专利名称：微生物絮凝剂的制备方法
技术领域：
本发明涉及絮凝剂，尤其涉及微生物絮凝剂的制备方法。
背景技术：
微生物絮凝剂是微生物在生长过程中所产生的代谢物，其主要成分为多糖、糖蛋白、蛋白质、纤维素、核酸等。与其他絮凝剂相比，微生物絮凝剂具有种类多、来源广、培养条件粗放、絮凝性能好、无环境毒性等特点。由于传统的絮凝剂存在不同的缺陷，尤其是一定量的铝系絮凝剂和聚丙烯酰胺絮凝剂具有环境毒性。因此，微生物絮凝剂自从问世以来便受到广泛的关注，微生物絮凝剂具有重要的研究价值和应用前景。
微生物絮凝剂产生菌来源广泛，种类较多。至今发现的具有絮凝性的微生物近80 种，其中细菌、真菌、放线菌及藻类均有 分布，这些具有絮凝活性、被人关注的微生物大都筛选自土壤、淤泥、污水。目前，微生物絮凝剂的制备多利用糖或工业产品作为生产原料，成本偏高，制约了微生物絮凝剂工业化的生产和大规模的应用。
解决上述问题需要从两个方面入手一是积极寻找廉价的原材料，大幅度降低生产成本；二是针对生物絮凝的理化性质和用途，选择合理的工业化提取工艺和使用方法。发明内容
本发明解决的技术问题是克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种工艺简单、成本低、产量高、周期短、能有效治理污染的微生物絮凝剂的制备方法。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的
—种微生物絮凝剂的制备方法，所述制备方法包括以下步骤
(Al)制备种子培养基；
(A2)培养种子液将活的菌株接种到所述种子培养基中以制备种子液；
(A3)制备山核桃发酵培养基；
(A4)发酵培养菌种将所述种子液接种到所述山核桃发酵培养基以制备所述菌株的发酵液；
(A5)制备絮凝剂制品将所述发酵液离心分离，加提取剂获得絮凝沉淀物，再离心分离和干燥制备成絮凝剂制品。
根据上述的制备方法，可选地，所述步骤(Al)进一步包括以下步骤
(BI)将牛肉膏 0.3-4. 0%、蛋白胨 0.5-2. 0%、氯化钠 O. 2-1.0%在 pH7. 0-7. 8 环境下培养，培养温度20-30°C，转速150-250r/min ；
(B2)培养时间 16-22h，至菌浓 I. O X 108-5. O X 108CFU/mL。
根据上述的制备方法，优选地，所述牛肉膏2. 2%、蛋白胨I. 2%、氯化钠O. 6%在 pH7. 4环境下培养，培养温度25°C，转速200r/min ;培养时间19h。
根据上述的制备方法，可选地，所述步骤(Al)进一步包括以下步骤
(BI)可溶性淀粉 1-3 %、K2HPO40 . 01-0 . 08 %, NaNO30 . 05-0. 15 %,MgSO4 ·7Η200· 01-0. 08%,KC10. 01-0. 08%，pH = 7· 5 8· 5，在 O. 5-1. 5kg/cm2 压力下灭菌 10_50mino
根据上述的制备方法，优选地，可溶性淀粉2 %、K2HPO4O. 05 %、NaNO3O. I %、 MgSO4 · 7Η200· 05%, KCl O. 05%, I. 05kg/cm2 压力下灭菌 30min。
根据上述的制备方法，可选地，所述步骤(A3)进一步包括以下步骤
(Cl)将山核桃废水稀释至COD为4000 8000mg/L，得稀释后的山核桃废水；
(C2)在每升稀释后的山核桃废水中加入葡萄糖I. O 10g、磷酸氢二钾I 3g、硫酸铵O. 2 2g、硫酸镁O. I O. 3g和氯化钠O. 01 O. lg，然后调节pH至7 8。
根据上述的制备方法，优选地，所述COD为6000mg/L，在每升稀释后的山核桃废水中加入葡萄糖5. 5g、磷酸氢二钾2g、硫酸铵I. lg、硫酸镁O. 2g和氯化钠O. 055g,然后调节 pH 至 7. 5。
根据上述的制备方法，可选地，所述步骤(A4)进一步包括以下步骤
(Dl)将山核桃培养基进行高压蒸汽灭菌；
(D2)将所述种子液以3-10%的比例接种到所述山核桃发酵培养基中，于20 40°C、摇床转速为150 250r/min的条件下培养24 32h，获得发酵液。
