Slc24a5基因突变体及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及分离的编码SLC24A5突变体的核酸、分离的多肽、筛选易感眼皮肤白化病的生物样品的方法、筛选易感眼皮肤白化病的生物样品的系统以及用于筛选易感眼皮肤白化病的生物样品的试剂盒。其中，分离的编码SLC24A5突变体的核酸，与SEQ?ID?NO：1相比，具有选自下列的至少一种突变：c.591G>A和c.1361insT。通过检测这些突变体在生物样品中是否存在，可以有效地检测生物样品是否易感眼皮肤白化病。
【专利说明】SLC24A5基因突变体及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及SLC24A5基因突变体及其应用。具体地，本发明涉及分离的编码SLC24A5突变体的核酸、分离的多肽、筛选易感眼皮肤白化病的生物样品的方法、筛选易感眼皮肤白化病的生物样品的系统以及用于筛选易感眼皮肤白化病的生物样品的试剂盒。
【背景技术】
[0002]眼皮肤白化病(OCA)是一种异质的常染色体隐性遗传病，在全世界的流行率约为1:17000。此病表现为皮肤、头发和眼的黑色素减少或完全丧失，通常伴随着畏光、斜视、中毒或严重的视觉缺陷、眼球震颤等眼科症状。目前，已知的人类OCA的致病基因有非综合征型 OCA 基因(TYR, 0CA2, TYRPl 和 SLC45A2)和综合征型 OCA 基因(HPSl, AP3B1, HPS3, HPS4, HPS5, HPS6, DTNBPI, BL0C1S3, PLDN, LYST, MY05A, RAB27A 和 MLPH)，但仍有多个眼皮肤白化病患者可能由其他的未知基因致病。
[0003]因而，目前对眼皮肤白化病的研究仍有待深入。
【发明内容】
[0004]本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出人类眼皮肤白化病的新的致病基因及其突变。
[0005]本发明是基于发明人的下列工作而完成的:发明人通过全外显子组测序结合Sanger验证的方法确定了眼皮肤白化病的新的致病基因及致病突变。
[0006]根据本发明的第一方面，本发明提出了一种分离的编码SLC24A5突变体的核酸。根据本发明的实施例，与SEQ ID NO:1相比，该核酸具有选自下列的至少一种突变:c.591G>A和c.1361insT。根据本发明的实施例，发明人确定了多个SLC24A5基因的突变体，这些突变体与眼皮肤白化病的发病密切相关，从而通过检测这些突变体在生物样品中是否存在，可以有效地检测生物样品是否易感眼皮肤白化病。
[0007]根据本发明的第二方面，本发明提出了一种分离的多肽。根据本发明的实施例，与SEQ ID N0:2相比，该分离的多肽具有选自下列的至少一种突变:P.W197X和p.L454Ffs31X。根据本发明的一些具体示例，该多肽是由前述分离的编码SLC24A5突变体的核酸编码的。通过检测生物样品中是否表达该多肽，可以有效地检测生物样品是否易感眼皮肤白化病。
[0008]根据本发明的第三方面，本发明提出了一种筛选易感眼皮肤白化病的生物样品的方法。根据本发明的实施例，该筛选易感眼皮肤白化病的生物样品的方法包括以下步骤:从生物样品提取核酸样本；确定核酸样本的核酸序列；该核酸样本的核酸序列或其互补序列与SEQ ID NO:1相比，具有选自c.591G>A和c.1361insT的至少一种突变是生物样品易感眼皮肤白化病的指示。通过根据本发明实施例的筛选易感眼皮肤白化病的生物样品的方法，可以有效地筛选易感眼皮肤白化病的生物样品。
[0009]根据本发明的第四方面，本发明提出了一种筛选易感眼皮肤白化病的生物样品的系统。根据本发明的实施例，该筛选易感眼皮肤白化病的生物样品的系统包括:核酸提取装置，该核酸提取装置用于从生物样品提取核酸样本；核酸序列确定装置，该核酸序列确定装置与核酸提取装置相连，用于对核酸样本进行分析，以便确定核酸样本的核酸序列；判断装置，该判断装置与核酸序列确定装置相连，以便基于核酸样本的核酸序列或其互补序列与SEQ ID NO:1相比，是否具有选自c.591G>A和c.1361insT的至少一种突变，判断生物样品是否易感眼皮肤白化病。利用该系统，能够有效地实施前述筛选易感眼皮肤白化病的生物样品的方法，从而可以有效地筛选易感眼皮肤白化病的生物样品。
[0010]根据本发明的第五方面，本发明提出了一种用于筛选易感眼皮肤白化病的生物样品的试剂盒。根据本发明的实施例，该用于筛选易感眼皮肤白化病的生物样品的试剂盒包括:适于检测SLC24A5基因突变体的试剂，其中与SEQ ID NO:1相比，SLC24A5基因突变体具有选自c.591G>A和c.1361insT的至少一种突变。利用根据本发明的实施例的试剂盒，能够有效地筛选易感眼皮肤白化病的生物样品。
