专利名称：基因多态检测方法及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，应用于生物科学研究和临床分子诊断，具体涉及一种基因多态检测方法及试剂盒。
背景技术：
基因多态性是指基因的碱基序列变化，比如一个碱基的插入、缺少或替换，一段 DNA片段的插入、缺少、颠倒、重复等。单核苷酸多态性SNP是现在公认的第三代遗传标记， HAPMAP等生物信息数据库显示和预测人类基因组序列中每300个碱基序列中有一个SNP， 单个核苷酸的变化如插入、缺失或替换可能会改变目标基因的正常功能从而导致相关疾病发生或相关表型的变化，因此基因多态性尤其是SNP的快速而准确的检测将有助于相关疾病的临床分子诊断或相关基因的科学研究。从检测基因位点数目上，基因位点的具体检测方法可以分为三大类，一是全基因组水平上的高密度SNP高通量检测，二是对目标区域多个基因的SNP进行中通量的检测。第三类是少量或者单个基因的少量SNP位点的低通量检测。前者包括SNPkan、全基因组SNP 芯片杂交等技术对成千上万甚至几百万个SNP位点进行检测(Sun M et al. ,2009 ；HUGO Pan-Asian SNP Consortium et al. ,2009 Jian-ffen Han et al.，2009)，这些技术主要研究基因组的代谢通路及基因家族相关的SNP全扫，用于发现有意义的新功能基因位点，但普遍存在检测周期长以及检测成本昂贵等缺点；中通量的SNP检测主要针对有限目标区段多个基因中几十个甚至几百个SNP的检测，包括微小测序技术、高温连接酶检测技术(LDR) (zhao zhang, et al，2009)、多重连接依赖探针扩增(MLPA) (Schouten et al.，2002)以及 MassArray SNP检测技术(kquenom Inc. , San Diego, CA)；低通量的SNP检测主要是针对感兴趣的几个目的基因的少量几个关键的SNP进行检测，包括直接测序SNP分型技术、 taqMan探针、限制性内切酶反应(RFLP)、高分辨率融解曲线反应(HRM)。但是，现有的低通量SNP分型技术都有其局限性，比如直接测序SNP分型技术，准确性高，如果检测的几个SNP位点正好在一个测序单元内(长度小于600bp)，则检测方案相对可行，如果检测位点位置相差较远则其检测成本太高。TaqMan技术主要是基于特异性荧光探针，目的基因的检测序列与探针完全配对，则探针上的荧光基团淬灭发出相应的荧光信号，根据收集到的不同荧光信号确定基因的SNP类型，其每次实验只能检测一个基因位点，而且荧光信号成本昂贵。RFLP是基于将目的基因位点的特异性序列，采用限制性内切酶酶切，酶切产物跑琼脂糖胶电泳来区分不同长度片段，从而确定基因位点的单倍型。此方法每次实验也只能检测少量几个位点，而且跑琼脂糖胶电泳很难区分长度相近的酶切片段，并且电泳出来的胶图不精确，更重要的是有时候限制性内切酶的酶切效果不佳，难以区分酶能切动的纯合子和杂合子两种单倍型。高分辨率融解曲线反应(HRM)基于DNA不同碱基序列其融解温度不同，经过每0. 1 °C的升高，不同碱基序列的DNA双链在不同的温度下解链，在每个DNA扩增产物中嵌入荧光信号，收集解链时释放的荧光信号来确定基因的单倍型。HRM的缺点也在于每次反应只能检测一个样本的一个基因位点，而且通过融解曲线来判定基因型的准确度随温度梯度的分辨高低差异比较大。
发明内容
