表达抑制昆虫保幼激素甲基转移酶基因的dsRNA的重组杆状病毒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种表达抑制昆虫保幼激素甲基转移酶基因（HaJHAMT基因）的dsRNA的重组杆状病毒及其在制备杀虫剂中的应用。本发明提供了一种RNA分子，为如下（a）或（b）：（a）序列表的序列7所示的RNA分子；（b）与序列表的序列7反向互补的RNA分子。编码所述RNA分子的DNA分子也属于本发明的保护范围。含有所述DNA分子的重组载体、重组杆状病毒、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。本发明将棉铃虫作为模式昆虫，通过抑制保幼激素甲基转移酶基因在昆虫体内的表达，可以促进杆状病毒对昆虫的杀虫效力，从而达到控制害虫对农作物危害的目的。本发明对于农业生产具有重大价值。
【专利说明】表达抑制昆虫保幼激素甲基转移酶基因的dsRNA的重组杆状病毒
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种表达抑制昆虫保幼激素甲基转移酶基因的dsRNA的重组杆状病毒及其在制备杀虫剂中的应用。
【背景技术】
[0002]昆虫的生长发育、蜕皮、变态、滞育、生殖、多型现象等生理过程以及行为反应等都离不开激素的参与。保幼激素(juvenile hormone, JH)是一种低分子量、脂溶性、非蛋白质的萜烯类化合物，已经证明有7种天然JH存在，具体如下:(I) JH0，(2) JHI, (3) JHII, (4)JHIII, (5)4-methyl-JHI, (6)JHII1-bisepoxide, (7)mehtyl famesoate。其中(I)、(2)、
[3]、 (5)存在于鳞翅目中，(6)存在于双翅目中，(7)存在于蟑螂中，(4)在所有昆虫中都存在。JH由咽侧体合成和释放，是节肢动物特有的激素，未见于其它动物中。
[0003]JH的生物合成途径主要是:己酸、丙酸一甲羟戊酸(MVA)—异戊烯基焦磷酸(IPP)—焦磷酸法呢酯一法尼酸(FA) — JH。保幼激素甲基转移酶(JHAMT)的作用为将外源S-腺苷-甲硫氨酸分子中的甲基转移到法尼酸分子形成甲基法尼酯。法呢酸一JH的合成途径，因昆虫种类不同而异。甲基酯化和环氧化是JH合成的特有反应，相应的甲基转移酶(JHAMT)、JH环氧化酶是JH合成的特有反应酶。
[0004]昆虫激素已成为杀虫剂研究与开发的一个重点领域，其作用机理不同于以往作用于神经系统的传统杀虫剂，毒性低、污染少、对天敌和有益生物影响小，有助于可持续农业的发展、有利于无公害绿色食品生产、有益于人类健康。
[0005]RNA干扰(RNA interference, RNAi)是一种新发现的基因调控机制,是由与革巴基因序列同源的双链RNA(dsRNA)所诱导的一种特异性基因沉默现象。RNAi在功能基因组学、药物靶位点筛选、细胞信号传导通路分析、疾病治疗等方面都有广泛的应用潜力。
[0006]杆状病毒(baculovirus)是一类具有囊膜包裹的双链环状DNA病毒,基因组大小为80-180kb。杆状病毒的结构特征为病毒粒子呈杆状，外面包被着一层蛋白质膜，外观有一定规则，称为多角体病毒(NPV)。杆状病毒专一感染节肢动物，其自然宿主主要为鳞翅目、膜翅目和双翅目昆虫，还感染一些甲壳类和螨类。在自然界中，杆状病毒存在出芽病毒粒子(budded virus, BV)和包埋型病毒粒子(occlusion-derived virus, ODV ;又称多角体包涵体，简称PIB或OBs)两种病毒形式。BV是在昆虫细胞之间传播的一种病毒粒子，带有病毒编码的囊膜蛋白，可以与细胞表面的特定受体相结合，在昆虫体内或者细胞系的细胞之间传播。ODV是杆状病毒在环境中的传播形态，包埋于包涵体中。包涵体由多角体蛋白质组成，其外侧为多角体囊膜，在环境中非常稳定，对病毒粒子起到保护作用。未经感染的幼虫吞下含多角体包涵体的食物后，多角体蛋白在昆虫中肠中的酸性PH环境下降解，释放病毒粒子核衣壳，病毒接触并感染昆虫幼虫中肠的表皮细胞组织，制造出芽病毒粒子，芽病毒粒子通过出芽经细胞质膜进入宿主昆虫的血腔中，导致系统感染，在杆状病毒感染后期，病毒粒子被大量多角体蛋白包被，形成多角体包涵体。杆状病毒对宿主昆虫有较高的致病性，对天敌安全，不污染环境，尤其是它能在害虫种群中形成流行病而长期控制虫口并且不产生抗药性，明显优于其它杀虫剂。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是提供一种表达抑制昆虫保幼激素甲基转移酶基因(HaJHAMT基因)的dsRNA的重组杆状病毒及其在制备杀虫剂中的应用。