[0011]本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
【专利附图】
【附图说明】
[0012]本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中:
[0013]图1:显示了根据本发明实施例的筛选易感眼皮肤白化病的生物样品的系统及其组成部分的示意图，其中，A为根据本发明实施例的筛选易感眼皮肤白化病的生物样品的系统的示意图，B为根据本发明实施例的核酸提取装置的示意图，C为根据本发明实施例的核酸序列确定装置的示意图；
[0014]图2:显示了根据本发明实施例的一个非综合征型OCA (0CA6)患者家系的家系图谱；
[0015]图3:显示了图2所示的非综合征型OCA (0CA6)患者家系中先证者及其哥哥的临床诊断结果图；
[0016]图4:显示了根据本发明一个实施例，对图2所示的非综合征型OCA (0CA6)患者家系中先证者及其父母和哥哥的SLC24A5基因突变位点c.1361insT和c.591G>A的Sanger测序验证峰图；
[0017]图5:显示了根据本发明一个实施例，图2所示的非综合征型OCA (0CA6)患者家系中先证者及其父母和哥哥，以及家系外正常人的头发真黑素测定结果；
[0018]图6:显示了免疫印迹法测定的HPS突变体小鼠模型pa、ru、印和pe，以及野生对照B6的SLC24A5蛋白稳态水平结果；
[0019]图7:显示了根据本发明一个实施例，图2所示的非综合征型OCA (0CA6)患者家系中先证者及其哥哥的皮肤组织病理学检验结果。
【具体实施方式】
[0020] 下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
[0021]SLC24A5基因突变体
[0022]根据本发明的第一方面，本发明提出了一种分离的编码SLC24A5突变体的核酸。根据本发明的实施例，与SEQ ID NO:1相比，该核酸具有选自下列的至少一种突变:c.591G>A和c.1361insT，优选地，该核酸同时具有c.591G>A和c.1361insT突变。在本文中所使用的表达方式“编码SLC24A5突变体的核酸”，是指与编码SLC24A5突变体的基因相对应的核酸物质，即核酸的类型不受特别限制，可以是任何包含与SLC24A5突变体的编码基因相对应的脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于DNA、RNA或cDNA。此外，需要说明的是，“c.591G>A”表示cDNA序列的第591位碱基由G突变为A ;“c.1361insT”表示在cDNA序列的第1361位碱基后插入T，而cDNA序列的第1354位碱基至第1361位碱基均为T，因此该突变也可以被表示为c.1354insT、c.1355insT….或c.1360insT,由此，在本文中，c.1361insT 突变可以表示 c.1354insT、c.1355insT…..或 c.1361insT 突变。
[0023]根据本发明 的一个具体示例，前面所述的编码SLC24A5突变体的核酸为DNA。根据本发明的实施例，发明人确了多个SLC24A5基因的突变体，这些突变体与眼皮肤白化病的发病密切相关，从而通过检测这些突变体在生物样品中是否存在，可以有效地检测生物样品是否易感眼皮肤白化病，也可以通过检测这些突变体在生物体中是否存在，可以有效地预测生物体是否易感眼皮肤白化病。
[0024]这些编码SLC24A5突变体的核酸，是本申请的发明人通过全外显子组测序结合Sanger验证的方法，针对患者样本进行测序，确定的眼皮肤白化病的新的致病基因。
[0025]需要说明的是，野生型SLC24A5基因的cDNA序列如下所示:
[0026]ATGCAGACAAAAGGGGGCCAAACATGGGCGAGAAGGGCTCTGTTGCTCGGCATC CTGTGGGCCACTGCACATCTGCCTCTCTCAGGGACCTCCCTGCCCCAACGTCTCCCAA GGGCCACAGGAAATAGCACCCAATGTGTTATTTCTCCATCATCGGAGTTTCCCGAAGG GTTTTTCACGAGACAGGAGCGCAGAGATGGAGGCATCATAATCTATTTCCTAATTATC GTTTACATGTTCATGGCCATATCTATTGTCTGTGATGAATACTTCCTACCCTCCCTGGA AATCATCAGTGAATCCCTTGGATTGTCTCAGGATGTTGCAGGCACAACTTTCATGGCA