专利名称：一株高油脂含量的微藻及其蓄积高含量油脂的培养条件的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株高油脂含量的微藻及其蓄积高含量油脂的培养条件。即诱导筛选出一株具有在细胞中积累大量油脂能力的微藻细胞，并发明了能够诱导该微藻细胞株合成大量油脂的培养条件。本发明可用于微藻生物柴油的生产。
背景技术：
石油是一个国家的经济和社会发展的命脉。随着人口增加，化石能源资源的枯竭，一方面原油价格一路飙升，限制了产业经济的可持续发展；另一方面大量化石能源的应用，导致大气中CO2含量的净增加，使得地球环境与气候恶化，制约了人类的可持续发展。因此，世界各国不得不考虑加快石油替代原料的研究与开发步伐，其中从生物中提取的生物柴油被视为一种可再生的、绿色安全的取代能源越来越受到重视。然而在利用大豆等农作物作 为生产生物柴油(化学本质为脂肪酸甲脂)的原料的同时，世界各国都面临着生物质原料供应不足或与人争粮争地的尴尬局面，因此寻找新一代的生物柴油原料已经迫在眉睫。地球上存活的微藻种类繁多，超过20万种以上。某些微藻因含油量高、易于培养、单位面积产量大等优点，被视为新一代的、甚至是唯一能实现完全替代石化柴油的生物柴油原料。微藻每年固定的CO2大约占全球净光合作用的40%，在能量转化和碳等元素循环中起着举足轻重的作用。微藻与陆生高等植物有着几乎相同的光合作用机理，但由于它们有着简单的细胞结构，较大的细胞表面积与体积比，通常在液体环境中(甚至在废水中)生长，能够更有效地利用光能(光能转化率可达到10%以上)，并且繁殖速度较快，单位面积产量是陆生高等植物的若干倍。许多含油微藻与高等陆生油料作物相比，单位面积内它们能够产生出数十倍甚至上百倍量的油脂。因此，微藻是一潜在的、重要的液体生物燃料生产原料。早在二十世纪70年代，美国对利用微藻生产生物柴油就产生了浓厚的兴趣，并在八十年代初由国家可再生能源实验室(the National Renewable Energy Laboratory,NREL)牵头并联合了多个单位进行可用于生产生物柴油微藻资源调查与筛选等基础研究。目前，欧盟和美国在前期研究的基础上，分别颁布了生物柴油的标准(EN14214和ASTMD6751)，对生物柴油的脂肪酸碳链长度和碳链饱和度提出了要求，以16碳和18碳的饱和或单不饱和脂肪酸为主形成的生物柴油的性能为好。利用微藻进行清洁可再生生物能源的开发正成为新能源及微藻应用研究的热点及重点领域。然而，尽管微藻的种类繁多，但它们就像农作物一样，不同种类积累不同的代谢产物。而生产生物柴油需要藻细胞中大量积累油脂。但是，大多数微藻在正常的生长条件下下细胞的含油量都一般在10% 30%，远不能满足生物柴油生产的需要。微藻生物柴油的高生产成本是制约其商业化开发的主要因素，而影响生产成本的关键因素是微藻的生物量及其油脂含量。具测算，当微藻油脂含量达干物质的50%-60%以上时，微藻生产生物柴油在价格上就具有竞争力(USA Solar Energy Research Institute, Golden, CO, 1986)。因此，从繁多的微藻中筛选出油脂含量高的微藻，筛选提高微藻油脂含量及品质的培养方法，是微藻生物柴油研究的热点之一，也是微藻生物柴油开发的重要基础性工作。
发明内容
本发明提供一株高油脂含量的微藻及其蓄积高含量油脂的培养条件，可用于微藻生物柴油的生产。为达到上述目的，本发明所采用的技术方案如下从海水中分离纯化得到并在实验室条件下长期培养的一株微藻细胞，该藻细胞球形，直径2-4微米，色素体一个，淡黄绿色，侧生，仅占细胞周围的一部分。经鉴定为微绿球藻Nannochloropsis oculata的一个诱变品系(N. oculata SH0U-S14)。该藻株经培养后发现，其适应温度范围为10-36°C，适应盐度为4-36，适应光照强度80-450 μ mol ·πΓ2 .s—1，适宜培养的pH范围为7. 5-8.5。将该微绿球藻品系在批次培养模式下，培养用海水盐度20-30,温度10_15°C,光照强度150-450 μ mol · πΓ2 · s'光照周期24L:0D。在消毒海水中同时添加O. 22mmol · L-1 的硝酸钠、O. 04mmol · Γ1的磷酸二氢钠和I. 2mmol · Γ1的柠檬酸铁，其他营养盐的浓度参照 F/2 配方配制(Gui I lard, R. R. L. Culture of phytoplankton for feeding marineinvertebrates[A]. InSmith ff. L, Chanley M. H(Eds.) Culture of marine invertebrateanimals [C] · Plenum New York Press, 1975，29-60.)。连续充气培养 10-12 天，最终收获的该藻株细胞经检测，其细胞总脂肪占干物质的含量可高达60%以上，中性脂占总脂的含量可达80%以上，其脂肪酸组成以16 0、16 : I和18 : I为主，16 0、16 : I和18 : I含量之和占总脂肪酸含量的90 %以上。该生物材料的样品已提交至中国典型培养物保藏中心保藏，保藏日期2012年9月 12 日，保藏编号CCTCC NO :M2012325，分类命名微绿球藻 SH0U-S14 (Nannochloropsisoculata SH0U-S14)，保藏地址湖北省武汉市珞珈山(武汉大学)。