[0008]本发明提供了一种RNA分子，为如下(a)或(b):
[0009]Ca)序列表的序列7所不的RNA分子(单链RNA分子或双链RNA分子)；
[0010](b)与序列表的序列7反向互补的RNA分子(单链RNA分子或双链RNA分子)。[0011]编码所述RNA分子的DNA分子也属于本发明的保护范围。
[0012]所述DNA分子为如下I)或2)或3):
[0013]1)依次由DNA片段1、间隔区和DNA片段II组成的DNA分子；所述DNA片段I如序列表的序列6自5’末端第1-405位核苷酸所示；所述DNA片段II如序列表的序列6自5’末端第630-1034位核苷酸所示；
[0014]2)序列表的序列6所示的DNA分子；
[0015]3)序列表的序列2自5’末端第206至610位核苷酸所不的DNA分子。
[0016]含有所述DNA分子的重组载体、重组杆状病毒、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。
[0017]所述重组载体中，可由opl66启动子(杆状病毒早期启动子)和/或PlO启动子(杆状病毒晚期启动子)启动所述DNA分子的表达。所述opl66启动子具体如序列表的序列5所示。所述PlO启动子具体如序列表的序列8所示。
[0018]所述重组载体可具有表达盒甲和表达盒乙；所述表达盒甲为用于表达所述DNA分子的表达盒；所述表达盒乙为用于表达杆状病毒多角体蛋白(Ha polh蛋白)的编码基因的
表达盒。
[0019]所述重组载体具体可为将所述opl66启动子、所述DNA分子和所述多角体蛋白的编码基因分别插入表达载体(如载体PFastBac? DUAL)的多克隆位点得到的重组质粒Μ。所述ορ166启动子可插入载体pFastBac? DUAL的NcoI和SmaI酶切位点之间。所述所述DNA分子可插入pFastBac? DUAL的PvuII酶切位点。所述多角体蛋白的编码基因可插入载体pFastBac? DUAL 的 BamHI 和 HindIII 位点之间。
[0020]所示重组载体具体可为将所述表达盒甲和所述表达盒乙插入Hz8 Z egt Bacmid中的attB位点得到的重组质粒N。
[0021 ] 所述重组载体具体可为将所述重组质粒M中Tn7L和Tn7R位点之间包括所述表达盒甲和所述表达盒乙在内的DNA片段插入Hz8 Zl egt Bacmid中的attB位点得到的重组质粒Q。
[0022]所述Hz8 Zl egt Bacmid为将HaBacHZ8Bacmid中的脱皮甾体尿苷二磷酸葡糖转移酶基因(又称Ecdysteroid UDP-Glucosy I transferase基因，简称egt基因)灭活后得到的重组质粒。所述Hz8 Zl egt Bacmid具体为将序列表的序列9所示的egfp基因取代HaBacHZ8Bacmid中的egt基因的开放阅读框自5’末端116至1470位核苷酸所示的DNA片段得到的重组质粒。[0023]所述重组杆状病毒可为出芽病毒粒子的形式或多角体包涵体的形式(多角体包涵体与出芽病毒粒子相比，具有口服感染的能力)。
[0024]所述重组杆状病毒的出芽病毒粒子具体可通过如下方法制备得到:将所述重组质粒N或所述重组质粒Q导入昆虫细胞(如棉铃虫HzAml细胞)并进行培养，收集培养上清，即为含有所述出芽病毒粒子的病毒液。
