专利名称：一种丁酸梭菌sz11及其用途的制作方法
一种丁酸梭菌SZ11及其用途
技术领域：
本发明属于微生物技术领域。更具体地，本发明涉及一株丁酸梭菌双11，还涉及所述丁酸梭菌SZll的用途，还涉及一种为提高低温沼气发酵产气率而使用所述丁酸梭菌 SZll预处理发酵原料的方法。
背景技术：
沼气属于生物质能源，一般含甲烷(CH4) 60% 70%，二氧化碳(CO2) 25% 40%， H2S, N2, CO、H2等约占5 %，主要是通过细菌发酵使植物秸秆和牲畜粪便的有机物还原成气体。沼气细菌属厌氧菌，其发酵产沼气与温度有密切的关系，一般为10 60°C，当池温在 15°C以上时沼气发酵才能较好地进行，当池温低于10°C，几乎是不能产沼气。通常，低温沼气发酵不是指在冰点左右进行的沼气发酵，而是指温度小于20°C左右的沼气发酵。温度越高，有机原料的分解率就越高，沼气细菌生命活动就越旺盛，产气率高。相反地，温度越低， 有机原料的分解率就越低，沼气细菌活动就越差，产气率低，甚至长期不产气。我国北方地区冬季寒冷漫长，沼气的生产存在产气率低、使用率低、原料分解率低、沼气使用综合效益差等问题，在一定程度上限制了北方地区沼气的发展。目前大面积推广的户用沼气池几乎全部采用常温发酵(25°C左右)，没有使用任何耐低温沼气微生物促进剂，也没有增加任何的增温和保温设施，因此沼气池的产气情况受温度变化的影响很大。每年有三分之一左右的时间不能正常供气，有些池子甚至被冻坏，解决这个问题已刻不容缓。目前国内开发出的低温沼气发酵预处理菌剂多为好氧复合菌制剂，由于沼气发酵是在厌氧条件下发生的，因此，经好氧菌剂处理后的原料，在沼气发酵过程中其所含的好氧菌群的活性被抑制，难以持续发挥作用，从而影响了沼气发酵的促进效果；其次复合菌剂的生产，不仅工序烦琐，而且很难保障其组分的恒定，从而影响产品质量；再次，目前广泛应用的沼气发酵预处理菌剂多为非芽孢类活菌制剂，普遍存在保存期短、活性不稳定的缺点，给实际应用来很多困难，本发明利用从沼液中分离出来的丁酸梭菌作为生产预处理菌剂的菌株，通过发酵生产单一菌种的菌剂制品，不仅简化了生产工序，而且保证了产品质量的稳定性。另外，丁酸梭菌又称酪酸梭菌、酪酸梭状芽孢杆菌，酪酸杆菌，酪酸菌，丁酸梭状芽孢杆菌，丁酸梭菌，丁酸杆菌，丁酸菌。拉丁文Clostridium butyricum。存在于土壤、动物和人体的肠道中，细菌学分类归属于梭菌属，为革兰氏阳性厌氧杆菌。菌体中常有圆形成或椭圆形芽胞，使菌体中部膨大呈梭形。该菌在37°C、pH 7时为生长发育的最适条件，它能利用蛋白和多种糖类，如葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖和果糖等，并能利用淀粉。本菌的主要代谢产物为丁酸、乙酸，是甲烷菌的发酵底物。因此，丁酸梭菌制剂能较好地促进低温下沼气发酵原料的水解，可实现提高低温沼气发酵产气率的目的。再有，由于丁酸梭菌菌体中有芽孢生成，因此在抗恶劣环境因素、延长制剂保存期和稳定活性方面具有独特的优势。国外也有利用梭菌和甲烷菌混合产物促进沼气发酵产气率的研究报道，但该研究并没有明确其所用梭菌为丁酸梭菌。
发明内容[要解决的技术问题]本发明的目的是提供一种丁酸梭菌Onostridium butyricium) SZ11。本发明的另一个目的是提供所述丁酸梭菌SZll的用途。本发明的另一个目的是提供一种为提高低温沼气发酵产气率而使用所述丁酸梭菌双11预处理发酵原料的方法。[技术方案]本发明是通过下述技术方案实现的。本发明涉及一种丁酸梭菌(Clostridium butyricium) SZ11，它已于2011年3月 23日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏编号CGMCC No. 4703。本发明还涉及所述的丁酸梭菌SZll CGMCC No. 4703在为提高低温沼气发酵产气率而对发酵原料进行预处理中的用途。本发明还涉及一种为提高低温沼气发酵产气率而使用所述丁酸梭菌SZ11CGMCC No. 4703预处理发酵原料的方法。该方法的步骤如下(1)使用水和预发酵原料配制成一种含水量以重量百分计为60 80%的预处理混合料；(2) 丁酸梭菌SZll菌种活化制备活化培养基含有胰蛋白胨10g/L、牛肉浸膏5g/L、酵母抽提物3g/L、葡萄糖10g/L、复合盐50g/L，盐酸半胱氨酸0. 