专利名称：一种治疗乳腺癌的基因工程菌及其构建方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及癌症的治疗药物，具体涉及一种治疗乳腺癌的基因工程菌及其构建方法和应用。
背景技术：
乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一，其发病率高居女性肿瘤的首位。目前乳腺癌的治疗手段主要有手术、放疗、化疗和内分泌治疗等。因为乳腺癌属于对抗生素比较敏感的肿瘤，所以化疗在乳腺癌的综合治疗中一直起着重要的作用。乳腺癌的传统化疗药物主要有阿霉素、环磷酰胺、5-氟尿嘧啶等，这些药物虽然广泛用于乳腺癌的治疗，但由于其毒性及患者的耐药性等限制了这些药物的治疗效果。近年来，靶向治疗进入临床，主要药物有赫赛汀、酪氨酸激酶抑制剂、拉帕替尼以及帕妥珠单克隆抗体、贝伐珠单抗、黄酮吡多等，但由于患者的耐受性、药物本身的不稳定性和溶解性等物理性质以及靶点的缘故，靶向治疗只能适用于一部分患者。随着细菌以及病毒的靶向性和基因工程技术的发展，20世纪90年代中期以来，细菌治疗肿瘤的研究急速增多。研究发现鼠伤寒沙门氏菌在小鼠体内能够定向并有效地抑制肿瘤细胞的增长。沙门菌属是一群在人和动物肠道内寄生的革兰氏阴性、侵袭性细胞内兼性厌氧菌。VNP20009为msbB、pur I基因缺失的减毒鼠伤寒沙门菌株，遗传稳定，对抗生素敏感。msbB基因为脂质酰化为内毒素所必需，其缺失使类脂质A末端不能酰化，降低了毒性；purI基因参与嘌呤代谢，其缺失使细菌的繁殖需要外源性腺嘌呤。VNP20009还降低了自身诱导机体产生的肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF),降低了 VNP20009所引起的炎性反应。因此，它的低致病性提高了用于临`床治疗的安全性。VNP20009已被广泛用于肿瘤治疗研究，它可作用于多种小鼠实体瘤模型，包括黑色素瘤、肺癌、结肠癌、乳腺癌、肾癌、前列腺癌。VNP20009作为肿瘤基因治疗载体的一个主要优点是它能够高度靶向聚集于肿瘤部位。研究人员在多种实体肿瘤的小鼠模型中发现，VNP20009在肿瘤内的数量较肝脏等主要器官内高20(Γ1000倍。它利用一系列复杂的机制对肿瘤进行靶向作用。VNP20009能在肿瘤组织缺氧坏死区优先聚集并繁殖，相同时间内肿瘤组织内细菌的扩增代次显著高于正常组织，使得减毒沙门菌成为新型抗瘤制剂和肿瘤靶向治疗的载体成为可能。沙门菌导致肿瘤生长减慢可能机制包括:肿瘤生长所需要的营养物质为细菌所消耗。细菌所产生的酶，如天冬酰胺酶，可耗竭肿瘤生长必需氨基酸；细菌向胞外微环境分泌的局部毒素或者产生的肿瘤坏死因子α，都可影响肿瘤血管形成；此外，在细菌生长部位的非特异性炎症反应可潜在激活抗肿瘤T细胞。研究表明，沙门菌减毒株VNP2009是基因治疗比较理想的转移载体，虽然可以比较安全地应用且具有较高的允许剂量，但是单独运用没有强烈的抗肿瘤效果，还需联用其他药物。肿瘤细胞为了维持其高增殖率，需要足够的营养，除糖之外，对甲硫氨酸(Methionine, Met)、谷胺酰氨、精氨酸等需要量尤其大。研究证实Met依赖性是绝大多数肿瘤细胞的共同特征，如乳腺癌、肺癌、结肠癌、肾癌、膀胱癌、黑色素瘤、神经胶质瘤等，而正常细胞不存在Met依赖性。一些体内体外实验相继证实，直接食用甲硫氨酸缺乏的膳食可以延缓肿瘤细胞的增殖。但是若膳食中Met长期缺乏或不足，将会引起机体营养不良、代谢障碍，还可因DNA长期处于低甲基化状态加剧癌变。那么，通过甲硫氨酸酶(L-methioninase)特异性地将Met分解为α -酮丁酸、甲烧硫醇和氨树胶,从而降低体内甲硫氨酸水平，则能更加有效地抑制肿瘤细胞生长或使之消退。动物实验已表明经腹膜内注射甲硫氨酸酶可以抑制裸鼠的吉田肉瘤和肺肿瘤的增长。临床试验选四个分别患有乳腺癌、肺癌、肾癌和淋巴瘤的患者每24h静脉注射一次甲硫氨酸酶，发现甲硫氨酸酶可以明显减少血浆中甲硫氨酸含量。但是，由于哺乳动物本身不表达甲硫氨酸酶，所以外源性给入的方式往往引起机体的免疫反应。