[0025]所述重组杆状病毒的多角体包涵体可通过如下方法制备得到:将所述重组质粒N或所述重组质粒Q导入昆虫细胞(如棉铃虫HzAml细胞)并进行培养,收集细胞沉淀,细胞沉淀中即含有所述多角体包涵体。所述重组杆状病毒的多角体包涵体可通过将所述出芽病毒粒子接种昆虫并收集昆虫尸体得到。所述重组杆状病毒的多角体包涵体具体可通过如下方法制备得到:将所述出芽病毒粒子接种昆虫，昆虫死亡后收集尸体并捣碎，加入水并搅匀后用纱布过滤，收集滤液并300g离心10min，收取上清液并3000g离心30min，收集沉淀，即为所述多角体包涵体。所述昆虫可为棉铃虫。
[0026] 以上任一所述杆状病毒多角体蛋白为如下(C)或(d):(c)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(d)将序列3的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有多角体蛋白功能的的由序列3衍生的蛋白质。
[0027]以上任一所述杆状病毒多角体蛋白的编码基因可为如下4)或5)或6)或7)的DNA分子:4)序列表的序列4自5’末端第157-897位核苷酸所示的DNA分子；5)序列表中序列
4所示的DNA分子；6)在严格条件下与4)或5)限定的DNA序列杂交且编码多角体蛋白的DNA分子；7)与4)或5)限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码多角体蛋白的DNA分子。
[0028]本发明还保护一种杀虫剂，其活性成分为抑制昆虫保幼激素甲基转移酶基因表达的物质。所述杀虫剂可为棉铃虫杀虫剂。所述抑制HaJHAMT基因表达的物质可为以上任一所述RNA分子、任一所述DNA分子、任一所述重组载体、任一所述表达盒、任一所述转基因细胞系、任一所述重组菌或任一所述重组杆状病毒。
[0029]本发明还保护抑制昆虫保幼激素甲基转移酶基因表达的物质在制备杀虫剂中的应用。所述杀虫剂可为棉铃虫杀虫剂。抑制昆虫保幼激素甲基转移酶基因表达的物质可为RNA分子。所述抑制HaJHAMT基因表达的物质可为以上任一所述RNA分子、任一所述DNA分子、任一所述重组载体、任一所述表达盒、任一所述转基因细胞系、任一所述重组菌或任一所述重组杆状病毒。
[0030]以上任一所述昆虫保幼激素甲基转移酶为如下(e)或(f):(e)由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(f)将序列I的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的的由序列I衍生的蛋白质。
[0031]以上任一所述昆虫保幼激素甲基转移酶基因为如下8)或9)或10)或11)的DNA分子:8)序列表的序列2自5’末端第83至937位所示的DNA分子；9)序列表的序列2所示的DNA分子；10)在严格条件下与8)或9)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白质的DNA分子；11)与8)或9)限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码所述蛋白质的DNA分子。
[0032]本发明将棉铃虫作为模式昆虫，通过抑制保幼激素甲基转移酶基因在昆虫体内的表达，可以促进杆状病毒对昆虫的杀虫效力，从而达到控制害虫对农作物危害的目的。本发明对于农业生产具有重大价值。【专利附图】
【附图说明】
[0033]图1为重组质粒pFBD-HaPH-op 166-HaJHAMTRNAi的结构示意图。
[0034]图2为HaBac Δ egt的基因组的结构示意图。
[0035]图 3 为 Hz8 Zl egt Bacmid 和 HaBac Δ egt-HaJHAMTRNAi bacmid 的 PCR 鉴定电泳图；1:Hz8 Zl egt Bacmid ；2:HaBac Δ egt-HaJHAMTRNAi bacmid。
[0036]图4为实施例4中培养3天后的荧光照片。
[0037]图5为实施例6中PCR扩增产物的电泳图。
【具体实施方式】[0038]以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。Bacmid的英文全称为Baculovirus plasmid，中文含义为杆状病毒质粒。Grace’s培养基粉剂:购自Invitrogen。大肠杆菌DHlOB:购自Invitrogen公司，货号18290-015。