GCGGGCAGTTCAGCTCCTGAATTAGTTACTGCTTTCCTAGGTGTATTTATCACAAAGG GAGATATTGGCATTAGCACCATCCTTGGATCTGCAATTTATAATCTCCTTGGCATCTGT GCTGCCTGTGGTTTGCTATCTAATACGGTCTCAACACTATCATGTTGGCCCCTATTCAG AGACTGTGCAGCGTACACAATTAGTGCAGCAGCAGTTCTTGGTATAATATATGACAAC CAAGTTTACTGGTATGAAGGGGCTTTACTGCTTTTGATATATGGATTGTATGTTTTGGT GCTGTGTTTTGACATTAAAATTAACCAATATATTATAAAGAAATGCAGTCCTTGCTGC GCCTGTCTTGCCAAAGCTATGGAGAGAAGTGAACAACAGCCACTGATGGGCTGGGAA GATGAAGGTCAACCATTCATTCGTCGGCAATCAAGAACTGATAGTGGAATATTTTATG AAGATTCTGGCTACTCTCAGCTCTCTATAAGTTTACATGGCCTTAGTCAGGTTTCTGAA GATCCACCAAGTGTTTTCAACATGCCTGAAGCAGACTTAAAAAGAATTTTTTGGGTAT TATCCCTTCCTATTATTACATTACTTTTTCTAACCACACCAGATTGTAGAAAAAAGTTT TGGAAAAACTACTTTGTGATAACCTTTTTCATGTCTGCAATATGGATATCCGCATTTAC ATATATCCTGGTTTGGATGGTCACAATAACTGGGGAAACACTAGAAATTCCCGATACA GTAATGGGCCTTACTTTATTAGCAGCAGGAACAAGCATACCAGACACAATTGCAAGT GTGTTGGTTGCAAGAAAAGGGAAAGGAGATATGGCTATGTCTAACATCGTGGGATCC AATGTGTTTGATATGTTGTGCCTTGGTATTCCATGGTTTATTAAAACTGCATTTATAAA TGGATCAGCTCCTGCAGAAGTAAACAGCAGAGGACTAACTTACATAACCATCTCTCTC AACATTTCAATTATTTTTCTTTTTTTAGCAGTTCACTTCAATGGCTGGAAACTAGACAG AAAGTTGGGAATAGTCTGCCTATTATCATACTTGGGGCTTGCTACATTATCAGTTCTAT ATGAACTTGGAATTATTGGAAATAATAAAATAAGGGGCTGTGGAGGTTGA (SEQID NO:1),
[0027]其编码的氨基酸序列如下所示:
[0028]MQTKGGQTWARRALLLGILWATAHLPLSGTSLPQRLPRATGNSTQCVISPSSEFPEGFF TRQERRDGGIIIYFLIIVYMFMAISIVCDEYFLPSLEIISESLGLSQDVAGTTFMAAGSSAPEL VTAFLGVFITKOHGISTILGSAIYNLLGICAACGLLSNTVSTLSCWPLFRDCAAYTISAAAV LGllYDNQVYffYEGALLLLIYGLYVLVLCFDIKINQYIIKKCSPCCACLAKAMERSEQQPL MGWEDEGQPFIRRQSRTDSGIFYEDSGYSQLSISLHGLSQVSEDPPSVFNMPEADLKRIFff VLSLPIITLLFLTTPDCRKKFffKNYFVITFFMSAIffISAFTYILVWMVTITGETLEIPDTVMGLTLLAAGTSIPDTIASVLVARKGKGDMAMSNIVGSNVFDMLCLGIPWFIKTAFINGSAPAEV NSRGLTYITISLNISIIFLFLAVHFNGWKLDRKLGIVCLLSYLGLATLSVLYELGIIGNNKIRG CGG (SEQ ID NO:2)。
[0029]发明人通过对一名OCA患者进行外显子组测序和Sanger验证，鉴定出SLC24A5是非综合征型OCA的一个新的致病基因，并从该患者身上鉴定出两个致病突变:c.591G>A和c.1361insT。需要说明的是，在该患者的皮肤黑色素细胞中，可发现不成熟黑素体的明显增多和成熟黑素体数目的偏低，但由于没有观察到血小板致密颗粒的缺损，故可将该患者的病症排除在Hermansky-Pudlak综合征(HPS)-—种著名的综合征型OCA之外。此外,在带有BL0C-1和BL0C-2缺陷型的HPS突变小鼠身上，SLC24A5蛋白稳态水平下降，表明SLC24A5是一个新的非综合征型OCA基因，而且SLC24A5转运体是由HPS蛋白复合物转运至成熟黑素体中。因此，发明人确定SLC24A5是非综合征型眼皮肤白化病(在本中有时也称为“0CA6”)的新的致病基因。
