尿毒症外周血单个核细胞超保守区域转录表达基因模型的构建方法与应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及尿毒症外周血单个核细胞超保守区域转录表达基因模型的构建方法与应用，构建方法包括以下步骤：设置尿毒症组与正常对照组，每组包括若干份相异人体的已经脱离人体的全血标本，分别分离得到外周血单个核细胞；测定标本核糖核酸的含量、质量与完整性；采用超保守区域转录子芯片分析人体超保守区域转录子表达水平，检测基因特异性探针标记的超保守区域基因；进行核糖核酸标记和芯片杂交；分析获得的芯片扫描结果；过滤鉴定差异表达的潜在的超保守区域转录子及与其重叠超保守区域的核糖核酸转录子；比较尿毒症组与正常对照组中各标本间的倍数变化，筛选出表达差异的核糖核酸；选取表达差异超过预设差异阈值的核糖核酸构建基因模型。
【专利说明】尿毒症外周血单个核细胞超保守区域转录表达基因模型的构建方法与应用
【【技术领域】】
[0001]本发明涉及尿毒症领域，尤其涉及一种尿毒症外周血单个核细胞超保守区域转录表达的构建方法与应用。
【【背景技术】】
[0002]尿毒症(Uremia)并非一种单一疾病，而是由于肾功能衰竭致使代谢产物和其他有毒物质在体内蓄积而起的一种自身中毒综合症，是肾功能衰竭最严重的表现。有尿毒症的患者患心血管疾病的患病率和死亡率高出普通人的好几倍。在目前的临床实践中，对于诊断尿毒症，从临床症状，实验室检查或图像进行分析，当慢性肾功能衰竭的在终末期时，需要肾脏替代治疗法，如血液透析或肾移植，而肾脏替代治疗方面，仍然使用水溶性小分子物质测定作为指标，对尿毒症患者的预测性较差。
[0003]最近研究发现，在人、小鼠和大鼠基因中极度保守的长段非编码基因区域，命名为超保守区域(ultra-conserved regions, UCRs)。UCR为长约200~779bp的序列，最初于2004年由Bejerano发现。UCR常位于肿瘤相关的基因区域或脆性位点。UCR编码的一群特殊的非编码RNA (ncRNA),称为超保守区域转录子(transcribed ultraconservedregions, T-UCRs)，在人肿瘤中其表达发生变化。T-UCR是长链非编码核糖核酸(Long-noncoding RNA, IncRNA)重要组成部分,转录自人类基因组中481个极度保守区域(Ultraconserved regions),在白血病、肝癌、结肠癌、神经母细胞瘤等多种癌症中会改变表达模式。这表明，T-UCRs参与癌症生物学和肿瘤发生，并有可能作为疾病诊断，预后和预测的指标，以及一类新的治疗靶点。
[0004]但是，T-UCRs尚未有应用于尿毒症的研究。
【
【发明内容】
】
[0005]有鉴于此，有必要提出尿毒症外周血单个核细胞超保守区域转录表达的构建方法与应用。
[0006]本发明的一个技术方案是尿毒症外周血单个核细胞超保守区域转录表达基因模型的构建方法，其包括以下步骤:Si，设置尿毒症组与正常对照组，每组包括若干份相异人体的已经脱离人体的全血标本，分别分离得到外周血单个核细胞；S2，测定标本核糖核酸的含量、质量与完整性，确定可用，则执行下一步骤；S3，采用超保守区域转录子芯片分析人体超保守区域转录子表达水平，检测基因特异性探针标记的超保守区域基因；S4，进行核糖核酸标记和芯片杂交；S5，采用特征提取方法，分析获得的芯片扫描结果；S6，采用倍数变化方法过滤鉴定差异表达的潜在的超保守区域转录子及与其重叠超保守区域的核糖核酸转录子；S7，比较所述尿毒症组与所述正常对照组中各标本间的倍数变化，筛选出表达差异的核糖核酸；S8、选取表达差异超过预设差异阈值的核糖核酸构建基因模型。
[0007] 优选的，所述构建方法中，步骤S2中，采用全波长超微量分光光度计测定标本核糖核酸的含量与质量，采用琼脂凝胶电泳方法评估标本核糖核酸的完整性。
[0008]优选的，所述构建方法中，步骤S3中，在各超保守区域基因的两端分别添加Ikb的片段，然后用40bp的特异性探针标记。
[0009]优选的，所述构建方法中，步骤S4中，采用单色芯片基底基因表达分析方案进行核糖核酸标记和芯片杂交。
[0010]优选的，所述构建方法中，步骤S5中，过滤低强度表达的探针，将原始信号探针的强度进行归一化。
[0011]优选的，所述构建方法中，步骤S7中，设置所述倍数变化的阈值> 2.0。