图I、图2示该藻株细胞诱导培养后的透射电子显微镜照片，可以观察到胞内脂肪体(暗灰色部分)大小与称重法得到的油脂含量相一致。
具体实施方案2011年10月-2012年4月期间多次开展了微绿球藻N. oculata SH0U-S14的高脂肪含量的诱导培养，培养条件如下利用3000mL的三角烧瓶，在光照培养箱中批次培养模式下连续充气培养，初始接种密度为LOXlO7ceIl mL—1，培养用海水盐度20-30，温度10-15°C，光照强度150-450 μ mol · m_2 · s—1，光照周期24L:0D。在消毒海水中分别添加
0.22mmol · I/1的硝酸钠、0. (Mmmol · Γ1的磷酸二氢钠和I. 2mmol · Γ1的柠檬酸铁，其他营养盐的浓度参照 F/2 配方配制(Gui I lard, R. R. L. Culture of phytoplankton forfeedingmarine invertebrates[A]. InSmith ff. L, Chanley M.H (Eds. ) Culture ofmarineinvertebrateanimals [C]. Plenum New York Press, 1975, 29-60.)。培养 10 天后离心收集藻细胞，经冷冻干燥后的藻细胞，采用氯仿甲醇法提取总脂，提取的总脂采用液液分离法分析脂肪中甘油三脂的比例，提取的总脂经甲脂化后采用气质联用仪分析脂肪酸组成。根据本发明的具体实施方案，最终检测表明根据本发明的培养条件，微绿球藻N. oculata SH0U-S14藻细胞中总油脂占细胞干物质的含量为60. 44 % ±0.68%，其中中性脂占总脂的含量为83.25% ±2. 10%，对细胞脂肪酸组成的检测结果表明16 O、16 : I和18 : I占总脂肪酸的含量分别为45. 20 % ±0.43 %、37. 75 % ±0. 15%和10. 11 ±0. 13%%，三者累积占总脂肪酸的93. 05±O. 18%%。其脂肪酸组成完全符合生物 柴油的生产标准。
权利要求
1.一株高油脂含量的微藻及其蓄积高含量油脂的培养条件。
2.如权利要求I所述的一株微藻,属于微绿球藻Nannochloropsisoculata的一个诱变品系(N. oculataSH0U-S14)。细胞球形，直径2_4微米，色素体一个，淡黄绿色，侧生，仅占细胞周围的一部分。
3.如权利要求I所述的一株微绿球藻品系，其对温度、盐度和光照强度的适应范围广，适宜培养的PH范围为7. 5-8. 5。
4.如权利要求I所述的一株微绿球藻品系，在本发明培养条件下收获的该藻株细胞总油脂占干物质的含量可高达60%以上，中性脂占总脂的含量达80%以上，其脂肪酸组成以16 0、16 I和18 I为主，16 0、16 I和18 I含量之和占总脂肪酸的90%以上。
5.如权利要求I所述的一株微绿球藻品系，其蓄积高含量油脂的基本培养条件如下批次培养模式下连续充气培养8-12天，培养用海水盐度20-30，温度10-15°C，光照强度150-450umol · πΓ2 · s—1，光照周期 24L:0D。
6.如权利要求I所述的一株微绿球藻品系，其产生高含量油脂的培养液组成为在消毒海水中分别添加O. 22mmol · L—1的硝酸钠、O. 04mmol · L—1的磷酸二氢钠和I. 2mmol · L—1的梓檬酸铁。
全文摘要
本发明公布了一株高油脂含量的微藻及其蓄积高含量油脂的培养条件，可用于微藻生物柴油的生产。其特征是该藻株为微绿球藻(Nannochloropsis oculata)的一个诱变品系，细胞球形，直径2-4um，色素体一个，淡黄绿色，侧生。该藻株易培养，在批次培养模式下，采用特定的温度、盐度、光照及连续充气条件，给予优化的培养液，经10-12天的培养，该藻株细胞的总脂占干重可高达60％以上，中性脂占总脂80％以上，其脂肪酸组成中16∶0、16∶1和18∶1占总脂肪酸90％以上。本发明的微藻藻株在本发明的培养条件下培养可获得高油脂含量的藻细胞，且油脂特性符合微藻生物柴油的标准。
文档编号C12P7/64GK102911873SQ20121040718
公开日2013年2月6日 申请日期2012年10月23日 优先权日2012年10月23日
发明者黄旭雄, 危立坤, 黄征征 申请人:上海海洋大学