25g/L，pH 7. 0的活化培养基在温度115°C下进行灭菌15min，制备出丁酸梭菌SZll的活化培养液；所述复合盐的组成如下K2HP04lg/L、 KH2PO4O. 5g/L、CaCl2O. 2g/L、MgSO4 · 7H20 0. 4g/L、FeSO4 · 7H20 0. 05g/L, MnSO4 · H2O 0. 5g/ L；活化培养从厌氧滚管上挑取单菌落，接种到装有IOmL活化培养基的厌氧管中， 在温度37°C下深层静置培养45-5 ，制得活化菌种；(3) 丁酸梭菌SZll种子培养制备种子培养基称取5. 0重量份胰蛋白胨、5. 0重量份牛肉膏、10重量份酵母浸膏、5. 0重量份葡萄糖、0. 5重量份盐酸半胱氨酸、40重量份盐溶液，然后加入1000重量份蒸馏水溶解，用无机酸或无机碱调节其PH至7. 2-7. 5，再在温度115°C下灭菌12-18min， 得到丁酸梭菌双11种子培养基；所述的盐溶液是用1000重量份蒸馏水溶解0. 25重量份 CaCl2. 2Η20、0· 5 重量份 MgSO4. 7Η20、1 重量份 Κ2ΗΡ04、1 重量份 KH2P04、10 重量份 NaHC03、2 重量份NaCl制备的；种子培养按照丁酸梭菌种培养基体积计往其培养基中加入5%在步骤( 得到的活化菌种，在温度37°C下静置培养10-14h，制得种子液；(4) 丁酸梭菌SZll发酵培养制备发酵培养基称取40. 0重量份豆饼粉、4. 0重量份玉米浆、20. 0重量份葡萄糖、0. 75重量份盐酸半胱氨酸、40重量份盐溶液，然后加入1000重量份蒸馏水溶解，用无机酸或无机碱调节其PH至7. 2-7. 5，再在温度115°C下灭菌12-18min ；所述盐溶液是用1000 重量份蒸馏水溶解0. 25重量份CaCl2. 2H20、0. 5重量份MgSO4. 7H20、1重量份K2HP04、1重量份KH2P04、10重量份NaHC03、2重量份NaCl制备的；
发酵培养按照发酵培养基体积计，往其发酵培养基中加入5%在步骤C3)制备的丁酸梭菌SZll种子液，在温度37°C与搅拌速率IOOrmp的条件下培养45-5 ，得到含有 2. 0-3. OX IO7个丁酸梭菌SZll/ml的发酵液；(5)往步骤(1)得到的预处理混合料中加入以所述预发酵原料干重计4 8%在步骤(4)得到的丁酸梭菌SZll发酵液，然后在温度21°C 30°C下预发酵20-30小时，得到一种预发酵产物；(6)将步骤( 得到的预发酵产物加到沼气发酵池内，然后再加入以重量计为预发酵产物1 1. 5倍的沼渣或沼液，最后加入适量的水混合，使混合物的含水率控制在 90 96%之间，在温度15°C 20°C条件下进行常规沼气发酵。根据本发明的一种优选实施方式，所述预处理混合料的含水量为65 75%。根据本发明的另一种优选实施方式，在步骤C3)中用无机酸或无机碱调节其pH至 7. 0。根据本发明的另一种优选实施方式，所述的无机酸选自硫酸、磷酸、硝酸或盐酸， 所述的无机碱选自氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钠或碳酸氢钾。根据本发明的另一种优选实施方式，在步骤⑷中，在温度37°C与搅拌速率 IOOrmp的条件下培养48h。根据本发明的另一种优选实施方式，在步骤(5)中，所述的预发酵在温度 下进行M小时。根据本发明的另一种优选实施方式，在步骤(6)中，使混合物的含水率控制在 92 94%之间，在温度16°C 18°C条件下进行常规沼气发酵。根据本发明的另一种优选实施方式，所述的预发酵原料选自畜禽养殖废弃物、农作物秸秆或生活垃圾。下面将更详细地描述本发明。本发明涉及一种丁酸梭菌SZ11，它已于2011年3月23日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏编号CGMCCNo. 4703。所述的丁酸梭菌SZll具有如下特征1)菌体形态特征直或微弯的杆菌，菌株为梭状，芽孢卵圆。2)芽孢形态特征孢子卵圆，次端生。3)菌落形态特征菌落大小约1 3mm，正面为圆形，边缘整齐，侧面低凸，表面湿润光滑，乳黄色，不透明。4)生理生化特性菌株能产酸产气，能分解淀粉、密二糖，不能分解松三糖，不能使明胶液化，还原石蕊，凝固牛乳，凝块碎裂不消化。5)微生物学特征是一种革兰氏阳性厌氧内生芽胞杆菌。芽孢巨大，生成芽孢后或一端膨大成鼓锤状，或中部膨胀成纺锤状或梭状。其对人畜无毒；可抑制肠道有害菌，促进有益菌生长；能减少肠内氨、胺含量(这两种物质会损害肝功能)；产生多种维生素，如维生素K等；产生多种酶类，提高饲料利用率，促进动物生长。作为微生态制剂功效显著，并能与抗生素配伍使用。所述的丁酸梭菌SZll获得方法从北京市通州区的沼气池中取得沼液样品后，利用厌氧滚管方法筛选获得丁酸梭菌SZl 1。