根据上述的制备方法，优选地，将所述种子液以6%的比例接种到所述山核桃发酵培养基中，于30°C、摇床转速为200r/min的条件下培养30h，获得发酵液。
根据上述的制备方法，可选地，所述步骤(A5)进一步包括以下步骤
(El)将获得的所述发酵液在4000-8000r/min的条件下离心10_20min,收集上清液，按体积比加入2-4倍的提取剂，搅拌均匀并静置沉淀3-8h ；
(E2)在4000-6000r/min条件下离心，弃上清液，收集沉淀并干燥至恒重，得到固体微生物絮凝剂制品。
根据上述的制备方法，优选地，将获得的所述发酵液在6000r/min的条件下离心 15min,收集上清液，按体积比加入3倍的提取剂，搅拌均匀并静置沉淀6h ； (E2)在5000r/ min条件下离心，弃上清液，收集沉淀并干燥至恒重，得到固体微生物絮凝剂制品。
根据上述的制备方法，优选地，所述菌株是蜡状芽孢杆菌、假单胞菌、酱油曲霉、青霉菌、红球菌中的任一种。
根据上述的制备方法，优选地，所述菌株是斜面培养或平板培养。
根据上述的制备方法，优选地，所述提取剂是乙醇或丙酮。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果
I、本发明的生产菌采用廉价的山核桃废水作为替代培养基，辅以少量外加碳源、 氮源、无机盐物质来制备获得微生物絮凝剂，有效地利用了廉价有效的原材料一山核桃废水,节省了传统培养基中的原料成本,使得微生物絮凝剂的生产成本大大降低，同时也为高浓度废水的增值利用找到一条出路。
2、该方法生产的微生物絮凝剂产量高、周期短、适用范围广，对废水的浊度、COD也具有良好的去除效果，能有效治理污染。
参照附图，本发明的公开内容将变得更易理解。本领域技术人员容易理解的是这些附图仅仅用于举例说明本发明的技术方案，而并非意在对本发明的保护范围构成限制。 图中
图I是本发明实施例I的微生物絮凝剂制备方法的流程图。
具体实施方式
图I和以下说明描述了本发明的可选实施方式以教导本领域技术人员如何实施和再现本发明。为了教导本发明技术方案，已简化或省略了一些常规方面。本领域技术人员应该理解源自这些实施方式的变型或替换将在本发明的范围内。本领域技术人员应该理解下述特征能够以各种方式组合以形成本发明的多个变型。由此，本发明并不局限于下述可选实施方式，而仅由权利要求和它们的等同物限定。
实施例I :
图I示意性地给出了本发明实施例的微生物絮凝剂的制备方法的流程图，如图I 所示，所述制备方法包括以下步骤
(Al)制备种子培养基；
(A2)培养种子液将活的菌株接种到所述种子培养基中以制备种子液；优选地， 所述菌株是蜡状芽孢杆菌、假单胞菌、酱油曲霉、青霉菌、红球菌中的任一种。优选地，所述菌株是斜面培养或平板培养。
(A3)制备山核桃发酵培养基；
(A4)发酵培养菌种将所述种子液接种到所述山核桃发酵培养基以制备所述菌株的发酵液；
(A5)制备絮凝剂制品将所述发酵液离心分离，加提取剂获得絮凝沉淀物，再离心分离和干燥制备成絮凝剂制品。优选地，所述提取剂是乙醇或丙酮。
根据上述的制备方法，可选地，所述步骤(Al)进一步包括以下步骤
(BI)将牛肉膏 O. 3-4.0%、蛋白胨 O. 5-2.0%、氯化钠 O. 2-1.0%在 ρΗ7· 0-7. 8 环境下培养，培养温度20-30°C，转速150-250r/min ；
(B2)培养时间 16-22h，至菌浓 I. O X 108-5. O X 108CFU/mL。
根据上述的制备方法，可选地，所述步骤(A3)进一步包括以下步骤
(Cl)将山核桃废水稀释至COD为4000 8000mg/L，得稀释后的山核桃废水；
(C2)在每升稀释后的山核桃废水中加入葡萄糖I. O 10g、磷酸氢二钾I 3g、硫酸铵O. 2 2g、硫酸镁O. I O. 3g和氯化钠O. 01 O. lg，然后调节pH至7 8。
根据上述的制备方法，可选地，所述步骤(A4)进一步包括以下步骤
(Dl)将山核桃培养基进行高压蒸汽灭菌；
(D2)将所述种子液以3-10%的比例接种到所述山核桃发酵培养基中，于20 40°C、摇床转速为150 250r/min的条件下培养24 32h，获得发酵液。