[0030]进一步，发明人发现，当在SLC24A5基因突变体中同时出现c.591G>A和c.1361insT突变时，则眼皮肤白化病的易感性更高。通过检测这些具有多个突变位点的SLC24A5基因突变体在生物样品中是否存在，可以进一步有效地检测生物样品是否易感眼皮肤白化病，也可以通过检测这些突变体在生物体中是否存在，可以有效地预测生物体是否易感眼皮肤白化病。
[0031]根据本发明的第二方面，本发明提出了一种分离的多肽。根据本发明的实施例，与SEQ ID N0:2相比，该分离的多肽具有选自下列的至少一种突变:P.W197X和p.L454Ffs31X，优选地，该多肽同时具有p.W197X和p.L454Ffs31X突变。根据本发明的一些具体示例，该多肽是由前述分离的编码SLC24A5突变体的核酸编码的。其中，需要说明的是，发生在第6号外显子上的c.591G>A突变被预测为无义突变(p.W197X)，突变体的氨基酸序列为:
[0032]MQTKGGQTWARRALLLGILWATAHLPLSGTSLPQRLPRATGNSTQCVISPSSEFPEGFF TRQERRDGGIIIYFLIIVYMFMAISIVCDEYFLPSLEIISESLGLSQDVAGTTFMAAGSSAPEL VTAFLGVFITKGDIGISTILGSAIYNLLGICAACGLLSNTVSTLSCWPLFRDCAAYTISAAAV LGIIYDNQVY*(SEQ ID NO:3);而发生在第9号外显子上的插入突变c.1361insT导致生成截断蛋白(p.L454Ffs31X),突变体的氨基酸序列为:
[0033]MQTKGGQTWARRALLLGILWATAHLPLSGTSLPQRLPRATGNSTQCVISPSSEFPEGFF TRQERRDGGIIIYFLIIVYMFMAISIVCDEYFLPSLEIISESLGLSQDVAGTTFMAAGSSAPEL VTAFLGVFITKOHGISTILGSAIYNLLGICAACGLLSNTVSTLSCWPLFRDCAAYTISAAAV LGllYDNQVYffYEGALLLLIYGLYVLVLCFDIKINQYIIKKCSPCCACLAKAMERSEQQPL MGWEDEGQPFIRRQSRTDSGIFYEDSGYSQLSISLHGLSQVSEDPPSVFNMPEADLKRIFff VLSLPIITLLFLTTPDCRKKFffKNYFVITFFMSAIffISAFTYILVWMVTITGETLEIPDTVMGLTLLAAGTSIPDTIASVLVARKGKGDMAMSNIVGSNVFDMLCLGIPWFIKTAFINGSAPAEV NSRGLTYITISLNISIIFLFFSSSLQWLETRQKVGNSLPIIILGACYIISSI*(SEQ ID NO:4)，并且，利用 PROVEAN 算法(可参见http://provean.jcv1.0rg,通过参照将其全文并入本文)计算可知，上述两个截短体蛋白都被预测为对SLC24A5转运体的功能有害。通过检测生物样品中是否表达该多肽，可以有效地检测生物样品是否易感眼皮肤白化病，也可以通过检测这些多肽在生物体中是否存在，可以有效地预测生物体是否易感眼皮肤白化病。
[0034]筛选易感眼皮肤白化病的生物样品的方法
[0035]根据本发明的第三方面，本发明提出了一种筛选易感眼皮肤白化病的生物样品的方法。根据本发明的实施例，该筛选易感眼皮肤白化病的生物样品的方法可以包括以下步骤:[0036]首先，从生物样品提取核酸样本。根据本发明的实施例，生物样品的类型并不受特别限制，只要从该生物样品中能够提取到反映生物样品SLC24A5基因是否存在突变的核酸样本即可。根据本发明的实施例，生物样品可以为人体的任何组织。根据本发明的一些具体示例，优选地，生物样品为选自人体血液、皮肤、毛发和肌肉的至少一种。由此，可以方便地进行取样和检测，从而能够进一步提高筛选易感眼皮肤白化病的生物样品的效率。根据本发明的实施例，这里所使用的术语“核酸样本”应做广义理解，其可以是任何能够反映生物样品中SLC24A5基因是否存在突变的样本，例如可以是从生物样品中直接提取的全基因组DNA，也可以是该全基因组中包含SLC24A5基因编码序列的一部分，可以是从生物样品中提取的总RNA，也可以是从生物样品中提取的mRNA。根据本发明的一个实施例，所述核酸样本为全基因组DNA。由此，可以扩大生物样品的来源范围，并且可以同时对生物样品的多种信息进行确定，从而能够提高筛选易感眼皮肤白化病的生物样品的效率。另外，根据本发明的实施例，针对采用RNA作为核酸样本，从生物样品提取核酸样本可以进一步包括:从生物样品提取RNA样本，优选RNA样本为mRNA ；以及基于所得到的RNA样本，通过反转录反应，获得cDNA样本，所得到的cDNA样本构成核酸样本。由此，可以进一步提高利用RNA作为核酸样本筛选易感眼皮肤白化病的生物样品的效率。