[0012]优选的，所述构建方法中，步骤S8中，所述基因模型中，包括若干超保守区域转录子，并且，各所述超保守区域转录子均为外显子。
[0013]优选的，所述构建方法中，所述基因模型中，包括表达上调的21个超保守区域转录子以及表达下调的49个超保守区域转录子；其中，表达上调的21个超保守区域转录子包括 uc.1ll+、uc.16_、uc.162+、uc.166-、uc.189+、uc.208-、uc.209-、uc.221-、uc.234+、uc.285+、uc.290_、uc.324_、uc.33+、uc.341+、uc.342+、uc.455_、uc.477+、uc.61_、uc.77-、uc.90+以及uc.95+ ;表达下调的49个超保守区域转录子包括uc.101_、uc.102_、uc.138-、uc.141-、uc.144-、uc.151-、uc.166-、uc.173+、uc.185-、uc.186-、uc.203+、uc.208-、uc.209-、uc.210-、uc.233+、uc.266+、uc.267+、uc.268-、uc.276+、uc.280+、uc.28+、uc.282+、uc.313-、uc.338+、uc.341 +、uc.356+、uc.36+、uc.414-、uc.418-、uc.419-、uc.419+、uc.420_、uc.45_、uc.46_、uc.453_、uc.454_、uc.455_、uc.456+、uc.457_、uc.46-、uc.475+、uc.477+、uc.50-、uc.61+、uc.63-、uc.77-、uc.84-、uc.89+ 以及 uc.97+。
[0014]本发明的又一个技术方案是釆用任一上述构建方法所得到的尿毒症外周血单个核细胞超保守区域转录表达基因模型在获取尿毒症标志物的应用。
[0015]优选的，所述应用中，所述基因模型包括基因RBF0X2。
[0016]上述方案获得了外周血单个核细胞的T-UCRs的差异表达情况相关联的关键基因，可能作为尿毒症的潜在的生物标志物或是治疗靶点，并且由于标本量小而且结果的稳定性和准确性，对于临床方面的转录表达调控研究具有特别重要的意义。
【【专利附图】
【附图说明】】
[0017]图1是本发明一个实施例的示意图。
【【具体实施方式】】
[0018]为了便于理解本发明，下面结合附图和具体实施例，对本发明进行更详细的说明。附图中给出了本发明的较佳的实施例。但是，本发明可以采用许多不同的形式来实现，并不限于本说明书所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
[0019]除非另有定义，本说明书所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的【技术领域】的技术人员通常理解的含义相同。本说明书中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是用于限制本发明。本说明书所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。[0020]本发明旨在通过对尿毒症的单个核细胞的T-UCRs的表达水平研究，发现其临床病理特征，以及新的可能的诊断或预后生物标志物。如图1所示，本发明的一个实施例是，尿毒症外周血单个核细胞超保守区域转录表达基因模型的构建方法，其包括以下步骤:SI，设置尿毒症组与正常对照组，每组包括若干份相异人体的已经脱离人体的全血标本，分别分离得到外周血单个核细胞；S2，测定标本核糖核酸的含量、质量与完整性，确定可用，则执行下一步骤；S3，采用超保守区域转录子芯片分析人体超保守区域转录子表达水平，检测基因特异性探针标记的超保守区域基因；S4，进行核糖核酸标记和芯片杂交；S5，采用特征提取方法，分析获得的芯片扫描结果；S6，采用倍数变化方法过滤鉴定差异表达的潜在的超保守区域转录子及与其重叠超保守区域的核糖核酸转录子；S7，比较所述尿毒症组与所述正常对照组中各标本间的倍数变化，筛选出表达差异的核糖核酸；S8、选取表达差异超过预设差异阈值的核糖核酸构建基因模型。
[0021]又一个实施例是，尿毒症外周血单个核细胞超保守区域转录表达基因模型的构建方法，其包括以下步骤。
[0022]SI，设置尿毒症组与正常对照组，每组包括若干份相异人体的已经脱离人体的全血标本，分别分离得到外周血单个核细胞；