根据上述的制备方法，可选地，所述步骤(A5)进一步包括以下步骤
(El)将获得的所述发酵液在4000-8000r/min的条件下离心10_20min,收集上清液，按体积比加入2-4倍的提取剂，搅拌均匀并静置沉淀3-8h ；
(E2)在4000-6000r/min条件下离心，弃上清液，收集沉淀并干燥至恒重，得到固体微生物絮凝剂制品。
根据本发明实施例I达到的益处在于本发明有效地利用了工农业中的废水_山核桃废水，节省了传统培养基中的原料成本，使得微生物絮凝剂的生产成本大大降低，同时也为高浓度废水的增值利用找到一条出路。微生物絮凝剂制品产量高，产絮周期短，适用范围广，对废水的浊度、COD具有良好的去除效果。
实施例2:
根据实施例I所述的微生物絮凝剂的制备方法的应用例，在该应用例中，制备方法具体为
(Al)制备种子培养基,具体方式为
(BI)将牛肉膏O. 3%、蛋白胨2. O %、氯化钠I. O %在pH7. 8环境下培养，培养温度 30°C，转速 250r/min ；
(B2)培养时间 16h，至菌浓 I. O X 108CFU/mL ；
(A2)培养种子液将斜面培养的蜡状芽孢杆菌菌株接种到所述种子培养基中以制备种子液；
(A3)制备山核桃发酵培养基,具体方式为
(Cl)将山核桃废水稀释至COD为8000mg/L，得稀释后的山核桃废水；
(C2)在每升稀释后的山核桃废水中加入葡萄糖10g、磷酸氢二钾3g、硫酸铵2g、硫酸镁O. 3g和氯化钠O. Ig,然后调节pH至8 ;
(A4)发酵培养菌种将所述种子液接种到所述山核桃发酵培养基以制备蜡状芽孢杆菌发酵液，具体方式为
(Dl)将山核桃培养基进行高压蒸汽灭菌；
(D2)将所述种子液以3%的比例接种到所述山核桃发酵培养基中，于20°C、摇床转速为150r/min的条件下培养32h，获得发酵液；
(A5)制备絮凝剂制品将所述蜡状芽孢杆菌发酵液离心分离，加乙醇获得絮凝沉淀物，再离心分离和干燥制备成絮凝剂制品，具体方式为
(El)将获得的所述发酵液在4000r/min的条件下离心20min,收集上清液,按体积比加入2倍的无水乙醇，搅拌均匀并静置沉淀8h ；
(E2)在4000r/min条件下离心，弃上清液，收集沉淀并干燥至恒重,得到固体微生物絮凝剂制品。
实施例3
根据实施例I所述的微生物絮凝剂的制备方法的应用例，在该应用例中，制备方法具体为
(Al)制备种子培养基，具体方式为
(BI)将牛肉膏4%、蛋白胨O. 5 %、氯化钠O. 2 %在pH7环境下培养，培养温度 20°C，转速 150r/min ；
(B2)培养时间 22h，至菌浓 5. O X 108CFU/mL ；
(A2)培养种子液将平板培养的蜡状芽孢杆菌菌株接种到所述种子培养基中以制备种子液；
(A3)制备山核桃发酵培养基，具体方式为
(Cl)将山核桃废水稀释至COD为4000mg/L，得稀释后的山核桃废水；
(C2)在每升稀释后的山核桃废水中加入葡萄糖lg、磷酸氢二钾lg、硫酸铵O. 2g、 硫酸镁O. Ig和氯化钠O. Olg,然后调节pH至7 ;
(A4)发酵培养菌种将所述种子液接种到所述山核桃发酵培养基以制备蜡状芽孢杆菌发酵液，具体方式为
(Dl)将山核桃培养基进行高压蒸汽灭菌；
(D2)将所述种子液以10%的比例接种到所述山核桃发酵培养基中，于40°C、摇床转速为250r/min的条件下培养24h，获得发酵液；
(A5)制备絮凝剂制品将所述蜡状芽孢杆菌发酵液离心分离，加乙醇获得絮凝沉淀物，再离心分离和干燥制备成絮凝剂制品，具体方式为
(El)将获得的所述发酵液在8000r/min的条件下离心IOmin,收集上清液,按体积比加入4倍的丙酮，搅拌均匀并静置沉淀3h ；
(E2)在6000r/min条件下离心,弃上清液,收集沉淀并干燥至恒重,得到固体微生物絮凝剂制品。
实施例4:
根据实施例I所述的微生物絮凝剂的制备方法的应用例，在该应用例中，制备方法具体为
(Al)制备种子培养基，具体方式为
(BI)将牛肉膏2. 2%、蛋白胨I. 2%、氯化钠O. 6%在pH7. 4环境下培养，培养温度 25°C，转速 200r/min ；