发明内容
本发明所要解决的技术问题，是提供一种能够有效治疗乳腺癌的基因工程菌，该菌株安全无毒，且具备抗肿瘤活性，能够满足临床需求。本发明还要解决的技术问题，是提供上述基因工程菌的构建方法。本发明最后要解决的技术问题，是提供上述基因工程菌的应用。为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下:一种治疗乳腺癌的基因工程菌，该菌为克隆有甲硫氨酸酶(L-methioninase)基因的减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009。其中，所述的VNP20009内含有pSVSPORT质粒，所述的Lnethioninase基因克隆在pSVSPORT质粒上。上述治疗乳腺癌的基因工程菌的构建方法，将甲硫氨酸酶基因亚克隆至PUC57质粒，再通过Kpn I和Hind III酶切位点亚克隆至pSVSPORT质粒，得到pSVSPORT-L-methioninase 表达质粒，将 pSVSPORT-L-methioninase 表达质粒电转化至减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009，即得。其中，所述的电转化条件为电压2400V，电阻400Ω，电容25 μ F，放电时间4ms。上述治疗乳腺癌的基因工程菌在制备治疗乳腺癌药物中的应用。本发明提供的基因工程菌具有肿瘤靶向性，在肿瘤组织持续表达L-methioninase,大量消耗methionine及其它营养物质，使得肿瘤细胞缺乏营养，生长缓慢；同时，该菌本身可能激活caspase-3凋亡信号通路，导致宿主肿瘤细胞死亡，因此可以用于乳腺癌的治疗。有益效果:与现有技术相比，本发明的用于治疗乳腺癌的生物药物，是一种安全无毒具备抗肿瘤活性的新型生物药物，以减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009为载体，利用基因重组技术高表达甲硫氨酸酶，抗肿瘤活性强，能满足使用需求。制备方法简单，容易操作；具有很好的应用前景。
图1是质粒pSVSPORT-L-methioninase酶切鉴定1%琼脂糖凝胶电泳图；图2是Western鉴定methioninase表达结果图；图3是注射沙门菌对裸鼠体重的影响结果图4是瘤内注射沙门菌在裸鼠体内的分布结果图；图5是给沙门菌2周后肿瘤的大小结果图；图6是给沙门菌2周后肿瘤的重量结果图。图7是给予L_methioninase2周后肿瘤的大小结果图；图8是给予L_methioninase2周后肿瘤的重量结果图。
具体实施例方式根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。实施例1:基因工程菌的构建。
(I)构建表达L-methioninase基因的质粒。先合成L-methioninase (GenBank:L43133.1)基因亚克隆至 pUC57 质粒(金斯瑞公司)，接着通过Kpn I和Hind III酶切位点亚克隆至pSVSPORT质粒(invitrogen),得到pSVSPORT-L-methioninase表达质粒。具体构建过程如下:将pSVSPORT质粒用Kpn I和Hind III双酶切，酶切体系为:2 μ g质粒DNA，