本发明要解决目前SNP分型方法精确度差、效率低、成本贵的技术问题，提供一种基因多态检测方法，该方法可以在一个反应体系中快速、准确地同时检测多个样本的多个目标基因的遗传多态性。此外，还需要提供一种基因多态检测试剂盒。为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现在本发明的一个方面，提供了一种基因多态检测方法，包括以下步骤针对一个或多个目标基因设计多重PCR引物，每个目标基因包含限制性内切酶序列，每对引物中的一条具有信号标记；针对每个目标基因包含的限制性内切酶序列，设计内对照DNA片段，该内对照DNA 片段包含所述目标基因的限制性内切酶序列；用所述PCR引物对待测样本进行多重PCR扩增；将待测样本的PCR扩增产物和内对照DNA片段混勻，用所述限制性内切酶序列对应的限制性内切酶进行酶切；酶切产物经变性后，通过毛细管电泳将不同长度的片段分开，收集每个条带的位置信息以及信号强度；计算样本每个目标基因片段酶切前后的峰高或面积比、以及内对照DNA片段的酶切前后的峰高或面积比，将每个目标基因片段酶切前后的峰高或面积比值分别参照内对照 DNA片段酶切前后的峰高或面积比值，获得待测样本目标基因片段的遗传多态性。所述多重PCR引物中，各信号标记引物具有相同或不同的信号标记；相同信号标记的引物对应的扩增产物长度有至少Ibp的差别。所述信号标记包括荧光标记。所述内对照DNA片段通过化学合成或PCR扩增制得。在本发明的另一方面，还提供了一种基因多态检测试剂盒，主要包括有(A)针对一个或多个目标基因设计的多重PCR引物，每个目标基因包含限制性内切酶序列，每对引物中的一条具有信号标记；(B)针对每个目标基因包含的限制性内切酶序列设计的内对照DNA片段，该内对照DNA片段包含所述目标基因的限制性内切酶序列； (C)所述限制性内切酶序列对应的限制性内切酶。本发明是在认真总结现有各种低通量SNP检测技术的优缺点的基础上再经过自主创新后开发成功，它综合了多重PCR、毛细管电泳精确分析DNA片段特征、混合不同样本相同基因位点PCR扩增不同长度片段一起酶切，以及引入限制性内切酶特异序列的内对照 DNA片段来精确判断限制性内切酶的酶切效果，是一种简单快速、低成本、高精确的SNP检测方法，在未来临床疾病致病基因研究以及临床基因检测领域将会有广泛的应用前景。本发明基因多态检测方法，主要具有以下优点1、多个样本多个基因位点同时检测由于相同的基因位点扩增不同的DNA片段， 混合均勻后一起酶切、毛细管电泳。一次酶切通常可以同时混合2-50个样本的PCR扩增产物；由于采用了多重PCR体系，一个PCR扩增反应通常可以同时扩增1-50个位点，也就意味着如果选用4个以上的基因位点，每个基因位点设计4个不同扩增长度，那么意味着一次反应可以同时检测16个以上目标基因位点；2、高精确性由于酶切底物中加入含有限制性内切酶的特异酶切位点的内对照 DNA片段，解决了有些限制性内切酶酶切不完全的情况；3、操作简单只要将样本DNA进行多重PCR，之后将不同样本PCR产物混勻特异性酶切后直接跑毛细管电泳仪(如ABI测序仪)即可，整个实验过程仅需要一步PCR循环、一步酶切和一步毛细管电泳。
下面结合附图和具体实施方式
对本发明作进一步详细的说明。图1是本发明同时检测一个遗传多态位点在多个样本中基因分型原理图；图2是本发明同时检测一个样本中多个遗传多态位点基因分型原理图；图3是本发明同时检测多个遗传多态位点在多个样本基因分型原理图；图4是本发明实施例1检测四个样本同一个基因多态位点的毛细管电泳图；图5是本发明实施例2三个样本中四个基因多态位点同时检测结果图。