本发明还涉及所述的丁酸梭菌SZlICGMCC No. 4703在为提高低温沼气发酵产气率而对发酵原料进行预处理中的用途。根据本发明，所述的低温沼气发酵应该理解是在发酵温度低于20°C的温度条件下进行的沼气发酵。根据本发明，所述发酵原料预处理应该理解是使用所述的丁酸梭菌SZ11CGMCC No. 4703发酵液预先处理能够产生沼气的原料，以便提高低温沼气发酵产气率。经过大量试验研究表明，使用丁酸梭菌SZllCGMCCNo. 4703发酵液预先处理能够使低温沼气发酵产气率提高10%以上。本发明还涉及一种为提高低温沼气发酵产气率而使用所述丁酸梭菌SZ11CGMCC No. 4703预处理发酵原料的方法。该方法的步骤如下(1)使用水和预发酵原料配制成一种含水量以重量百分计为60 80%的预处理混合料。根据本发明，所述的预发酵原料是一种或多种选自畜禽养殖废弃物、农作物秸秆或生活垃圾。畜禽养殖废弃物例如是畜禽粪便、尿液、冲洗废水、养殖过程中的废饲料、散落毛羽及畜禽生活污水。农作物秸秆主要是指稻草、麦秸、玉米秸秆、高梁秸、蔗渣等或上述几种农作物秸秆的混合物。生活垃圾是指在日常生活中或者为日常生活提供服务的活动中产生的固体废物，例如食用垃圾、环境垃圾和食品加工垃圾，像菜皮果壳、动植物尸体等。优选地，所述预处理混合料的含水量以重量百分计为65 75%。(2) 丁酸梭菌SZll菌种活化制备活化培养基含有胰蛋白胨10g/L、牛肉浸膏5g/L、酵母抽提物3g/L、葡萄糖 10g/L、复合盐50g/L，盐酸半胱氨酸0. 25g/L，pH 7. 0的活化培养基在温度115°C下进行灭菌15min，制备出丁酸梭菌双11的活化培养液。所述复合盐的组成如下=K2HPO4lg/L、KH2PO4O. 5g/L、CaCl2O. 2g/L、MgSO4 · 7H20 0. 4g/L、FeSO4 · 7H20 0. 05g/L, MnSO4 · H2O 0. 5g/L。活化培养从厌氧滚管上挑取单菌落，接种到装有IOmL活化培养基的厌氧管中， 在温度37°C下深层静置培养45-5 ，制得活化菌种。优选地，所述的丁酸梭菌SZll菌种活化是在温度37°C下深层静置培养48h。根据本发明，所述的深层静置培养应该理解是利用深层培养基的厌氧环境进行静置培养厌氧细菌，这种培养多用于兼性厌氧菌和微耗氧菌的培养。在所述活化培养时所使用的培养装置，其中包括厌氧管，都是本技术领域的技术人员熟知的培养装置，可以是恒温培养箱，像实验室用的恒温培养箱，例如上海森信实验仪器有限公司、上海人和科学仪器有限公司生产的恒温培养箱。在所述活化培养时所使用的试剂都是在目前市场上销售的产品，例如梁山科泰生物制品有限公司生产的牛肉浸膏，北京瑞尔欣德科技有限公司生产的胰蛋白胨。(3) 丁酸梭菌SZll种子培养制备种子培养基称取5. 0重量份胰蛋白胨、5. 0重量份牛肉膏、10重量份酵母浸膏、5. 0重量份葡萄糖、0. 5重量份盐酸半胱氨酸、40重量份盐溶液，然后加入1000重量份蒸馏水溶解，用无机酸或无机碱调节其PH至7. 2-7. 5，再在温度115°C下灭菌12-18min，得到丁酸梭菌双11种子培养基。
优选地，使用无机酸或无机碱调节其pH至7. 0。所述的无机酸选自硫酸、磷酸、硝酸或盐酸。优选地，所述的无机酸选自硫酸、磷酸或盐酸。更优选地，所述的无机酸选自硫酸或盐酸。所述的无机碱选自氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钠或碳酸氢钾。优选地，所述的无机碱选自氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠或碳酸氢钠。更优选地，所述的无机碱选自氢氧化钠、碳酸钠或碳酸氢钠。所述的盐溶液是用1000重量份蒸馏水溶解0. 25重量份CaCl2. 2H20、0. 5重量份 MgSO4. 7H20、1重量份K2HP04、1重量份KH2P04、10重量份NaHC03、2重量份NaCl制备的。