专利名称：一种内皮细胞生长因子融合蛋白及其在再生医学中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域，涉及利用基因重组技术制备一种内皮细胞生长因子(VEGF)与免疫球蛋白Fc (Fe)的融合蛋白(VEGF-Fc)，该融合蛋白可作为基质化内皮细胞生长因子用于组织工程、再生医学相关的细胞大批量扩增及内皮/血管诱导修复等应用研究。
背景技术：
材料的抗凝血及血管化问题一直是组织工程和再生医学研究中所面临的瓶颈之一，尤其是对于尺寸超过200 μ m的再生组织，血管化的不足会导致细胞氧气及营养物质的供应不足进而导致组织内部细胞凋亡1。为了解决这一问题，有专家提出一方面可以在体外移植血管，另一方面可以设计出一种新型生物材料在体内诱导血管再生2。然而，血管内皮细胞的粘附、增殖和生存能力是实现组织血管再生的重要因素。研究表明，细胞外基质可有效调控细胞行为，如细胞的粘附、增殖、迁移、细胞形貌和细胞间的分化。因此，我们通过研究制备可溶性生物信号分子的细胞外基质化，为血管内皮细胞的粘附、生长和增殖构建良好的细胞外微环境。人工细胞外基质通过模拟天然细胞外基质的结构和特性，影响细胞生存和生物学功能。人工细胞外基质来源主要分为三类天然生物大分子(如胶原、海藻酸、透明质酸等)、 化学合成聚合物(如PLA、PGA、PLGA、PEG等)以及近年发展起来的基因重组型细胞外基质 (如基质蛋白结构依赖型融合蛋白、生长因子型融合蛋白和钙粘素依赖型融合蛋白)。其中， 天然生物大分子以其良好的生物相容性和生物降解性而广泛用于组织工程领域。然而，这种细胞外基质具有机械性能差，使用过程中不稳定的缺点。化学合成聚合物虽然机械性能强，但其生物相容性差，易弓I起免疫应答反应。与前两种人工细胞外基质相比，基因重组蛋白型细胞外基质不仅可特异性增强靶细胞与细胞外基质的相互作用，而且可用于构建一种安全、可控的细胞外微环境达到调控细胞的黏附、增殖、迁移等细胞生物学行为的目的。组织工程研究中，VEGF作为促进血管新生的有效特异性活性信号分子，已被广泛应用于促进新血管的生成3，4。有报道指出，VEGF通过与细胞外受体KDR结合而激活细胞内信号通路，进一步影响内皮细胞的粘附、增殖及其功能表达。近年来，已报道了多种固定、缓慢释放VEGF以提高其生物学活性的生物材料相关技术。例如①利用材料的肝素化通过生物亲和域物理固定并缓释VEGF，该方法虽可一定程度上避免VEGF的生物降解，提高 VEGF的生物活性，促进内皮细胞的增殖，但这种物理修饰的方法不能定量调控VEGF的固定及其释放行为1，5；②利用化学键合交联法固定生长因子，其结果均显示出该方法虽能部分改善VEGF持久促进内皮细胞增殖及血管再生的性能，但在化学反应过程中会有部分生长因子的固有生物学活性丧失6，7;③利用可注射水凝胶包埋而达到生长因子持续释放的目的，进而起到诱导人血管内皮细胞形成毛细血管的作用。但利用这种方法，生长因子仍然以可溶性状态存在且其半衰期仅为4小时，VEGF的生物活性仍有待提高。
发明内容
本发明目的是克服现有技术存在的上述不足，针对改善内皮细胞生长微环境的研究，利用基因重组技术，提供一种可基质化的内皮细胞生长因子融合蛋白(即VEGF-Fc融合蛋白)并开发其在再生医学中的应用。本发明旨在提供含有目的基因(VEGF、Fe)的真核细胞蛋白表达基因质粒，如 pcDNA3. I-VEGF-Fc,以及由所述的基因质粒制得的VEGF-Fc融合蛋白。该融合蛋白不仅提高了生长因子的稳定性，并可作为一种可基质化内皮细胞生长因子提高组织工程、再生医学相关生物材料的内皮细胞特异亲和性，改善材料快速诱导内皮/血管修复等功能。本发明提供的含有目的基因(VEGF、Fe)的真核细胞表达基因质粒，是采用基因重组PCR技术扩增目的基因VEGF和Fc序列，并分别通过双酶切连接并嵌入真核细胞表达基因质粒载体(如PCDNA3. 1)中，得到含有双功能目的基因(VEGF-Fc)片段的真核细胞表达基因质粒。本发明还提供了一种可基质化应用的内皮细胞生长因子融合蛋白(VEGF-FC)，由所述的基因质粒经真核细胞基因转染、表达及蛋白A亲和层析色谱柱分离纯化而制得。本发明还提供了一种上述VEGF-Fc融合蛋白做为细胞外基质固定化的内皮细胞生长因子的应用，其通过物理包埋或(/及)疏水作用用于材料本体或(/及)材料表面修饰， 提高材料的亲水性，改善材料的生物相容性。其使用浓度范围为lOng/ml-lOOOng/ml。其中，上述VEGF-Fc融合蛋白通过Fc可在疏水材料表面自组装分子层的作用，将 VEGF-Fc融合蛋白有序固定于疏水材料表面，实现VEGF的基质化固定，提高材料的内皮细胞特异亲和性，促进内皮细胞的黏附、增殖；并可用于普通细胞培养皿表面修饰及大批量扩增VEGF受体阳性表达的内皮细胞。其具体方案如下
(1)将纯化后的VEGF-Fc融合蛋白用PBS稀释至lOng/ml-lOOOng/ml，浸泡疏水性生物材料(如聚苯乙烯培养板)；
(2)在4°C至 37°C，孵育 0. 5-24h.