具体实施例方式本发明的基因多态检测方法是基于限制性酶切RFLP原理并结合多重荧光PCR扩增以及毛细管电泳长度差异片段分离技术对一个或多个样本的一个或多个目标基因同时进行检测，并利用参照酶切序列对检测结果进行校正后获取目标基因的正确遗传多态性的检测方法，其主要检测过程如下(检测原理图参见图1-3)1)针对一个或多个目标基因以及参照酶切序列进行多重PCR引物设计，每对引物中的一条标上信号标记，该信号标记通常采用荧光标记，多重PCR引物中各荧光标记引物具有相同或不同的荧光，同种荧光引物对应的扩增产物长度必须有至少Ibp以上的差别。2)针对每种限制性内切酶的特异序列，设计内对照DNA片段，该内对照DNA片段包含目标基因的限制性内切酶序列，并通过化学合成或PCR扩增的方式制备该内对照DNA片段。3)用上述设计的引物对待测样本进行多重荧光PCR扩增。4)将不同样本的PCR扩增产物和内对照DNA片段混勻，在限制性内切酶的最适条件下酶切。5)酶切产物通过变性、毛细管电泳将不同长度的片段分开，收集每个条带的位置信息以及荧光强度，这一步通常在测序仪上完成如美国应用生物公司的测序仪ABI3130以及 ABI3730 等。6)由于不同基因的扩增产物在长度以及荧光标记上不同，而且同一基因位点上样本DNA以及内对照DNA扩增产物长度也不同，因此根据毛细管电泳峰形图可以明确每个基因位点上样本DNA以及内对照DNA各自酶切效果。由于内对照DNA片段含有样本DNA在每个目标基因位点上限制性内切酶的特异序列，因此样本DNA目标基因的酶切效率可以通过内对照DNA的酶切效率对比估算。分别计算样本DNA每个目标基因片段的酶切前后的峰高或面积比(U/C1)与内对照DNA片段的酶切前后的峰高或面积比(U/C2)。7)将每个目标基因片段酶切前后的U/C1比值分别參照内对照DNA片段的U/C2比 值，然后确定目标基因片段的遗传多态性。8)如果检测的目标基因片段酶切效率高，限制性内切酶酶切完全，可获取更准确 的結果。实施例1利用本发明方法对ー个基因多态位点多个样本同时检测G蛋白0 3亚 单位基因C825T(chrl2 rs5443)基因分型。检测样本4个样本分折rs5443SNP位点前后500bp的序列特征，设定其限制性内切酶为 BseDKfermentas公司提供)，酶切序列为丨.'；；'； .: rsM43附近碱基序列TGTGGGCTGCCCAGGTCTGATCCCTGACCCACTTGCCACCCGTGCCCTCAGTTCTTCCCCAATGGAGAG GCCATCTGCACGGGCTCGGATGACGCTTCCTGCCGCTTGTTTGACCTGCGGGCAGACCAGGAGCTGATCTGCTTCTC CCACGAGAGCATCATCTGCGGCATCACGTCYGTGGCCTTCTCCCTCAGTGGCCGCCTACTATTCGCTGGCTACGACG ACTTCAACTGCAATGTCTGGGACTCCATGAAGTCTGAGCGTGTGGGTAAGGGCCAGCCCTGGCTGCTGCTTCCTCAG CTGGAAGGACCCTCCCCAGCCCTCCCTCCCCAT(SEQ ID NO 1)引物序列其中，[FAM]表示为荧光标记。rs5443Fl [FAM]CACCCGTGCCCTCAGTTCTT(SEQ ID NO 2)rs5443F2 [FAM]tttttCACCCGTGCCCTCAGTTCTT(SEQ ID NO 3)rs5443F3 [FAM]ttttttttttCACCCGTGCCCTCAGTTCTT(SEQ ID NO 4)rs5443F4 [FAM]tttttttttttttttCACCCGTGCCCTCAGTTCTT(SEQ ID NO 5)rs5443R :GCCCTTACCCACACGCTCAG(SEQ ID NO :6)实验体系及步骤(1)将样本大概定量，然后稀释至约IOng/ U 1作为待测DNA样本待用。(2)配置PCR引物混合液，分别配置4对PCR引物rs5443Fl/R、rs5443F2/R、 rs5443F3/R 和 rs5443F4/R，每条引物浓度各 1 P M。(3)含限制性内切酶酶切特异序列的内对照DNA (标为iDNA)。(4)多重PCR体系(20 U 1)配置