灭菌使用的灭菌锅是一般化验室所使用的普通型号灭菌锅，例如北京华威兴业厂、北京京仪东方科技有限公司等销售的灭菌锅。种子培养按照丁酸梭菌种培养基体积计往其培养基中加入5%在步骤( 得到的活化菌种，在温度37°C下静置培养10-14h，制得种子液。优选地，在温度37°C下静置培养 12h制得种子液。在所述种子培养时所使用的培养装置都是本技术领域的技术人员熟知的通常使用的培养装置，例如可以是前面已经描述的培养箱。在所述种子培养时所使用的试剂都是在目前市场上销售的产品，例如梁山科泰生物制品有限公司生产的牛肉浸膏，北京瑞尔欣德科技有限公司生产的胰蛋白胨。(4) 丁酸梭菌SZll发酵培养制备发酵培养基称取40. 0重量份豆饼粉、4. 0重量份玉米浆、20. 0重量份葡萄糖、0. 75重量份盐酸半胱氨酸、40重量份盐溶液，然后加入1000重量份蒸馏水溶解，用无机酸或无机碱调节其PH至7. 2-7. 5，再在温度115°C下灭菌12-18min。优选地，使用无机酸或无机碱调节其pH至7. 0。所述的无机酸选自硫酸、磷酸、硝酸或盐酸。优选地，所述的无机酸选自硫酸、磷酸或盐酸。更优选地，所述的无机酸选自硫酸或盐酸。所述的无机碱选自氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钠或碳酸氢钾。优选地，所述的无机碱选自氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠或碳酸氢钠。更优选地，所述的无机碱选自氢氧化钠、碳酸钠或碳酸氢钠。灭菌使用的灭菌锅是一般化验室所使用的普通型号灭菌锅，例如北京华威兴业厂、北京京仪东方科技有限公司等销售的灭菌锅。优选地，所述的灭菌是在温度115°C下灭菌15min。所述盐溶液是用1000重量份蒸馏水溶解0. 25重量份CaCl2. 2H20、0. 5重量份 MgSO4. 7H20、1重量份K2HP04、1重量份KH2P04、10重量份NaHC03、2重量份NaCl制备的。发酵培养按照发酵培养基体积计，往其发酵培养基中加入5%在步骤C3)制备的丁酸梭菌SZll种子液，在温度37°C与搅拌速率IOOrmp的条件下培养45-5 ，得到含有 2. 0-3. OX IO7个丁酸梭菌SZll/ml的发酵液。发酵培养所使用的设备都是本技术领域的技术人员熟知的通常使用的培养装置， 例如New Brunswick Scientific公司以商品名BioFio销售的设备。优选地，所述的发酵培养是在温度37°C与搅拌速率IOOrmp的条件下培养48h。在所述发酵液中的丁酸梭菌SZll含量是采用MPN计数方法测定的。
(5)往步骤(1)得到的预处理混合料中加入以所述预发酵原料干重计4 8%在步骤(4)得到的丁酸梭菌SZll发酵液，然后在温度21°C 30°C下预发酵20-30小时，得到一种预发酵产物。优选地，步骤(1)得到的预处理混合料中加入以所述预发酵原料干重计5 6%在步骤(4)得到的丁酸梭菌SZll发酵液，所述的预发酵在温度 下进行M小时。所述的预发酵所使用的设备都是本技术领域的技术人员熟知的通常使用的培养装置，例如上海森信实验仪器有限公司以商品名恒温培养箱销售的设备。(6)将步骤( 得到的预发酵产物加到沼气发酵池内，然后再加入以重量计为预发酵产物1 1. 5倍的沼渣或沼液，最后加入适量的水混合，使混合物的含水率控制在 90 96%之间，在温度15°C 20°C条件下进行常规沼气发酵。所述的沼渣或沼液例如来自北京市通州区户用沼气池。往所述的预发酵产物中加入这种沼渣或沼液的目的在于接入沼气发酵菌群。根据本发明，所述的沼气发酵池是本技术领域的技术人员已知的任何沼气发酵池，例如像根据DB37T150-2007沼气发酵池设计规范设计的沼气发酵池。优选地，使混合物的含水率控制在92 94%之间，在温度16°C 18°C条件下进行常规沼气发酵。通过大量试验，采用平均容积产气率(m3/d.m;3)方法计算本发明方法的产气率一般可以达到0. 18m3/d. m3，而在相同条件，只是不使用本发明丁酸梭菌SZll的现有技术的沼气池产气率仅为0. 16m3/d. m3。因此，本发明方法的产气率高于现有技术的沼气池产气率 10%以上。本发明既可用于低温下固体废弃物的沼气发酵，也可用于低温下提高污水厌氧处理效率，同时本菌剂不仅不会对环境造成二次污染，而且添加菌剂并发酵后的沼渣和沼液还可做优质肥料使用。