[0037]接下来，在得到核酸样本之后，可以对核酸样本进行分析，从而能够确定所得到核酸样本的核酸序列。根据本发明的实施例，确定所得到核酸样本的核酸序列的方法和设备并不受特别限制。根据本发明的具体实施例，可以通过测序方法，确定核酸样本的核酸序列。根据本发明的实施例，可以用于进行测序的方法和设备并不受特别限制。根据本发明的实施例，可以采用第二代测序技术，也可以采用第三代以及第四代或者更先进的测序技术。根据本发明的具体示例，可以利用选自Hiseq2000、S0LiD、454和单分子测序装置的至少一种对核酸序列进行测序。由此，结合最新的测序技术,针对单个位点可以达到较高的测序深度，检测灵敏度和准确性大大提高，因而能够利用这些测序装置的高通量、深度测序的特点，进一步提高对核酸样本进行检测分析的效率。从而，能够提高后续对测序数据进行分析时的精确性和准确度。由此，根据本发明的实施例，确定核酸样本的核酸序列可以进一步包括:首先，针对所得到的核酸样本，构建核酸测序文库；以及对所得到的核酸测序文库进行测序，以便获得由多个测序数据构成的测序结果。根据本发明的一些实施例，可以采用选自HiSeq2000、S0LiD、454和单分子测序装置的至少一种对所得到的核酸测序文库进行测序。另外，根据本发明的实施例，可以对核酸样本进行筛选，富集目标区域序列即SLC24A5基因的c.591G>A和c.1361insT突变位点所在区域，该筛选富集可以在构建测序文库之前，构建测序文库过程中，或者构建测序文库之后进行。根据本发明的一个实施例，针对核酸样本，构建核酸测序文库进一步包括:利用SLC24A5基因突变位点特异性引物，对核酸样本进行PCR扩增；以及针对所得到的扩增产物，构建核酸测序文库。由此，可以通过PCR扩增，富集SLC24A5基因的c.591G>A和c.1361insT突变位点所在区域，从而能够进一步提高筛选易感眼皮肤白化病的生物样品的效率
[0038]关于针对核酸样本，构建测序文库的方法和流程，本领域技术人员可以根据不同的测序技术进行适当选择，关于流程的细节，可以参见测序仪器的厂商例如Illumina公司所提供的规程，例如参见 Illumina 公司 Multiplexing Sample Preparation Guide(Part#1005361;Feb2010)或 Paired-End SamplePrep Guide (Part#1005063 ;Feb2010)，通过参照将其并入本文。根据本发明的实施例，从生物样品提取核酸样本的方法和设备，也不受特别限制，可以采用商品化的核酸提取试剂盒进行。
[0039]需要说明的是，在这里所使用的术语“核酸序列”应作广义理解，其可以是在对核酸样本进行测序得到的测序数据进行组装后，得到的完整的核酸序列信息，也可以是直接采用通过对核酸样本进行测序所得到的测序数据(Reads)作为核酸序列，只要这些核酸序列中含有对应SLC24A5的编码序列即可。[0040]最后，在确定核酸样本的核酸序列之后，将所得到的核酸样本的核酸序列与SEQID NO:1的序列相比对。如果在所得到的核酸序列中具有选自c.591G>A和c.1361insT的至少一种突变，则指示生物样品易感眼皮肤白化病。由此，通过根据本发明实施例的筛选易感眼皮肤白化病的生物样品的方法，可以有效地筛选易感眼皮肤白化病的生物样品。根据本发明的实施例，对核酸序列与SEQ ID NO:1进行比对的方法和设备并不受特别限制，可以采用任意常规的软件进行操作，根据本发明的具体实例，可以采用SOAP软件进行比对。
[0041]需要说明的是，根据本发明实施例的“筛选易感眼皮肤白化病的生物样品的方法”的用途不受特别限制，例如可以用作非诊断目的的筛选方法。
[0042]筛选易感眼皮肤白化病的生物样品的系统和试剂盒
[0043]根据本发明的第四方面，本发明提出了一种能够有效实施上述筛选易感眼皮肤白化病的生物样品的方法的系统。
[0044]参考图1，根据本发明的实施例，该筛选易感眼皮肤白化病的生物样品的系统1000包括核酸提取装置100、核酸序列确定装置200以及判断装置300。