[0039]载体pFastBac? DUAL:参考文献:Bac-to-Bac Baculovirus Expression SystemVersion D 6 April 2004。
[0040]Helper 质粒:参考文献:Bac-to-Bac Baculovirus Expression System VersionD6 April 2004。
[0041]HaBacHZ8 Bacmid(该质粒具有改造后的杆状病毒基因组DNA，所述改造指的是:多角体蛋白基因中插入了供转座元件插入的attB位点，原多角体蛋白基因失活):参考文献:Han-zhong Wang, Fei Deng, Pijlmanj Gorben Pj Xin-wen Chen, Xiu-1ian Sun,Vlakj JustM，Zhi—hong Hu.Cloning of biologically active genomes from a Helicoverpaarmigera single-nucleocapsid nucleopolyhedrovirus isolate by using a bacterialartificial chromosome.Virus Res.2003Nov;97(2):57-63.;Yan_Hong SI，Ming-GangFANG, Yi HUANG，Fang-Liang ZHENG, Ting LI, Zh1-Hong HUj Han-Zhong WANG.Constructionand Characterization of a Helicoverpa armigera Nucleopolyhedrovirus BacterialArtificial Chromosome with Deletion of Ecdysteroid UDP-GlucosyItransferaseGene.Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry Vol.71 (2007)N0.10P2435-2441。
[0042]棉铃虫HzAml细胞:张佑红；王华林；朱雄伟；秦琴；陈燕；吕中；马洁；张菁；适合棉铃虫细胞HzAml生长的培养基筛选及低血清驯化[J];生物工程学报；2006年04期。
[0043]棉铃虫(Helicoverpaarmigera):参考文献:Zhao X., K.ffu, G.Liang andY.Gu0.2009.Modified female calling behavior in CrylAc-resistant Helicoverpaarmigera(Lepidoptera:Noctuidae).Pest Management Science.65(4):353-357.。
[0044]棉铃虫的保幼激素甲基转移酶如序列表的序列I所示(由284个氨基酸残基组成)。棉铃虫的保幼激素甲基转移酶的编码基因(HaJHAMT基因)的cDNA如序列表的序列2所示，其开放阅读框如序列表的序列2自5’末端第83至937位核苷酸组成。
[0045]LB培养基(pH7.0):溶剂为水，溶质及其浓度如下:酵母膏5g/L、蛋白胨10g/L、NaCl 10g/L。[0046]实施例1、干扰载体的构建
[0047]1、合成序列表的序列4所示的双链DNA分子(棉铃虫的多角体蛋白基因，又称Hapolh基因，其开放阅读框为序列表的序列4自5’末端第157-897位核苷酸所示；Ha polh基因编码序列表的序列3所示的Ha polh蛋白)并将其插入载体pFastBac? DUAL的BamHI和HindIII位点之间，得到重组质粒pFBD-HaPH。
[0048]2、合成序列表的序列5所不的双链DNA分子(杆状病毒早期启动子，又称opl66启动子)并将其插入重组质粒pFBD-HaPH的NcoI和SmaI酶切位点之间，得到重组质粒pFBD-HaPH-op166 ο