[有益效果]本发明的有益效果是目前大面积推广的户用沼气池几乎全部采用常温发酵(25°C左右)，不使用任何耐低温沼气微生物促进剂，或不增加任何的增温和保温设施，沼气池的产气情况受温度变化影响很大，每年近三分之一时间不能正常供气。本发明可以在温度15°C 20°C条件下进行常规沼气发酵，从而大大减轻沼气池产气受温度变化的影响，非常明显地提高了沼气池产气效率达10%以上。本菌剂不仅不会对环境造成二次污染，而且添加本菌剂并发酵后的沼渣和沼液还可以生产优质肥料。一种丁酸梭菌(Clostridium butyricium) SZ11，它已于 2011 年 3 月 23 日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏编号CGMCC No. 4703。
图1是加入5%予处理菌剂后沼气产气率变化曲线。图2是加入7. 5%予处理菌剂后沼气产气率变化曲线。图3是加入10%予处理菌剂后沼气产气率变化曲线。
具体实施方式实施例1 使用丁酸梭菌SZlICGMCC No. 4703对发酵原料的预处理该方法的步骤如下(1)将预发酵原料玉米秸秆粉碎成l_2mm碎料，然后用水和这种碎料配制成一种含水量以重量百分计为70%的预处理混合料。(2) 丁酸梭菌SZll菌种活化制备活化培养基含有胰蛋白胨10g/L、牛肉浸膏5g/L、酵母抽提物3g/L、葡萄糖 10g/L、复合盐50g/L，盐酸半胱氨酸0. 25g/L，pH 7. 0的活化培养基在北京京仪东方科技有限公司销售的灭菌锅中在温度115°C下进行灭菌15min，制备出丁酸梭菌SZll的活化培养液。所述复合盐的组成如下=K2HPO4lg/L、KH2PO4O. 5g/L、CaCl2O. 2g/L、MgSO4 · 7H20 0. 4g/L、FeSO4 · 7H20 0. 05g/L, MnSO4 · H2O 0. 5g/L。活化培养从厌氧滚管上挑取丁酸梭菌SZll单菌落，接种到装有IOmL所述活化培养基的厌氧管中，在温度37°C下深层静置培养48h，制得活化菌种；(3) 丁酸梭菌SZll种子培养制备种子培养基称取5. Og胰蛋白胨、5. Og牛肉膏、IOg酵母浸膏、5. Og葡萄糖、 0. 5g盐酸半胱氨酸、40g盐溶液，然后加入IOOOg蒸馏水溶解，用硫酸或氢氧化钠水溶液调节其pH至7. 0，再在温度115°C下灭菌15min，得到丁酸梭菌SZll种子培养基；所述的盐溶液是用 IOOOg 蒸馏水溶解 0. 25gCaCl2. 2Η20、0· 5gMgS04. 7H20、IgK2HPO4、IgKH2PO4、IOgNaHCO3、 2gNaCl制备的；种子培养按照丁酸梭菌种培养基体积计往其IOOOml培养基中加入50ml在步骤
(2)得到的活化菌种，在温度37°C下静置培养12h，制得种子液；(4) 丁酸梭菌SZll发酵培养制备发酵培养基称取40. Og豆饼粉、4. Og玉米浆、20. Og葡萄糖、0. 75g盐酸半胱氨酸、40g盐溶液，然后加入IOOOg蒸馏水溶解，用硫酸或氢氧化钠调节其pH至7. 3， 再在温度115 °C下灭菌16min ；所述盐溶液是用IOOOg蒸馏水溶解0. 25gCaCl2. 2H20、 0. 5gMgS04. 7H20,IgK2HPO4,IgKH2PO4,IOgNaHCO3^gNaCl 制备的；发酵培养按照发酵培养基体积计，往其IOOOml发酵培养基中加入50ml在步骤
(3)制备的丁酸梭菌SZll种子液，在温度37°C与搅拌速率IOOrmp的条件下培养48h，得到的发酵液采用MPN计数方法测定，它含有2. 6 X IO7个丁酸梭菌SZll/ml。(5)往步骤(1)得到的985g预处理混合料中加入以所述预发酵原料干重计15g在步骤(4)得到的丁酸梭菌SZll发酵液，然后在温度25°C下预发酵观小时，得到IOOOg预发酵产物；(6)将步骤( 得到的预发酵产物加到沼气发酵池内，然后再加入以重量计为预发酵产物1500g来自通州户用沼气池中的沼渣，最后加入适量的水混合，使混合物的含水率控制在94%之间，在温度18°C条件下进行常规沼气发酵。所述的沼渣是沼气发酵后的残渣，其中富含沼气发酵菌群，通常作为沼气发酵的接种物。该实施例采用平均容积产气率(m3/d. m3)方法计算产气率结果列于图1。