(3)弃上清，用PBS淋洗1-3遍，除去未稳定固定的融合蛋白VEGF-Fc ；
(4)在疏水性生物材料表面使融合蛋白VEGF-Fc基质化进行内皮细胞培养。通过细胞表面VEGF受体的介导，促进VEGF受体阳性表达细胞与基质化VEGF-Fc 融合蛋白的特异性粘附，改善生物材料的细胞特异亲和性，提高其细胞的增殖及分化功能的表达。并可用于促进诱导干细胞向内皮细胞定向分化、快速诱导材料表面内皮化，改善材料的抗凝血性能、提高材料诱导血管新生的能力。
本发明的优点和积极效果
一，本发明利用基因工程原理和技术手段，将内皮细胞生长因子与免疫球蛋白Fc段融合，制备了具有VEGF和Fc双功能的融合蛋白。二，本发明通过免疫球蛋白Fc片段使VEGF以有活性的二聚体形式存在，一方面提高VEGF的稳定性，另一方面利用Fc段与蛋白质A特异性结合利于融合蛋白的后期纯化。三，本发明的融合蛋白通过Fc的可通过疏水作用自组装形成单分子层，实现疏水材料表面固定修饰，在材料表面形成一种基质化内皮细胞生长因子，提高材料的亲水性，改善材料的生物相容性，加强了内皮细胞与材料的特异性相互作用。四，本发明的VEGF-Fc融合蛋白通过基质化固定可以有效的促进内皮细胞的粘附、增殖和分化功能表达，不仅可促进材料的快速内皮化，提高材料抗凝血性能，同时还可促进实现组织工程、再生医学相关种子细胞的批量扩增。五，本发明的VEGF-Fc融合蛋白提高内皮细胞生长因子的活性，并通过基质化固定可促进干细胞向内皮细胞的定向诱导分化，改善材料的血管新生诱导能力。
图1是重组质粒构建示意图2是重组质粒鉴定。①DNA分子标记；②质粒载体PCDNA3. I-Fc (6112bp);③重组质粒 pcDNA3. I-VEGF-Fc 经 BamHI 和 NotI 双酶切(573bp，6112bp)； 图3是纯化融合蛋白鉴定；
图4是VEGF-Fc融合蛋白基质化用于细胞培养示意图； 图5是VEGF-Fc融合蛋白基质化对内皮细胞粘附的影响；
图6是VEGF-Fc融合蛋白基质化对内皮细胞增殖的影响。A 培养液中添加VEGF-Fc融合蛋白促进血管内皮细胞增殖；B =VEGF-Fc融合蛋白基质化固定改善其促进内皮细胞增殖的生物活性；
图7是VEGF-Fc融合蛋白基质化对血管内皮细胞形态的影响(A:聚赖氨酸铺板；B 聚赖氨酸铺板培养液中添加生长因子VEGF ；C 聚赖氨酸铺板培养液中添加VEGF-Fc融合蛋白；D =VEGF-Fc融合蛋白基质化固定铺板；a’，b’，C’和d’分别是a，b, c和d图中方框处放大图)；
具体实施方式
实施例1
本发明研究的基本策略是利用基因重组技术将人血管内皮生长因子和免疫球蛋白Fc 段进行融合，得到含有目的基因(VEGF、Fe)的质粒pcDNA3. I-VEGF-Fc0以pET28A-VEGF质粒为模板，利用合成的引物特异性扩增VEGF基因。1%的琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，将胶回收PCR产物经BamHl V和AfoiI双酶切后，插入pcDNA3. 1 BamHl V和NotY位点之间(图1)。重组表达质粒经BamHI和NotI双酶切电泳鉴定，显示切出与目的基因大小一致的DNA片段(573bp)，将此质粒载体命名为pcDNA3. I-VEGF-Fc (图 2)。实施例2
将实例1构建的含有目的基因的质粒pcDNA3. I-VEGF-Fc转染293F细胞，收集细胞上清液，利用rProtein A FF柱对VEGF - Fc融合蛋白进行纯化。纯化的融合蛋白利用抗VEGF 抗体通过免疫印迹检测，图中没有其他非特异性曝光条带出现，只有一条与预计分子量大小(46KD)相似的条带。此结果说明，本发明制备得到了 VEGF-Fc融合蛋白(图3)。将得到的融合蛋白修饰疏水材料表面形成一种内皮细胞生长因子融合蛋白基质用于内皮细胞培养，如示意图(图4)所示。