[0049]3、合成序列表的序列6所示的双链DNA分子(将其命名为回文片段；序列表的序列6中，自5’末端第1-405位核苷酸和第630-1034位核苷酸反向互补，第406-629位核苷酸为间隔区)并将其插入重组质粒pFBD-HaPH-op 166的PvuII酶切位点，得到重组质粒pFBD-HaPH-op 166-HaJHAMTRNAi。重组质粒 pFBD-HaPH-op 166-HaJHAMTRNAi 的结构示意图见图1。
[0050]实施例2、Hz8 Zl egt Bacmid 的制备
[0051] 将序列表的序列9所示的egfp基因取代HaBacHZ8Bacmid中的egt基因的开放阅读框自5’末端116至1470位核苷酸所示的DNA片段，得到Hz8 ^ egt Bacmid。
[0052]实施例3、HaBac Λ egt-HaJHAMTRNAi bacmid 的获得
[0053]机理描述:在大肠杆菌中，Helper质粒促进转座的发生，重组质粒pFBD-HaPH-op 166-HaJHAMTRNAi的Tn7L和Tn7R位点之间包括回文片段和Ha polh基因(为了回补外源片段插入所造成的Hz8」egt Bacmid的多角体蛋白基因失活)在内的DNA片段通过转座作用插入Hz8 Zl egt Bacmid的attB位点,得到重组杆状病毒质粒。
[0054]1、将Helper质粒导入大肠杆菌DH10B的感受态细胞，得到重组菌I。
[0055]2、将Hz8 Zl egt Bacmid导入步骤I得到的重组菌I，得到重组菌II。
[0056]3、将实施例1得到的重组质粒pFBD-HaPH-op 166-HaJHAMTRNAi转化步骤2得到的重组菌II，然后涂布于LB培养基平板(含50 μ g/mL卡那霉素、7 μ g/mL庆大霉素、10 μ g/mL四环素、100 μ g/mL X-gal和40 μ g/mL IPTG)，37°C培养24-48小时，检查平板上的蓝白斑，将白色菌落重新划线在一个新鲜的LB培养基平板(含50 μ g/mL卡那霉素、7 μ g/mL庆大霉素、10 μ g/mL 四环素、100 μ g/mL X-gal 和 40 μ g/mL IPTG)，37°C培养 24-48 小时，取白色菌落，即为含有重组杆状病毒质粒(又称HaBac Δ egt-HaJHAMTRNAi bacmid)的菌落。
[0057]Hz8 Zl egt Bacmic^PHaBacAegt-HaJHAMTRNAi bacmid 的 PCR 鉴定电泳图见图3，采用对应 Hz8」egt Bacmid 的引物(5，-CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG-3’)和对应所述回文片段的引物(5’-TTCGCGAATGATCATCATTGT-3，)组成的引物对，HaBac Δ egt-HaJHAMTRNAibacmid显示2.1kb左右的目的片段，Hz8 Zl egt Bacmid不显示所述目的片段。
[0058]实施例4、重组杆状病毒(出芽病毒粒子)的获得
[0059]一、重组杆状病毒(出芽病毒粒子)的获得
[0060]1、在35mm的小皿(装有含10%FBS的Grace’ s培养基)中接种5X IO5个棉铃虫HzAml细胞，27° C培养过夜，在生物安全柜中吸弃上清液，加入1ml Grace’ s培养基室温放置I小时。
[0061]2、将 5μ g HaBac Δ egt-HaJHAMTRNAi bacmid 和 10 μ I Lipofectin 分另 Ij 用Grace’ s培养基稀释至100 μ 1,然后将两者混合，每隔7min混匀一次，45min后，加入400 μ IGrace ’ s培养基，混匀。
[0062]3、取完成步骤I的小皿，吸弃上清液并加入步骤2得到的混合液，27° C培养30min (每151min摇匀小皿一次);然后加入40μ1 Grace’s培养基，混匀，27° C培养6小时；然后加入1mL含20%FBS的Grace’s培养基，混匀，27° C培养6天后收取上清液，即为重组杆状病毒(又称HaBac Δ egtHaJHAMTRNAi )的第一代病毒液。27° C培养6天的过程中，每天在荧光倒置显微镜下观察绿色荧光的生成情况，培养3天后的荧光照片见图4 (可以观察到绿色荧光，表示侵染成功)。