在同样的条件下只是不加预发酵产物实施时，采用平均容积产气率(m3/d.m3)方法计算产气率结果也列于图1。图1的数据清楚地表明，加入5%予处理菌剂发酵后，在低温18°C条件下，其沼气发酵产气率比对照样品有较明显提高，平均产气率可提高约13. %。实施例2 使用丁酸梭菌SZ11CGMCC No. 4703对发酵原料的预处理该方法的步骤如下(1)将预发酵原料玉米秸秆粉碎成l_2mm碎料，然后用水和这种碎料配制成一种含水量以重量百分计为70%的预处理混合料。(2) 丁酸梭菌SZll菌种活化制备活化培养基含有胰蛋白胨10g/L、牛肉浸膏5g/L、酵母抽提物3g/L、葡萄糖 10g/L、复合盐50g/L，盐酸半胱氨酸0. 25g/L，pH 7. 0的活化培养基在北京京仪东方科技有限公司销售的灭菌锅中在温度115°C下进行灭菌15min，制备出丁酸梭菌SZll的活化培养液。所述复合盐的组成如下=K2HPO4lg/L、KH2PO4 0. 5g/L、CaCl2O. 2g/L、MgSO4 · 7H20 0. 4g/L、FeSO4 · 7H20 0. 05g/L, MnSO4 · H2O 0. 5g/L。活化培养从厌氧滚管上挑取丁酸梭菌SZll单菌落，接种到装有IOmL所述活化培养基的厌氧管中，在温度37°C下深层静置培养48h，制得活化菌种；(3) 丁酸梭菌SZll种子培养制备种子培养基称取5. Og胰蛋白胨、5. Og牛肉膏、IOg酵母浸膏、5. Og葡萄糖、 0. 5g盐酸半胱氨酸、40g盐溶液，然后加入IOOOg蒸馏水溶解，用硫酸或氢氧化钠水溶液调节其pH至7. 0，再在温度115°C下灭菌15min，得到丁酸梭菌SZll种子培养基；所述的盐溶液是用 IOOOg 蒸馏水溶解 0. 25gCaCl2. 2Η20、0· 5gMgS04. 7H20、IgK2HPO4、IgKH2PO4、IOgNaHCO3、 2gNaCl制备的；种子培养按照丁酸梭菌种培养基体积计往其IOOOml培养基中加入50ml在步骤
(2)得到的活化菌种，在温度37°C下静置培养12h，制得种子液；(4) 丁酸梭菌SZll发酵培养制备发酵培养基称取40. Og豆饼粉、4. Og玉米浆、20. Og葡萄糖、0. 75g盐酸半胱氨酸、40g盐溶液，然后加入IOOOg蒸馏水溶解，用硫酸或氢氧化钠调节其PH至7. 3，再在温度115 °C下灭菌16min ；所述盐溶液是用IOOOg蒸馏水溶解 0. 25gCaCl2. 2Η20、0· 5gMgS04. 7H20、IgK2HPO4、IgKH2PO4、IOgNaHCO3、2gNaCl 制备的；发酵培养按照发酵培养基体积计，往其IOOOml发酵培养基中加入50ml在步骤
(3)制备的丁酸梭菌SZll种子液，在温度37°C与搅拌速率IOOrmp的条件下培养48h，得到的发酵液采用MPN计数方法测定，它含有2. 6 X IO7个丁酸梭菌SZll/ml。(5)往步骤(1)得到的977. 5g预处理混合料中加入以所述预发酵原料干重计 22. 5g在步骤(4)得到的丁酸梭菌SZll发酵液，然后在温度25°C下预发酵观小时，得到 IOOOg预发酵产物；(6)将步骤( 得到的预发酵产物加到沼气发酵池内，然后再加入以重量计为预发酵产物1500g来自通州户用沼气池中的沼渣，最后加入适量的水混合，使混合物的含水率控制在94%之间，在温度18°C条件下进行常规沼气发酵。
所述的沼渣是沼气发酵后的残渣，其中富含沼气发酵菌群，通常作为沼气发酵的接种物。该实施例采用平均容积产气率(m3/d. m3)方法计算产气率结果列于图2。在同样的条件下只是不加预发酵产物实施时，采用平均容积产气率(m3/d.m3)方法计算产气率结果也列于图2。图2的数据清楚地表明，加入7. 5%予处理菌剂发酵后，在低温18°C条件下，其沼气发酵产气率比对照样品有较明显提高，平均产气率可提高约13. 2%。实施例3 使用丁酸梭菌SZlICGMCC No. 4703对发酵原料的预处理该方法的步骤如下(1)将预发酵原料玉米秸秆粉碎成l_2mm碎料，然后用水和这种碎料配制成一种含水量以重量百分计为80%的预处理混合料。(2) 丁酸梭菌SZll菌种活化制备活化培养基含有胰蛋白胨10g/L、牛肉浸膏5g/L、酵母抽提物3g/L、葡萄糖 10g/L、复合盐50g/L，盐酸半胱氨酸0. 25g/L，pH 7. 0的活化培养基在北京京仪东方科技有限公司销售的灭菌锅中在温度115°C下进行灭菌15min，制备出丁酸梭菌SZll的活化培养液。