(B2)培养时间 19h，至菌浓 3. O X 108CFU/mL ；
(A2)培养种子液将斜面培养的蜡状芽孢杆菌菌株接种到所述种子培养基中以制备种子液；
(A3)制备山核桃发酵培养基，具体方式为
(Cl)将山核桃废水稀释至COD为6000mg/L，得稀释后的山核桃废水；
(C2)在每升稀释后的山核桃废水中加入葡萄糖5. 5g、磷酸氢二钾2g、硫酸铵 I. lg、硫酸镁O. 2g和氯化钠O. 055g,然后调节pH至7. 5 ;
(A4)发酵培养菌种将所述种子液接种到所述山核桃发酵培养基以制备蜡状芽孢杆菌发酵液，具体方式为
(Dl)将山核桃培养基进行高压蒸汽灭菌；
(D2)将所述种子液以6%的比例接种到所述山核桃发酵培养基中，于30°C、摇床转速为200r/min的条件下培养30h，获得发酵液；
(A5)制备絮凝剂制品将所述蜡状芽孢杆菌发酵液离心分离，加乙醇获得絮凝沉淀物，再离心分离和干燥制备成絮凝剂制品，具体方式为
(El)将获得的所述发酵液在6000r/min的条件下离心15min,收集上清液,按体积比加入3倍的无水乙醇，搅拌均匀并静置沉淀6h ；
(E2)在5000r/min条件下离心,弃上清液,收集沉淀并干燥至恒重,得到固体微生物絮凝剂制品。
实施例5
根据实施例I所述的微生物絮凝剂的制备方法的应用例，在该应用例中，制备方法具体为
(Al)制备种子培养基，具体方式为
可溶性淀粉2 %、K2HP040. 05 %、NaN030. I %、MgS04 · 7H200. 05 %、KCl O. 05%, pH = 8,1. 05kg/cm2 压力下灭菌 30min ；
(A2)培养种子液将假单胞菌接种到种子培养基中，在30°C、150r/min摇床转速下培养4d，以制备种子液；
(A3)制备山核桃发酵培养基，具体方式为
(Cl)将山核桃废水稀释至COD为6000mg/L，得稀释后的山核桃废水；
(C2)在每升稀释后的山核桃废水中加入葡萄糖5. 5g、磷酸氢二钾2g、硫酸铵I.lg、硫酸镁O. 2g和氯化钠O. 055g,然后调节pH至7. 5 ;
(A4)发酵培养菌种将所述种子液接种到所述山核桃发酵培养基以制备假单胞菌发酵液，具体方式为
(Dl)将山核桃培养基进行高压蒸汽灭菌；
(D2)在150mL的三角瓶中装入50mL发酵培养基，灭菌后按5-10%的接种量将菌种自种子培养基中接入发酵培养基中，在30°C、150r/min摇床转速下培养72h，以发酵液作为絮凝剂样品；
(A5)制备絮凝剂制品将所述假单胞菌发酵液离心分离，加乙醇获得絮凝沉淀物，再离心分离和干燥制备成絮凝剂制品，具体方式为
(El)将获得的所述发酵液在6000r/min的条件下离心15min,收集上清液,按体积比加入3倍的无水乙醇，搅拌均匀并静置沉淀6h ；
(E2)在5000r/min条件下离心,弃上清液,收集沉淀并干燥至恒重,得到固体微生物絮凝剂制品。
上述实施例仅是示例性地给出了各组分的配比以及环境温度、转速、时间等参数， 当然还可以是其它组分及处于数值范围内的值，如当菌株采用酱油曲霉、青霉菌、红球菌时，采用与选取的菌匹配的培养基。这对于本领域的技术人员来说，实施效果是可以预料到的，是能够实现本发明的目的的。
权利要求
1.一种微生物絮凝剂的制备方法，所述制备方法包括以下步骤 (Al)制备种子培养基； (A2)培养种子液将活的菌株接种到所述种子培养基中以制备种子液； (A3)制备山核桃发酵培养基； (A4)发酵培养菌种将所述种子液接种到所述山核桃发酵培养基以制备所述菌株的发酵液； (A5)制备絮凝剂制品将所述发酵液离心分离，加提取剂获得絮凝沉淀物，再离心分离和干燥制备成絮凝剂制品。
2.根据权利要求I所述的制备方法，其特征在于所述步骤(Al)进一步包括以下步骤 (BI)将牛肉膏O. 3-4. 0%、蛋白胨O. 5-2. O %、氯化钠O. 2-1. 0%在pH7. 0-7. 8环境下培养，培养温度20-30°C，转速150-250r/min ； (B2)培养时间 16-22h，至菌浓 I. 0X108-5. OX 108CFU/mLo