[0063]4、在25cm2的一次性培养瓶中按MOI=0.1的剂量用第一代病毒液感染棉铃虫HzAml细胞，27°C培养96小时后收集上清液，即为第二代病毒液。
[0064]5、在25cm2的一次性培养瓶中按MOI=0.1的剂量用第二代病毒液感染棉铃虫HzAml细胞，27°C培养96小时后收集上清液，即为第三代病毒液。
[0065]二、对照杆状病毒(出芽病毒粒子)的获得
[0066]用Hz8 Δ egt Bacmid 代替 HaBac Δ egt-HaJHAMTRNAi bacmid 进行步骤一，得到杆状病毒(又称HaBac Δ egt)的第一代病毒液、第二代病毒液和第三代病毒液。HaBac Δ egt的基因组的结构示意图见图2。
[0067]三、对照杆状病毒(出芽病毒粒子)的获得
[0068]将重组质粒pFBD-HaPH-opl66 代替重组质粒 pFBD-HaPH-opl66_HaJHAMTRNAi 进行实施例3，载体pFBD-HaPH的Tn7L和Tn7R位点之间包括Ha polh基因在内的DNA片段通过转座作用插入Hz8 Zl egt Bacmid的多角体蛋白基因位点(polyhedrin locus),得到重组杆状病毒质粒(又称HaBac Δ egt_A bacmid)。
[0069]用HaBac Δ egt_A bacmid 代替 HaBac Δ egt-HaJHAMTRNAi bacmid 进行步骤一，得到杆状病毒(又称HaBac Δ egt-A)的第一代病毒液、第二代病毒液和第三代病毒液。
[0070]实施例5、多角体包涵体的获得
[0071]一、HaBac Δ egtHaJHAMTRNAi 多角体包涵体的获得
[0072]1、棉铃虫养至3龄末，注射前放至冰上冻僵，用消毒的微量注射器取HaBac Δ egtHaJHAMTRNAi的第三代病毒液，在棉铃虫腹足倒数第二和第三之间注射入血淋巴中，每只棉铃虫注射5 μ 1，5天后棉铃虫液化死亡，收取虫尸。
[0073]2、将步骤I的虫尸捣碎后加入蒸馏水并搅匀，用3层纱布过滤并收集滤液，将滤液300g离心10min并收取上清液，将上清液进行3000g离心30min，收集沉淀(HaBac Δ egtHaJHAMTRNAi 多角体包涵体)。
[0074]二、HaBac Δ egt多角体包涵体的获得
[0075]用HaBac Δ egt的第三代病毒液代替HaBac Δ egtHaJHAMTRNAi的第三代病毒液，其它同步骤一，得到HaBac Δ egt多角体包涵体。
[0076]三、HaBac Δ egt-A多角体包涵体的获得
[0077]用HaBac Δ egt-A的第三代病毒液代替HaBac Δ egtHaJHAMTRNAi的第三代病毒液，其它同步骤一，得到HaBac Δ egt-A多角体包涵体。
[0078]实施例6、多角体包涵体的半致死剂量
[0079]分别将实施例5制备的HaBac Δ egtHaJHAMTRNAi多角体包涵体、HaBac Δ egt多角体包涵体和HaBac Δ egt-A多角体包涵体进行如下半致死剂量的检测:
[0080]1、挑选大小均一的二龄末棉铃虫幼虫，置于无菌的96孔板中，28°C恒温光照培养箱内饥饿培养16小时，让它们脱皮进入下一龄中。
[0081]2、将多角体包涵体用含有4g/100mL的蔗糖和lmg/mL食用亮蓝的无菌水稀释为IX IO6个多角体包涵体/mL、3X IO5个多角体包涵体/mL、lX IO5个多角体包涵体/mL、3 X IO4个多角体包涵体/mL或I X IO4个多角体包涵体/mL的悬液(用血球计数板计数多角体包涵体)。
[0082]3、将完成步骤I的棉铃虫幼虫分为五组，每组48头幼虫，分别用步骤2得到的悬液进行饲喂，从饲喂开始计时，IOmin内中肠变为蓝色的幼虫转入含有新鲜人工饲料的24孔板中，每天观察2次并统计死亡率直至所有供试幼虫死亡或者化蛹。进行三次重复实验。用Probit回归分析计算多角包涵体的半数致死浓剂量(LC5tl)及其标准误，比较两种病毒LC5tl之间的差异显著性。