所述复合盐的组成如下=K2HPO4lg/L、KH2PO4O. 5g/L、CaCl2O. 2g/L、MgSO4 · 7H20 0. 4g/L、FeSO4 · 7H20 0. 05g/L, MnSO4 · H2O 0. 5g/L。活化培养从厌氧滚管上挑取丁酸梭菌SZll单菌落，接种到装有IOmL所述活化培养基的厌氧管中，在温度37°C下深层静置培养48h，制得活化菌种；(3) 丁酸梭菌SZll种子培养制备种子培养基称取5. Og胰蛋白胨、5. Og牛肉膏、IOg酵母浸膏、5. Og葡萄糖、 0. 5g盐酸半胱氨酸、40g盐溶液，然后加入IOOOg蒸馏水溶解，用硫酸或氢氧化钠水溶液调节其pH至7. 0，再在温度115°C下灭菌15min，得到丁酸梭菌SZll种子培养基；所述的盐溶液是用 IOOOg 蒸馏水溶解 0. 25gCaCl2. 2Η20、0· 5gMgS04. 7H20、IgK2HPO4、IgKH2PO4、IOgNaHCO3、 2gNaCl制备的；种子培养按照丁酸梭菌种培养基体积计往其IOOOml培养基中加入50ml在步骤
(2)得到的活化菌种，在温度37°C下静置培养12h，制得种子液；(4) 丁酸梭菌SZll发酵培养制备发酵培养基称取40. Og豆饼粉、4. Og玉米浆、20. Og葡萄糖、0. 75g盐酸半胱氨酸、40g盐溶液，然后加入IOOOg蒸馏水溶解，用硫酸或氢氧化钠调节其pH至7. 3， 再在温度115 °C下灭菌16min ；所述盐溶液是用IOOOg蒸馏水溶解0. 25gCaCl2. 2H20、 0. 5gMgS04. 7H20,IgK2HPO4,IgKH2PO4,IOgNaHCO3^gNaCl 制备的；发酵培养按照发酵培养基体积计，往其IOOOml发酵培养基中加入50ml在步骤
(3)制备的丁酸梭菌SZll种子液，在温度37°C与搅拌速率IOOrmp的条件下培养48h，得到的发酵液采用MPN计数方法测定，它含有2. 6 X IO7个丁酸梭菌SZll/ml。(5)往步骤(1)得到的980g预处理混合料中加入以所述预发酵原料干重计20g在步骤(4)得到的丁酸梭菌SZll发酵液，然后在温度25°C下预发酵观小时，得到IOOOg预发酵产物；
(6)将步骤( 得到的预发酵产物加到沼气发酵池内，然后再加入以重量计为预发酵产物1500g来自通州户用沼气池中的沼渣，最后加入适量的水混合，使混合物的含水率控制在96%之间，在温度15°C条件下进行常规沼气发酵。所述的沼渣是沼气发酵后的残渣，其中富含沼气发酵菌群，通常作为沼气发酵的接种物。该实施例采用平均容积产气率(m3/d. m3)方法计算产气率结果列于图3。在同样的条件下只是不加预发酵产物实施时，采用平均容积产气率(m3/d.m3)方法计算产气率结果也列于图3。图3的数据清楚地表明，加入10%予处理菌剂发酵后，在低温15°C条件下，其沼气发酵产气率比对照样品有较明显提高，平均产气率可提高约13. 6%。
权利要求
1.一种丁酸梭菌(Clostridium butyricium) SZ11，它已于2011年3月23日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏编号CGMCC No. 4703。
2.根据权利要求1所述的丁酸梭菌SZlICGMCCNo. 4703在为提高低温沼气发酵产气率而对发酵原料进行预处理中的用途。
3.一种为提高低温沼气发酵产气率而使用所述丁酸梭菌SZllCGMCCNo. 4703预处理发酵原料的方法，其特征在于该方法的步骤如下(1)使用水和预发酵原料配制成一种含水量以重量百分计为60 80%的预处理混合料；(2)丁酸梭菌SZll菌种活化制备活化培养基含有胰蛋白胨10g/L、牛肉浸膏5g/L、酵母抽提物3g/L、葡萄糖 10g/L、复合盐50g/L，盐酸半胱氨酸0.25g/L，pH 7. 0的活化培养基在温度115°C下进行灭菌15min，制备出丁酸梭菌SZll的活化培养液；所述复合盐的组成如下=K2HPO4 lg/L、 KH2PO4O. 5g/L、CaCl2O. 2g/L、MgSO4 · 7H20 0. 4g/L、FeSO4 · 7H20 0. 05g/L, MnSO4 · H2O 0. 5g/ L；活化培养从厌氧滚管上挑取单菌落，接种到装有IOmL活化培养基的厌氧管中，在温度37°C下深层静置培养45-5 ，制得活化菌种；(3)丁酸梭菌SZll种子培养制备种子培养基称取5. 