IOxBuffer(Qiagen) 2u 1 PCR引物混合液2 ill
MgC12(25mM)0. 8 u 1
dNTP(IOmM)0.4u 1
样本DNA1 u 1
HotstarTaq(5U/U 1，Qiagen) 0. 2 U 1 ddH2013. 6 illPCR 程序
权利要求
1.一种基因多态检测方法，其特征在于，包括以下步骤针对一个或多个目标基因设计多重PCR引物，每个目标基因包含限制性内切酶序列， 每对引物中的一条具有信号标记；针对每个目标基因包含的限制性内切酶序列，设计内对照DNA片段，该内对照DNA片段包含所述目标基因的限制性内切酶序列；用所述PCR引物对待测样本进行多重PCR扩增；将待测样本的PCR扩增产物和内对照DNA片段混勻，用所述限制性内切酶序列对应的限制性内切酶进行酶切；酶切产物经变性后，通过毛细管电泳将不同长度的片段分开，收集每个条带的位置信息以及信号强度；计算样本每个目标基因片段酶切前后的峰高或面积比、以及内对照DNA片段的酶切前后的峰高或面积比，将每个目标基因片段酶切前后的峰高或面积比值分别参照内对照DNA 片段酶切前后的峰高或面积比值，获得待测样本目标基因片段的遗传多态性。
2.根据权利要求1所述的基因多态检测方法，其特征在于，所述多重PCR引物中，各信号标记引物具有相同或不同的信号标记。
3.根据权利要求2所述的基因多态检测方法，其特征在于，所述相同信号标记的引物对应的扩增产物长度有至少Ibp的差别。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的基因多态检测方法，其特征在于，所述信号标记包括荧光标记。
5.根据权利要求1所述的基因多态检测方法，其特征在于，所述内对照DNA片段通过化学合成或PCR扩增制得。
6.一种基因多态检测试剂盒，其特征在于，主要包括有(A)针对一个或多个目标基因设计的多重PCR引物，每个目标基因包含限制性内切酶序列，每对引物中的一条具有信号标记；(B)针对每个目标基因包含的限制性内切酶序列设计的内对照DNA片段，该内对照DNA 片段包含所述目标基因的限制性内切酶序列；(C)所述限制性内切酶序列对应的限制性内切酶。
7.根据权利要求6所述的基因多态检测试剂盒，其特征在于，所述多重PCR引物中，各信号标记引物具有相同或不同的信号标记。
8.根据权利要求7所述的基因多态检测试剂盒，其特征在于，所述相同信号标记的引物对应的扩增产物长度有至少Ibp的差别。
9.根据权利要求6至8中任一项所述的基因多态检测试剂盒，其特征在于，还包含有多重PCR反应缓冲液及限制性酶切缓冲液。
全文摘要
本发明公开一种基因多态检测方法，包括以下步骤针对目标基因设计多重PCR引物，每个目标基因包含限制性内切酶序列；设计内对照DNA片段，该内对照DNA片段包含目标基因的限制性内切酶序列；对待测样本进行多重PCR扩增；将PCR扩增产物和内对照DNA片段混匀，用限制性内切酶进行酶切；酶切产物经变性后，通过毛细管电泳将不同长度的片段分开，收集每个条带的位置信息及信号强度；计算样本每个目标基因片段酶切前后的峰高或面积比、以及内对照DNA片段酶切前后的峰高或面积比，得待测样本目标基因片段的遗传多态性。本发明还公开了一种基因多态检测试剂盒。本发明基因多态检测方法，能在一个反应体系中快速、精确地同时检测多个样本的多个目标基因的遗传多态性。
文档编号C12Q1/68GK102399900SQ20111042619
公开日2012年4月4日 申请日期2011年12月16日 优先权日2011年12月16日
发明者姜正文, 孙斯平, 彭冬铂 申请人:上海天昊生物科技有限公司