[0045]根据本发明的实施例，核酸提取装置100用于从生物样品提取核酸样本。如前所述，根据本发明的实施例，核酸样本的类型并不受特别限制，对于采用RNA作为核酸样本，则核酸提取装置进一步包括RNA提取单元101和反转录单元102，其中，提取单元101用于从生物样品提取RNA样本，反转录单元102与RNA提取单元101相连，用于对RNA样本进行反转录反应，以便获得cDNA样本,所得到的cDNA样本构成核酸样本。
[0046]根据本发明的实施例，核酸序列确定装置200与核酸提取装置100相连，用于对核酸样本进行分析，以便确定核酸样本的核酸序列。如前所示，可以采用测序的方法确定核酸样本的核酸序列。由此，根据本发明的一个实施例，所述核酸序列确定装置200可以进一步包括:文库构建单元201以及测序单元202。文库构建单元201用于针对核酸样本，构建核酸测序文库；测序单元202与文库构建单元201相连，用于对核酸测序文库进行测序，以便获得由多个测序数据构成的测序结果。如前所述，可以通过PCR扩增，富集SLC24A5基因的c.591G>A和c.1361insT突变位点所在区域，进一步提高筛选易感眼皮肤白化病的生物样品的效率。由此，文库构建单元201可以进一步包括PCR扩增模块(图中未示出)，在该PCR扩增模块中设置有SLC24A5基因突变位点特异性引物，以便利用SLC24A5基因突变位点特异性引物，对所述核酸样本进行PCR扩增，根据本发明的实施例，测序单元202可以包括选自HISEQ2000、S0LiD、454和单分子测序装置的至少一种。由此，结合最新的测序技术，针对单个位点可以达到较高的测序深度，检测灵敏度和准确性大大提高，因而能够利用这些测序装置的高通量、深度测序的特点，进一步提高对核酸样本进行检测分析的效率。从而，提高后续对测序数据进行分析时的精确性和准确度。
[0047]根据本发明的实施例，判断装置300与核酸序列确定装置200相连，适于将核酸样本的核酸序列进行比对，以便基于核酸样本的核酸序列与SEQ ID NO:1的区别判断生物样品是否易感眼皮肤白化病。具体地，基于核酸样本的核酸序列或其互补序列与SEQ ID NO:1相比，是否具有选自c.591G>A和c.1361insT的至少一种突变，判断生物样品是否易感眼皮肤白化病。如前所述，根据本发明的一个实施例，核酸样本的核酸序列或其互补序列与SEQID NO:1相比，具有选自c.591G>A和c.1361insT的至少一种突变，是生物样品易感眼皮肤白化病的指示。如前所述，根据本发明的实施例，对核酸序列或其互补序列与SEQ ID NO:1进行比对的设备并不受特别限制，可以采用任意常规的软件进行操作，根据本发明的具体实例，可以采用SOAP软件进行比对。
[0048]由此，利用该系统，能够有效地实施前述筛选易感眼皮肤白化病的生物样品的方法，从而可以有效地筛选易感眼皮肤白化病的生物样品。
[0049]根据本发明的第五方面，本发明提出了一种用于筛选易感眼皮肤白化病的生物样品的试剂盒。根据本发明的实施例，该用于筛选易感眼皮肤白化病的生物样品的试剂盒包括:适于检测SLC24A5基因突变体的试剂，其中与SEQ ID NO:1相比，该SLC24A5基因突变体具有选自c.591G>A和c.1361insT的至少一种突变。利用根据本发明的实施例的试剂盒，能够有效地筛选易感眼皮肤白化病的生物样品。在本文中，所使用的术语“适于检测SLC24A5基因突变体的试剂”应做广义理解，即可以是检测SLC24A5突变体编码基因的试剂，也可以是检测SLC24A5突变体多肽的试剂，例如可以采用识别特异性位点的抗体。根据本发明的一个实施例，所述试剂为核酸探针或引物。根据本发明的实施例，该引物可以具有SEQ ID NO:5-20所示的核苷酸序列，优选具有SEQ ID NO:13-14和SEQ ID NO:19-20所示的核苷酸序列，由此，可以高效地筛选易感眼皮肤白化病的生物样品。
[0050]需要说明的是，在本文前面筛选易感眼皮肤白化病的生物样品的方法部分中所描述的特征和优点，同样适用于筛选易感眼皮肤白化病的生物样品的系统或者试剂盒，在此不再赘述。
[0051]下面参考具体实施例，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。
[0052]若未特别指明，实施例中所采用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，可以参照《分子克隆实验指南》第三版或者相关产品进行，所采用的试剂和产品也均为可商业获得的 。未详细描述的各种过程和方法是本领域中公职的常规方法，所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。
[0053]实施例1OCA致病新基因确定及验证