3μ LlOXbuffer, 1.5μ L Kpn I 酶，1.5yL Hind III 酶，加入 ddH20 补足体积至 30 μ L，37°C温浴3h。然后将酶切体系在1%的琼脂糖凝胶中通过电泳分离，切出4.1kb大小的DNA条带，用胶回收纯化试剂盒纯化DNA。通过全基因合成得到L-methioninase编码区域DNA片段亚克隆至pUC57质粒(金斯瑞公司)，用Kpn I和Hind III双酶切，酶切体系为:3 μ g质粒DNA，3 μ LlOXbuffer，1.5yL Kpn I 酶，1.5yL Hind III 酶，加入 ddH20 补足体积至 30 μ L，37°C 温浴 3h。然后将酶切体系在1%的琼脂糖凝胶中通过电泳分离，切出1.2kb大小的DNA条带，用胶回收纯化试剂盒纯化DNA。将pSVSPORT (Kpn I/Hind III)和 L-methioninase 编码区域 DNA 片段(Kpn I/Hind III)连接，连接反应中加入2μ L载体、6μ L插入片段、I μ L T4DNA连接酶，16°C温浴16h。将连接产物转化到E.coli DH5a (Takara)的感受态细胞中。取一管50yL的DH5 α感受态细胞置于冰上，待其融化后，向其中加入5 μ L上述连接产物，轻弹混匀，后于冰上孵育30min ;42°C热击60s，后冰上静置2min ;加入500 μ L无抗性的LB液体培养基，37°C震荡培养Ih ;4000rpm离心5min，吸走，保留100 μ L左右的培养基，用移液器将细菌沉淀吹打均匀后涂布在含氨苄青霉素抗性的LB培养基平板上。然后将平板置于37°C温箱培养 16h。克隆生长出来后，挑单克隆菌落至3mL含氨苄青霉素的LB培养液中，37°C震荡培养16h，提取质粒DNA，用Kpn I和Hind III酶切鉴定，阳性克隆中可得到4.lkb、1.2kb的两条DNA条带，如图1所示。再通过测序进一步确定阳性克隆的序列完全正确。(2)构建 VNP20009-L_methioninase 菌株。将pSVSPORT 和 pSVSPORT-Liethioninase 表达质粒分别电转化至 VNP20009 菌株(YS1646),分别命名为VNP20009-V和VNP20009-M。具体构建过程如下:
将感受态细菌VNP20009置于冰上，待其融化后移入预冷电转杯，向其中加入2 μ L质粒，轻弹混匀，于冰上孵育lmin。将电转杯放入电转仪，条件设置为电压2400V，电阻400 Ω，电容25 μ F，放电时间4ms。电击完立刻加入ImL SOC培养基，轻轻混匀。37°C震荡培养Ih ；4000rpm离心5min，吸走，保留100 μ L左右的培养基，用移液器将细菌沉淀吹打均匀后涂布在含氨苄青霉素抗性的LB-O培养基平板上。然后将平板置于37°C温箱培养16h。VNP20009-V和VNP20009-M用LB-O培养后，提取质粒，酶切鉴定正确。取IXlO8沙门菌用蛋白裂解液提取蛋白，进行10%SDS_PAGE电泳，再稳压冰浴电转至PVDF膜，BSA室温封闭Ih后，TBST漂洗3X5min，加入兔抗Liethioninase抗体(I:1000)，4°C孵育过夜。TBST漂洗3次，每次5min再加HRP标记的抗兔二抗(1:10000), 温孵育lh，TBST漂洗3次，每次5min，ECL化学发光法显影。结果如图2所示，在分子量约43kD处有特异性条带，说明VNP20009-M与VNP20009-V相比，L-methioninase表达量显著提闻。实施例2:VNP20009-L-methioninase菌株的抗肿瘤效果。1、用含有10%胎牛血清的MEM培 养基培养MDA-MB-231乳腺癌细胞，以细胞数2X IO6个皮下接种于裸鼠右侧腋下。每隔2 3天，观察小鼠状态，用游标卡尺测量肿瘤大小(体积=0.52X长X宽2)。待肿瘤体积达到0.1 0.2cm3时，将荷瘤裸鼠随机分组:PBS组、VNP20009-V 组和 VNP20009-M 组。2、用 LB-O 培养 VNP20009-V 和 VNP20009-M，当 OD ^ 0.6 时，收集菌体，然后用 PBS重悬，以2X IO6CFU/只的剂量，采用瘤内注射方式给药，对照组注射同等体积PBS。给药后，观察裸鼠的活动、进食、体重。结果如图3所示，注射细菌后，小鼠体重未受影响。