Marker(15% SDS-PAGE)，1.重组ESAT-6/ CFP-10融合蛋白，2.重组ESAT-6蛋白，3.结核分枝杆菌培养上清液，4.结核性胸水，5.鸟 胞内分枝杆菌裂解蛋白，6.堪萨斯分枝杆菌裂解蛋白，7.结核分枝杆菌裂解蛋白。实施例3、用该单克隆抗体进行ESAT-6分子的定量检测本发明制备的抗ESAT-6单克隆抗体可以用来定量检测重组ESAT-6和ESAT-6/ CFP-10融合蛋白、结核分枝杆菌培养上清液、各种临床体液样本中结核特异抗原ESAT-6水 平，检测方法可以通过下述两种方法实现1.间接 ELISA 法:①将检测样本适当稀释于0. OlM pH9. 6碳酸盐缓冲液包被液中，同时将重组的 ESAT-6和ESAT-6/CFP-10融合蛋白适当系列浓度稀释在包被液中，作为定量标准品对照。 在对应的酶标板孔中加入上述各待测样本和系列浓度的标准品lOOul，室温孵育2h或4°C 包被过夜。②倒空液体并拍干残留液体，用0. OlM pH7. 4PBS-Tween 20洗液洗板三次。
③用2% BSA-0. OlM pH 7. 2 的 PBS 封闭 1 小时。④同上洗板3次。⑤加入适当稀释的抗ESAT-6单克隆抗体TBEA8，0. Iml/孔，室温反应2小时。⑥同上洗板3次后，加羊抗小鼠IgM-HRP，0. Iml/孔，室温反应1小时。⑦用洗涤液浸泡板5min后，同上洗板4次后，加入底物(TMB)室温避光反应5 10分钟。⑧2M H2S04终止反应，450nm测定其OD值。⑨绘制标准反应曲线，根据标准曲线求的待测样本中EAST-6的表达水平。2.夹心 ELISA 法①包被用包被缓冲液将单克隆抗体TBEA8稀释至1 μ g/mL。在酶标板反应孔中 加0. ImL/孔，4°C过夜。次日弃去孔内溶液，用0. OlM pH7. 4PBS-Tween 20洗涤缓冲液洗板 3次，每次3min。②封闭用2% BSA-0. OlM pH 7. 2的PBS室温封闭1小时。③加样加适当稀释的待检样品和系列浓度稀释的重组ESAT-6标准品0. ImL/孔 于上述已包被的反应孔中，置湿盒中室温反应2小时。④洗板用洗涤缓冲液洗板3次，每次3min。⑤加二抗加入适当稀释的抗ESAT-6单克隆抗体TBEF3(IgM型，针对EAST-6不同 靶位)或兔抗ESAT-6多抗，0. Iml/孔，室温反应2小时。⑥加酶联物同上洗板3次后，加羊抗小鼠IgM-HRP或抗兔IgG-HRP，0. Iml/孔，室 温反应1小时。
⑦显色同上洗板4次后，加入底物(TMB)室温避光反应5 10分钟。⑧终止、读板2M H2S04终止反应，450nm测定其OD值。⑨标准曲线及计算以标准品浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，生成标准曲线和直 线回归方程式，根据标准反应曲线求的待测样本中EAST-6的表达含量。结果参见附图3和表1。表IELISA法检测临床体液样本中ESAT-6的阳性率及其在结核诊断中的应用
权利要求
一种抗结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶蛋白的单克隆抗体TBEA8，该单克隆抗体亚型为IgG2b、κ型，能与结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶蛋白ESAT 6特异结合，由保藏号为CCTCC No.C201081的杂交瘤产生。
2.根据权利要求1所述的抗抗结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶蛋白的单克隆抗体 TBEA8的制备方法，其特征在于该单克隆抗体通过的以下步骤获得(1)小鼠免疫选择6周龄的BALB/C小鼠，以特异的抗原肽即结核分枝杆菌早期分泌 性抗原靶蛋白基因的第24-36位氨基酸，13肽SIHSLLDEGKQSL对小鼠进行免疫，每2周一 次，共3次，第四次加强免疫3天后用于融合；(2)小鼠骨髓瘤细胞的培养培养小鼠骨髓瘤细胞SP2/0并使其保持良好的生长状态 用于杂交瘤细胞融合；(3)细胞融合采用聚乙二醇细胞融合法，以BALB/C小鼠腹腔巨噬细胞作为饲养细胞， 在融合前一天，接种BALB/C小鼠腹腔巨噬细胞于96孔培养板，含20 % FCS的HAT培养基培 养一天，将步骤(1)免疫小鼠的脾脏淋巴细胞和步骤(2)中的小鼠骨髓瘤细胞混合离心，然 后以聚乙二醇介导细胞融合，稀释融合后的细胞，接种至培养板培养；(4)杂交瘤细胞的筛选将上述培养物在含HAT选择性培养基中培养，在细胞集落长到 大小合适时，吸取培养上清液以酶联免疫吸附检测法做抗体鉴定，筛选阳性克隆；(5)杂交瘤细胞的克隆化培养以有限稀释法克隆阳性的杂交瘤细胞，将稀释的细胞 接种至96孔细胞培养板，使每孔只有一个细胞生长，形成细胞集落的孔取上清做酶联免疫 吸附检测，筛选和鉴定阳性克隆，重复克隆若干次，直到杂交瘤细胞的阳性孔率达到100%， 将克隆化后的杂交瘤细胞扩大培养并做抗体理化性状分析和鉴定；(6)小鼠腹水的诱生给每只8々1^/(小鼠接种5乂106阳性杂交瘤细胞，收集腹水离心， 测定抗体效价，并纯化腹水中的单克隆抗体；(7)单克隆抗体的纯化利用ProteinG亲和纯化法纯化腹水中的单克隆抗体。
3.根据权利要求1所述的抗结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶蛋白的单克隆抗体TBEA8 在结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶蛋白检测中应用。
4.根据权利要求3所述的抗结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶蛋白的单克隆抗体TBEA8 在结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶蛋白检测中的应用，其特征是通过抗体夹酶联免疫吸 附试验、免疫印迹法和免疫沉淀的方法检测细菌培养物以及各种体液样本中结核分枝杆菌 早期分泌性抗原靶蛋白的表达。
5.根据权利要求3所述的抗结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶蛋白的单克隆抗体TBEA8 在结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶蛋白定量分析中的应用。
6.根据权利要求3所述的抗结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶蛋白的单克隆抗体TBEA8 在结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶蛋白定量分析中应用，其特征是通过酶联免疫吸附试 验的方法对在细菌培养物及体液样本中的结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶蛋白表达水平 进行定性和定量。
全文摘要
本发明提供抗结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶蛋白(ESAT-6)的单克隆抗体TBEA8。经特异的抗原肽免疫小鼠，收集致敏的小鼠B淋巴细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合，利用酶联免疫吸附试验和免疫印追检测法判定阳性克隆，建立分泌抗结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶蛋白(ESAT-6)单克隆抗体的杂交瘤细胞系TBEA8，把阳性的细胞扩增培养并注射至同品系的小鼠腹腔诱导产生含抗体的腹水，经过收集与抗体亲和纯化，获得抗结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶蛋白的单克隆抗体。本发明提供的单克隆抗体在结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶蛋白检测中应用。
文档编号C12N5/20GK101987872SQ20101050471
公开日2011年3月23日 申请日期2010年10月12日 优先权日2010年10月12日
发明者卢洪洲, 姚航平 申请人:浙江大学;上海市公共卫生临床中心