实施例3本发明通过MTT法检测在不同修饰的聚苯乙烯培养皿表面内皮细胞的黏附情况，进而考察VEGF-Fc融合蛋白基质对内皮细胞粘附的影响。以聚苯乙烯培养板粘附细胞为100%，接近81. 25%的细胞能黏附到VEGF-Fc融合蛋白基质化表面修饰的培养板上；而只有17. 5%的细胞黏附到涂有IgG的培养板上。结果表明VEGF-Fc融合蛋白基质化，其可通过VEGF受体介导显著提高血管内皮细胞的粘附(图 5)。 实施例4
本发明中通过细胞增殖实验进一步表明与溶液中添加VEGF相比，溶液中添加 VEGF-Fc融合蛋白可有效促进内皮细胞的增殖且随培养时间的延长VEGF-Fc融合蛋白可以更好的维持细胞增殖活性(图6)。我们可以得出结论=VEGF-Fc融合蛋白可有效延长VEGF 在体外的生物活性，VEGF-Fc融合蛋白基质化可以持久地促进内皮细胞增殖。实施例5
本发明中利用免疫荧光染色技术进一步评价了 VEGF-Fc融合蛋白基质化对内皮细胞生长形态的影响(图7)。比较内皮细胞分别培养于聚赖氨酸修饰培养板、聚赖氨酸修饰培养板并于培养基中分别添加VEGF、VEGF-Fc融合蛋白，以及VEGF-Fc融合蛋白修饰培养板形成的VEGF-Fc融合蛋白基质化表面，其结果表明黏附于VEGF-Fc融合蛋白基质化表面的内皮细胞表达更多的肌动蛋白纤维且在观察时间范围内(48h)细胞形态稳定，细胞骨架紧密排列，形成类似血管内皮层紧密排列的结构；而黏附于聚赖氨酸修饰且培养基中添加VEGF的内皮细胞，在培养早期细胞伸展良好且出现胞间连丝，但在培养48小时之后，这些细胞的胞间连丝消失。
参考文献
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权利要求
1.一种表达血管内皮细胞生长因子(VEGF)和免疫球蛋白Fc (Fe)融合蛋白的基因质粒，即利用基因工程手段将VEGF和Fc结构域基因重组构建真核细胞表达VEGF和Fc双功能融合蛋白的基因质粒。
2.—种VEGF-Fc融合蛋白，由权利要求1所述的基因质粒经真核细胞基因转染、表达及分离纯化而制得。
3.—种权利要求2所述的VEGF-Fc融合蛋白的应用，用于材料本体或材料表面修饰，提高材料的亲水性，改善材料的生物相容性。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于用于提高材料的内皮细胞特异亲和性，促进内皮细胞的黏附、增殖及批量扩增。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于用于促进诱导干细胞向内皮细胞定向分化、快速诱导材料表面内皮化，改善材料的抗凝血性能、提高材料诱导血管新生能力。
全文摘要
本发明利用基因重组技术构建了一种内皮细胞生长因子VEGF与免疫球蛋白G的Fc结构域的融合蛋白(VEGF-Fc)。该融合蛋白一方面可以更好地维持VEGF的生物活性，延长其半衰期，另一方面将其通过疏水作用固定于二、三维生物材料的本体或其表面，改善材料的生物相容性及其与内皮细胞的特异亲和性，促进内皮细胞的黏附、增殖及诱导干细胞向内皮细胞定向分化，提高材料抗凝血及诱导血管新生的生物活性。
文档编号C12N5/071GK102260702SQ20111020253
公开日2011年11月30日 申请日期2011年7月20日 优先权日2011年7月20日 公开号201110202533.发明者于美华, 杜凤移, 杨军 申请人:南开大学