[0083] HaBac Δ egtHaJHAMTRNAi多角体包涵体的半致死浓度为1.24X IO4个多角体包涵体/ml，标准差为0.49 X IO4个多角体包涵体/ml，95%置信区间为0.49-2.42 X IO4个多角体包涵体/ml。HaBac Δ egt多角体包涵体的半致死浓度为8.12X IO4个多角体包涵体/ml,标准差为1.16X IO4个多角体包涵体/ml, 95%置信区间为6.16-10.7X IO4个多角体包涵体/mlο两种多角体包涵体的半致死浓度有显著性差异(z=7.27，p〈0.05)。HaBacAegt-Af角体包涵体的半致死浓度与HaBac Δ egt多角体包涵体的半致死浓度一致。
[0084]4、取步骤3中死亡的棉铃虫，提取总RNA并反转录为cDNA，以cDNA为模板，采用ACTIN基因为内参基因，通过半定量PCR鉴定HaJHAMT基因的表达量。
[0085]用于鉴定ACTIN基因的引物如下:
[0086]上游引物:5，-CCTGGTATTGCTGACCGTATGC-3，；
[0087]下游引物:5’ -CTGTTGGAAGGTGGAGAGGGAA-3 ’。
[0088]用于鉴定HaJHAMT基因的引物如下:
[0089]上游引物:5，-GGGTACTCGCGCGCAACAACAA-3，；
[0090]下游引物:5，-ATCCTGCGAGTCAGGCTTCCG-3，。
[0091]PCR扩增产物的电泳图见图5。与饲喂HaBac Δ egt多角体包涵体的棉铃虫相比，饲喂HaBac Δ egtHaJHAMTRNAi多角体包涵体的棉铃虫体内HaJHAMT基因的表达量显著降低。
[0092]结果表明，所述回文片段表达的dsRNA可以促使HaJHAMT基因表达量下调，从而使杆状病毒的半致死浓度下降，大大提高杆状病毒对抗棉铃虫的致死效率。
【权利要求】
1.一种RNA分子，为如下(a)或(b): (a)序列表的序列7所不的RNA分子； (b)与序列表的序列7反向互补的RNA分子。
2.编码权利要求1所述RNA分子的DNA分子。
3.如权利要求2所述的DNA分子，其特征在于:所述DNA分子为如下I)或2)或3): O依次由DNA片段1、间隔区和DNA片段II组成的DNA分子；所述DNA片段I如序列表的序列6自5’末端第1-405位核苷酸所不；所述DNA片段II如序列表的序列6自5’末端第630-1034位核苷酸所示； 2)序列表的序列6所不的DNA分子； 3)序列表的序列2自5’末端第206至610位核苷酸所示的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述DNA分子的重组载体、重组杆状病毒、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
5.如权利要求4所述的重组载体，其特征在于:所述重组载体中，由opl66启动子和/或PlO启动子启动权利要求2或3所述DNA分子的表达。
6.如权利要求5所述的重组载体，其特征在于:所述重组载体中具有表达盒甲和表达盒乙；所述表达盒甲为用于表达权利要求2或3所述DNA分子的表达盒；所述表达盒乙为用于表达杆状病毒多角体蛋白的编码基因的表达盒。
7.如权利要求4所述重组杆状病毒，其特征在于:所述重组杆状病毒为出芽病毒粒子的形式或多角体包涵体的形式。
8.—种杀虫剂，其活性成分为抑制昆虫保幼激素甲基转移酶基因表达的物质。
9.抑制昆虫保幼激素甲基转移酶基因表达的物质在制备杀虫剂中的应用。
10.如权利要求8所述的杀虫剂，或如权利要求9所述的应用，其特征在于:所述“抑制昆虫保幼激素甲基转移酶基因表达的物质”为如下物质中的至少一种: (I )权利要求7所述重组杆状病毒； (II)权利要求4所述重组载体、重组杆状病毒、表达盒、转基因细胞系或重组菌； (III)权利要求5或6所述重组载体； (IV)权利要求2或3所述DNA分子； (V)权利要求1所述RNA分子。
【文档编号】C12N1/15GK103898112SQ201210576020
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2012年12月26日 优先权日:2012年12月26日
【发明者】朱祯, 王晓芳, 戴艳, 魏晓丽, 张磊 申请人:中国科学院遗传与发育生物学研究所