3.根据权利要求I所述的制备方法，其特征在于所述牛肉膏2.2%、蛋白胨I. 2%、氯化钠O. 6%在pH7. 4环境下培养，培养温度25°C，转速200r/min ;培养时间19h。
4.根据权利要求I所述的制备方法，其特征在于所述步骤(Al)进一步包括以下步骤 (BI)可溶性淀粉 1-3 K2HPO4O. 01-0. 08 NaNO3O. 05-0. 15MgSO4 ·7Η200· 01-0. 08%,KC10. 01-0. 08%，pH = 7· 5 8· 5，在 O. 5-1. 5kg/cm2 压力下灭菌10_50mino
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于可溶性淀粉2%、K2HPO4O.05%,NaNO3O. I %, MgSO4 · 7Η200· 05%, KCl O. 05%, I. 05kg/cm2 压力下灭菌 30min。
6.根据权利要求I所述的制备方法，其特征在于所述步骤(A3)进一步包括以下步骤 (Cl)将山核桃废水稀释至COD为4000 8000mg/L，得稀释后的山核桃废水； (C2)在每升稀释后的山核桃废水中加入葡萄糖I. O 10g、磷酸氢二钾I 3g、硫酸铵O.2 2g、硫酸镁O. I O. 3g和氯化钠O. 01 O. lg，然后调节pH至7 8。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于所述COD为6000mg/L，在每升稀释后的山核桃废水中加入葡萄糖5. 5g、磷酸氢二钾2g、硫酸铵I. lg、硫酸镁O. 2g和氯化钠O.0558，然后调节？!1至7.5。
8.根据权利要求I所述的制备方法，其特征在于所述步骤(A4)进一步包括以下步骤 (Dl)将山核桃培养基进行高压蒸汽灭菌； (D2)将所述种子液以3-10%的比例接种到所述山核桃发酵培养基中，于20 40°C、摇床转速为150 250r/min的条件下培养24 32h，获得发酵液。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于将所述种子液以6%的比例接种到所述山核桃发酵培养基中，于30°C、摇床转速为200r/min的条件下培养30h，获得发酵液。
10.根据权利要求I所述的制备方法，其特征在于所述步骤(A5)进一步包括以下步骤(El)将获得的所述发酵液在4000-8000r/min的条件下离心10_20min,收集上清液,按体积比加入2-4倍的提取剂，搅拌均匀并静置沉淀3-8h ； (E2)在4000-6000r/min条件下离心,弃上清液,收集沉淀并干燥至恒重,得到固体微生物絮凝剂制品。
11.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于将获得的所述发酵液在6000r/min的条件下离心15min，收集上清液，按体积比加入3倍的提取剂，搅拌均匀并静置沉淀6h ； 在5000r/min条件下离心，弃上清液，收集沉淀并干燥至恒重，得到固体微生物絮凝剂制品。
12.根据权利要求I所述的制备方法，其特征在于所述菌株是蜡状芽孢杆菌、假单胞菌、酱油曲霉、青霉菌、红球菌中的任一种。
13.根据权利要求12所述的制备方法，其特征在于所述菌株是斜面培养或平板培养。
14.根据权利要求I所述的制备方法，其特征在于所述提取剂是乙醇或丙酮。
全文摘要
本发明公开了一种微生物絮凝剂的制备方法，所述制备方法包括以下步骤(A1)制备种子培养基；(A2)培养种子液将斜面培养的蜡状芽孢杆菌菌株接种到所述种子培养基中以制备种子液；(A3)制备山核桃发酵培养基；(A4)发酵培养菌种将所述种子液接种到所述山核桃发酵培养基以制备蜡状芽孢杆菌发酵液；(A5)制备絮凝剂制品将所述蜡状芽孢杆菌发酵液离心分离，加乙醇获得絮凝沉淀物，再离心分离和干燥制备成絮凝剂制品。本发明具有成本低、周期短、产量高、有效治理环境污染等优点。
文档编号C12P1/04GK102925489SQ20121038407
公开日2013年2月13日 申请日期2012年10月10日 优先权日2012年10月10日
发明者陈建军, 项海, 吴昊 申请人:临安天川环保科技有限公司