[0023]例如，本发明各实施例采用两组全血标本，采集时间为2011年I月-9月，分别来自15名尿毒症患者和15名健康正常对照组，对应作为尿毒症组与正常对照组。如表1所示，这两组全血标本均来自中国广西桂林第一八一医院，标本分离得到所需外周血单个核细胞后放置于_80°C保存。需要说明的是，标本收集的方案与执行，均获得广西代谢性疾病重点实验室和第一八一医院伦理委员会的批准。
[0024]表1尿毒症标本特征(n=15)
【权利要求】
1.尿毒症外周血单个核细胞超保守区域转录表达基因模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤: SI，设置尿毒症组与正常对照组，每组包括若干份相异人体的已经脱离人体的全血标本，分别分离得到外周血单个核细胞； S2，测定标本核糖核酸的含量、质量与完整性，确定可用，则执行下一步骤； S3，采用超保守区域转录子芯片分析人体超保守区域转录子表达水平，检测基因特异性探针标记的超保守区域基因； S4，进行核糖核酸标记和芯片杂交； S5，采用特征提取方法，分析获得的芯片扫描结果； S6，采用倍数变化方法过滤鉴定差异表达的潜在的超保守区域转录子及与其重叠超保守区域的核糖核酸转录子； S7，比较所述尿毒症组与所述正常对照组中各标本间的倍数变化，筛选出表达差异的核糖核酸； S8、选取表达差异超过预设差异阈值的核糖核酸构建基因模型。
2.根据权利要求1所述构建方法，其特征在于，步骤S2中，采用全波长超微量分光光度计测定标本核糖核酸的含量与质量，采用琼脂凝胶电泳方法评估标本核糖核酸的完整性。
3.根据权利要求2所述构建方法，其特征在于，步骤S3中，在各超保守区域基因的两端分别添加Ikb的片段，然后用40bp的特异性探针标记。
4.根据权利要求3所述构建方法，其特征在于，步骤S4中，采用单色芯片基底基因表达分析方案进行核糖核酸标记和芯片杂交。
5.根据权利要求4所述构建方法，其特征在于，步骤S5中，过滤低强度表达的探针，将原始信号探针的强度进行归一化。
6.根据权利要求5所述构建方法，其特征在于，步骤S7中，设置所述倍数变化的阈值^ 2.0。
7.根据权利要求6所述构建方法，其特征在于，步骤S8中，所述基因模型中，包括若干超保守区域转录子，并且，各所述超保守区域转录子均为外显子。
8.根据权利要求7所述构建方法，其特征在于，所述基因模型中，包括表达上调的21个超保守区域转录子以及表达下调的49个超保守区域转录子；其中， 表达上调的21个超保守区域转录子包括uc.1ll+、uc.16-、uc.162+、uc.166-、uc.189+、uc.208-、uc.209-、uc.221-、uc.234+、uc.285+、uc.290-、uc.324-、uc.33+、uc.341+、uc.342+、uc.455-、uc.477+、uc.61_、uc.77_、uc.90+ 以及 uc.95+ ； 表达下调的49个超保守区域转录子包括uc.101-、uc.102-、uc.138-、uc.141-、uc.144-、uc.151-、uc.166-、uc.173+、uc.185-、uc.186-、uc.203+、uc.208-、uc.209-、uc.210-、uc.233+、uc.266+、uc.267+、uc.268-、uc.276+、uc.280+、uc.28+、uc.282+、uc.313-、uc.338+、uc.341 +、uc.356+、uc.36+、uc.414-、uc.418-、uc.419-、uc.419+、uc.420_、uc.45_、uc.46_、uc.453_、uc.454_、uc.455_、uc.456+、uc.457_、uc.46_、uc.475+、uc.477+、uc.50-、u c.61+、uc.63-、uc.77-、uc.84-、uc.89+ 以及 uc.97+。
9.采用如权利要求1至8任一所述构建方法所得到的尿毒症外周血单个核细胞超保守区域转录表达基因模型在获取尿毒症标志物的应用。
10.根据权利要 求9所述应用，其特征在于，所述基因模型包括基因RBFOX2。
【文档编号】C12N5/0786GK103937879SQ201410093685
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2014年3月13日 优先权日:2014年3月13日
【发明者】眭维国, 戴勇, 曹翠辉, 薛雯 申请人:眭维国, 戴勇