[0054]首先，需要说明的是，本研究由中国科学院遗传与发育生物学研究所(IGDB)和首都医科大学北京同仁医院的生物伦理内部审查委员会(IRB)批准，并按照赫尔辛基宣言的原则开展。
[0055]一、外显子测序
[0056]样本采集:
[0057]首先，发明人从Chinese Albinism Registry 中(Wei et al., 2010;ffei etal.，2011，通过参 照将其全文并入本文)的179个不相关的OCA病人里筛选出I个分子机制未知的OCA患者。需要说明的是，目前在临床确诊的OCAl患者中，典型症状是患者的白色头发不随年纪改变；而OCAlB的表征是患者在出生时头发是白色的，而随后变为亮黄色或暗色。0CA2的表征是患者头发在出生时是黄色、棕色或金黄底色，随年龄增长颜色可能变得更深(Oetting et al.，2003，通过参照将其全文并入本文)。而由上述筛选获得的分子机制未知的OCA患者的诊断结果中可知，其能观察到白色皮肤、蓝色或棕色虹膜，以及温和或严重的眼球震颤。
[0058]发明人采集到上述筛选获得的分子机制未知的OCA患者及其父母和哥哥的外周血，并以收集到的120个中国汉族正常人为对照，进行以下实验。其中，在本文中，该患者也被称为“先证者”，其所在家系的家系图谱见图2。如图2所示，先证者为IV2。图3则显示了该非综合征型OCA (0CA6)患者家系中先证者及其哥哥的临床诊断结果图，其中左侧为先证者的诊断结果，右侧为其哥哥的临床诊断结果。参照图3，先证者(IV2)在3岁时被诊断为患有0CA2:出生时头发金黄，随着年龄增长发色变深成褐色(见图3A的左图)；其皮肤白化，虹膜透明且呈褐色(见图3B的左图)。此外，先证者还有轻微的眼球震颤和恐光症，其视敏度为20/100，且彩色眼底成像术结果表明其黄斑色素缺乏和发育不全(见图3C的左图)，进一步的光学相干断层成像术结果发现该黄斑中心凹缺失(见图3D的左图)。而先证者的哥哥则表现正常。此外，先证者病史调查发现无易出血倾向或者伴有紫癜的出血性特质；患者血小板、红细胞和白细胞数目在正常范围；其粒细胞、淋巴细胞和单核细胞所占百分比亦在正常范围；患者血清中的IgG、IgA、IgM、C3和C4含量均正常，包括活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)、凝血酶时间(TT)、D- 二聚体和纤维蛋白原检测在内的凝血测验均无发现异常；外周血中的微量金属元素(Cu、Zn、Ca、Mg和Fe)含量正常；其他血清和尿中的代谢物含量正常；体检中没有发现其他明显畸形。胸透和头部计算机断层扫描(CT)和腹部B超检查均都表现正常；没有发现有神经学的异常症状。并且，患者父母声称非近亲结婚，其双亲和同胞兄弟无任何OCA相关症状。综合上述信息，可判断先证者表现为非综合征型OCA。
[0059]首先，发明人利用常规蛋白酶K/SDS，从先证者及其父母和哥哥，以及120个中国汉族正常人对照的外周血中提取基因组DNA，作为样本。各样本的DNA浓度均在200ng/ μ I以上，总量均超过15 μ g，并质控为0D260/280均在1.8-2.0之间。
[0060]接着，按照Agilent SureSelect Human All Exon Kits 的程序对各样本进行外显子捕获，并按照Illumina的操作规范(可参见:http://www.1llumina.com/提供的Illumina/Solexa标准建库说明书,通过参照将其全文并入本文),利用Illumina SolexaHiSeq2000对捕获产物进行测序。其中，各样本的目标区域均大于50Mb，目标区域的平均深度超过50X，平均读长约IOObp。
[0061]然后，利用Burrows-Wheeler Aligner(BWA)程序,将测序数据与 UCSC Santa Cruzhgl8，build36.1的人参考基因组序列进行比对。结果发现，捕获特异性超过95%。接下来，发明人采用基于常染色体隐性突变模式的数据分析框架对测序比对结果进行分析，结果见表2。如表2所示，检出的变异包括SNP和Indel。其中，SNP和Indel的检测软件分别为SOAPsnp (Li et al.，2009，通过参照将其全文并入本文)和基因组分析软件包(GATK)(McKenna et al.，2010，通过参照将其全文并入本文)。接下来，针对检出的SNP和Indel变异，过滤掉功能不太重要的同义突变和位于3’ -UTR、5’ -UTR、内含子区和基因间区的变异，并将剩下的SNP和Indel与3个数据库，即dbSNP130、1000基因组数据库和HapMap数据库，进行比较，去掉数据库中的高频突变，然后将剩下的SNP和Indel根据基因型进行分类，用于后续分析。分析结果总结于表1和表2。