0重量份胰蛋白胨、5. 0重量份牛肉膏、10重量份酵母浸膏、 5. 0重量份葡萄糖、0. 5重量份盐酸半胱氨酸、40重量份盐溶液，然后加入1000重量份蒸馏水溶解，用无机酸或无机碱调节其PH至7. 2-7. 5，再在温度115°C下灭菌12-18min，得到丁酸梭菌双11种子培养基；所述的盐溶液是用1000重量份蒸馏水溶解0. 25重量份 CaCl2. 2Η20、0· 5 重量份 MgSO4. 7Η20、1 重量份 Κ2ΗΡ04、1 重量份 KH2P04、10 重量份 NaHC03、2 重量份NaCl制备的；种子培养按照丁酸梭菌种培养基体积计往其培养基中加入5%在步骤( 得到的活化菌种，在温度37°C下静置培养10_14h，制得种子液；(4)丁酸梭菌SZll发酵培养制备发酵培养基称取40. 0重量份豆饼粉、4. 0重量份玉米浆、20. 0重量份葡萄糖、 0. 75重量份盐酸半胱氨酸、40重量份盐溶液，然后加入1000重量份蒸馏水溶解，用无机酸或无机碱调节其PH至7. 2-7. 5，再在温度115°C下灭菌12-18min ；所述盐溶液是用1000重量份蒸馏水溶解0. 25重量份CaCl2. 2H20、0. 5重量份MgSO4. 7H20、1重量份K2HP04、1重量份 KH2PO4UO重量份NaHC03、2重量份NaCl制备的；发酵培养按照发酵培养基体积计，往其发酵培养基中加入5%在步骤C3)制备的丁酸梭菌SZll种子液，在温度37°C与搅拌速率IOOrmp的条件下培养45-5 ，得到含有 2. 0-3. OX IO7个丁酸梭菌SZll/ml的发酵液；(5)往步骤(1)得到的预处理混合料中加入以所述预发酵原料干重计4 8%在步骤 (4)得到的丁酸梭菌SZll发酵液，然后在温度21°C 30°C下预发酵20-30小时，得到一种预发酵产物；(6)将步骤( 得到的预发酵产物加到沼气发酵池内，然后再加入以重量计为预发酵产物1 1. 5倍的沼渣或沼液，最后加入适量的水混合，使混合物的含水率控制在90 96%之间，在温度15°C 20°C条件下进行常规沼气发酵。
4.根据权利要求3所述的方法方法，其特征在于所述预处理混合料的含水量以重量百分计为65 75%。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于在步骤C3)中用无机酸或无机碱调节其pH 至 7. 0。
6.根据权利要求3或5所述的方法，其特征在于所述的无机酸选自硫酸、磷酸、硝酸或盐酸，所述的无机碱选自氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钠或碳酸氢钾。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于在步骤中，在温度37°C与搅拌速率 IOOrmp的条件下培养48h。
8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于在步骤(5)中，所述的预发酵在温度 下进行24小时。。
9.根据权利要求3所述的方法，其特征在于在步骤(6)中，使混合物的含水率控制在 92 94%之间，在温度16°C 18°C条件下进行常规沼气发酵。
10.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述的预发酵原料选自畜禽养殖废弃物、 农作物秸秆或生活垃圾。
全文摘要
本发明涉及一株丁酸梭菌SZ11及其用途，还涉及一种为提高低温沼气发酵产气率而使用所述丁酸梭菌SZ11预处理发酵原料的方法，该方法包括原料预处理、丁酸梭菌SZ11菌种活化、种子培养、发酵培养、预发酵和常规发酵等步骤。本发明可以在温度15℃～20℃条件下进行常规沼气发酵，从而大大减轻沼气池产气受温度变化的影响，非常明显地提高了沼气池产气效率达10％以上。本菌剂不仅不会对环境造成二次污染，而且添加本菌剂并发酵后的沼渣和沼液还可以生产优质肥料。
文档编号C12P5/02GK102226158SQ20111011825
公开日2011年10月26日 申请日期2011年5月9日 优先权日2011年5月9日
发明者仇天雷, 孙晓红, 李焕, 王敏, 王旭明, 郑希传, 韩梅琳 申请人:北京农业生物技术研究中心