而且裸鼠的进食、粪便也无异常，说明VNP20009-V和VNP20009-M对裸鼠无明显毒性。3、给药后分别在第2、12d和20d，取裸鼠不同组织，加PBS研磨匀浆，梯度稀释后用LB-O平板培养过夜。结果如图4所示，组织匀浆菌落计数定量结果，瘤内注射细菌2d后，肿瘤组织中菌量为3X107CFU/g，而肝、肾等组织未检出细菌；12d后，肿瘤组织中菌量为6.3X107CFU/g，而肝组织为1.5X105CFU/g,比例约为400:1 ;20d后，肿瘤与其它组织菌量的比例约为4000:1 35000:1，说明VNP20009对于该种乳腺癌肿瘤有着较好的靶向性。4、每隔2-3d，测量肿瘤的长和宽，计算肿瘤体积，绘制裸鼠肿瘤体积变化曲线。给药后2周，对照组和实验组肿瘤大小出现明显差异，各组随机取3只，剥离裸鼠肿瘤，称重，拍照。结果如图5、6所示，给予沙门菌VNP20009-M后，肿瘤生长缓慢，体积和重量约为PBS组和VNP20009-V组的1/2，而VNP20009-V组与PBS组相比无显著性差异，说明高表达L-methioninase的VNP20009对于该种乳腺癌肿瘤具有显著的抑制效应。5、操作方法同上述1，将荷瘤裸鼠分为三组，同样采取瘤内注射的方式，分别给予PBS> L-methioninase lng/ 只、L-methioninaseIOOng/ 只，2 周以后剥离肿瘤、称重、拍照。结果如图7、8所示,三组之间肿瘤的大小和重量无显著性差异。L-methioninase lng/只的剂量等同于2X IO6CFU的VNP20009-M所含L-methioninase。由此可见，单纯给予等量，甚至100倍剂量的L-methioninase无明显的抗肿瘤效应。这说明随着L-methioninase的耗竭或降解，单次给药没有发挥作用，而以VNP20009为载体持续高表达L-methioninase则弥补了这个缺陷，表现出显著的抗肿瘤效应。
权利要求
1.一种治疗乳腺癌的基因工程菌，其特征在于，该菌为克隆有甲硫氨酸酶基因的减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009。
2.权利要求1所述的治疗乳腺癌的基因工程菌的构建方法，其特征在于，将甲硫氨酸酶基因亚克隆至PUC57质粒，再通过Kpn I和Hind III酶切位点亚克隆至pSVSPORT质粒，得到 pSVSPORT-L-methioninase 表达质粒，将 pSVSPORT-L-methioninase 表达质粒电转化至减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009，即得。
3.根据权利要求2所述的治疗乳腺癌的基因工程菌的构建方法，其特征在于，所述的电转化条件为电压2400V，电阻400 Ω，电容25 μ F，放电时间4ms。
4.权利要求1所述的 治疗乳腺癌的基因工程菌在制备治疗乳腺癌药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种治疗乳腺癌的基因工程菌，该菌为克隆有甲硫氨酸酶基因的减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009。本发明还公开了上述基因工程菌的构建方法和应用。本发明的用于治疗乳腺癌的生物药物，是一种安全无毒具备抗肿瘤活性的新型生物药物，以减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009为载体，利用基因重组技术高表达甲硫氨酸酶，抗肿瘤活性强，能满足使用需求。制备方法简单，容易操作；具有很好的应用前景。
文档编号C12N15/74GK103146626SQ20131006225
公开日2013年6月12日 申请日期2013年2月28日 优先权日2013年2月28日
发明者林艳, 周素瑾, 赵子建, 李晓曦, 于鹏丽, 李芳红 申请人:南京华贞生物医药科技有限公司