[0062]表1上述0CA6患者家系中先证者及其父母经检测及过滤的变异统计
[0063]
【权利要求】
1.一种分离的编码SLC24A5突变体的核酸，其特征在于，与SEQ ID NO:1相比，所述核酸具有选自下列的至少一种突变:c.591G>A和c.1361insT， 优选地，所述核酸同时具有c.591G>A和c.1361insT突变， 任选地，所述核酸为DNA。
2.一种分离的多肽，其特征在于，与SEQ ID NO:2相比，所述分离的多肽具有选自下列的至少一种突变:p.W197X 和 p.L454Ffs31X, 优选地，所述多肽同时具有P.W197X和p.L454Ffs31X突变， 任选地，所述多肽是由权利要求1所述的核酸编码的。
3.一种筛选易感眼皮肤白化病的生物样品的方法，其特征在于，包括以下步骤: 从所述生物样品提取核酸样本； 确定所述核酸样本的核酸序列； 所述核酸样本的核酸序列或其互补序列与SEQ ID NO:1相比，具有选自c.591G>A和c.1361insT的至少一种突 变是所述生物样品易感眼皮肤白化病的指示， 任选地，所述生物样品为选自人体血液、皮肤、毛发和肌肉的至少一种， 任选地，所述核酸样本为全基因组DNA。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，从所述生物样品提取核酸样本进一步包括: 从所述生物样品提取RNA样本，优选所述RNA样本为mRNA ；以及 基于所述RNA样本，通过反转录反应，获得cDNA样本，所述cDNA样本构成所述核酸样本。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，确定所述核酸样本的核酸序列进一步包括: 针对所述核酸样本，构建核酸测序文库；以及 对所述核酸测序文库进行测序，以便获得由多个测序数据构成的测序结果，任选地，采用选自Hiseq2000、S0LiD、454和单分子测序装置的至少一种对所述核酸测序文库进行测序， 任选地,针对所述核酸样本,构建核酸测序文库进一步包括: 利用SLC24A5基因突变位点特异性引物，对所述核酸样本进行PCR扩增；以及 针对所得到的扩增产物，构建所述核酸测序文库。
6.一种筛选易感眼皮肤白化病的生物样品的系统，其特征在于，包括: 核酸提取装置，所述核酸提取装置用于从所述生物样品提取核酸样本； 核酸序列确定装置，所述核酸序列确定装置与所述核酸提取装置相连，用于对所述核酸样本进行分析，以便确定所述核酸样本的核酸序列； 判断装置，所述判断装置与所述核酸序列确定装置相连，以便基于所述核酸样本的核酸序列或其互补序列与SEQ ID NO:1相比，是否具有选自c.591G>A和c.1361insT的至少一种突变，判断所述生物样品是否易感眼皮肤白化病。
7.根据权利要求6所述的系统，其特征在于，所述核酸提取装置进一步包括: RNA提取单元，所述RNA提取单元用于从所述生物样品提取RNA样本；以及 反转录单元，所述反转录单元与所述RNA提取单元相连,用于对所述RNA样本进行反转录反应，以便获得cDNA样本，所述cDNA样本构成所述核酸样本。
8.根据权利要求6所述的系统，其特征在于，所述核酸序列确定装置进一步包括: 文库构建单元，所述文库构建单元用于针对所述核酸样本，构建核酸测序文库；以及 测序单元，所述测序单元与所述文库构建单元相连，用于对所述核酸测序文库进行测序，以便获得由多个测序数据构成的测序结果， 任选地,所述文库构建单元进一步包括: PCR扩增模块，所述PCR扩增模块中设置有SLC24A5基因突变位点特异性引物，以便利用SLC24A5基因突变位点特异性引物，对所述核酸样本进行PCR扩增， 任选地，所述测序单元包括选自HISEQ2000、SOLiD,454和单分子测序装置的至少一种。
9.一种用于筛选易感眼皮肤白化病的生物样品的试剂盒，其特征在于，含有: 适于检测SLC24A5基因突变体的试剂，其中与SEQ ID NO:1相比，所述SLC24A5基因突变体具有选自c.591G>A和c.1361insT的至少一种突变。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂为核酸探针或引物， 任选地，所述引物 具有SEQ ID NO:5-20所示的核苷酸序列，
优选地，所述引物具有SEQ ID NO:13-14和SEQ ID NO: 19-20所示的核苷酸序列。
【文档编号】C12M1/00GK103923926SQ201310016429
【公开日】2014年7月16日 申请日期:2013年1月16日 优先权日:2013年1月16日
【发明者】戴兰兰, 刘轩竹, 李巍, 魏爱华 申请人:深圳华大基因研究院