一种高效扩增自体nk细胞的培养基及培养方法
【专利摘要】本发明涉及一种高效扩增自体NK细胞的培养基及培养方法。所述培养基内含有白细胞介素2(IL-2)、白细胞介素15(IL-15)、白细胞介素7(IL-7)、白细胞介素12(IL-12)、肿瘤坏死因子α（TNFα）和抗CD3抗体，可以高效扩增和活化NK细胞，从而获得大量高活性的以NK细胞为主的免疫细胞回输人体，在抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节相关疾病的治疗中具有显著疗效。根据本发明的高效扩增自体NK细胞的培养基及培养方法，其由细胞培养用培养基和添加于所述细胞培养用培养基的添加因子构成，用于大量培养扩增自体活化的NK细胞，其特征在于，所述添加因子包含有白细胞介素2(IL-2)、白细胞介素15(IL-15)、白细胞介素7(IL-7)、白细胞介素12(IL-12)、肿瘤坏死因子α（TNFα）和抗CD3抗体。
【专利说明】一种高效扩增自体NK细胞的培养基及培养方法
【技术领域】
[0001]本发明属于细胞生物学领域，特别涉及一种高效扩增自体NK细胞的培养基及培养方法。
【背景技术】
[0002]在我国恶性肿瘤已成为居民死亡原因的首位。肿瘤生物免疫疗法是手术、放疗和化疗之外的治疗手段，成为人类抗击肿瘤最有希望的措施之一。NK细胞过继性免疫疗法是肿瘤生物免疫治疗的一种，其原理是应用现代生物医学技术，对人体NK细胞在体外进行活化与扩增培养后回输，调整和激发机体抗肿瘤的免疫系统，从而杀伤肿瘤细胞。同时，NK细胞过继免疫疗法对病毒或细菌感染、免疫调节相关疾病以及抗衰老也有一定疗效。
[0003]NK细胞被认为是机体抗感染、抗肿瘤的第一道天然防线，是机体重要的免疫细胞，与抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节密切相关，NK细胞起源于骨髓来源的CD34+造血祖细胞，约占外周血淋巴细胞的5%-15%，免疫表型特点为⑶3TD16+⑶56+，主要分布于外周血、淋巴结、脾和骨髓，也可以在不同化学趋化因子作用下迁移到炎症部位。因细胞体积大、包浆量多、电镜下观察胞内含有致密颗粒，故又称为大颗粒淋巴细胞，可以通过分泌功能颗粒实现对靶细胞的杀伤。这些颗粒包括穿孔素和颗粒酶B，介导靶细胞凋亡和破坏胞内结构。NK细胞也能表达FasL和TRAIL，当与靶细胞上受体结合时，可以诱导靶细胞凋亡。NK细胞分泌TNF- α等细胞因子调节对靶细胞杀伤功能。NK细胞杀伤靶细胞不受MHC限制，也不需要预先与抗原接触致敏或显示任何记忆反应。其表面存在大量不同特异性和反应活性受体，通过和靶细胞的相应配体识别来激活NK细胞，产生细胞毒性作用。
[0004]因为NK细胞的种种特性，使其成为了过继免疫治疗研究和应用的热点。但是，这种具有高度杀伤癌细胞功能的N`K细胞只占正常外周血淋巴细胞的5% -15%，数量较少，如何获得大量高活性的NK细胞成为其制约临床应用的瓶颈。总体来说，目前国内细胞免疫治疗多以T细胞为主，NK细胞含量低，临床疗效有待提高，与国外技术相比有差距。其主要原因是NK细胞的培养工艺和培养基生产技术有待突破。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是解决上述现有技术中存在的问题。即，本发明目的是提供一种高效扩增自体NK细胞的培养基及培养方法。该培养基内含有白细胞介素2 (IL-2)、白细胞介素15(IL-15)、白细胞介素7 (IL-7)、白细胞介素12(IL-12)、肿瘤坏死因子a (TNF α )和抗CD3抗体，可以高效扩增和活化NK细胞，从而获得大量高活性的以NK细胞为主的免疫细胞回输人体，在抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节相关疾病的治疗中具有显著疗效。
[0006]本发明的目的是采用如下技术方案实现的:
一种高效扩增自体NK细胞的培养基，包括细胞培养用培养基和添加于所述细胞培养用培养基的添加因子，用于高效扩增自体NK细胞，所述添加因子包含白细胞介素2(IL-2)、白细胞介15(IL-15)、白细胞介素7 (IL-7)、白细胞介素12(IL-12)、肿瘤坏死因子α(TNFa )和抗CD3抗体。
[0007]进一步的，所述细胞培养用培养基含有175-1750 IU/ml白细胞介素2。
[0008]进一步的，所述细胞培养用培养基含有1(T100 ng/ml白细胞介素15。
[0009]进一步的，所述细胞培养用培养基含有1(T100 ng/ml白细胞介素7。
[0010]进一步的，所述细胞培养用培养基含有1(T100 ng/ml白细胞介素12。
[0011]进一步的，所述细胞培养用培养基含有1(T100 ng/ml肿瘤坏死因子α。
[0012]进一步的，所述细胞培养用培养基及培养方法采用10-100 μ g/ml抗⑶3抗体包被细胞培养瓶。
[0013]进一步的，所述细胞培养用培养基添加剂还包括5-20 ml来源于自体的血浆。
[0014]本发明的另一目的是通过以下技术方案实现的:
一种高效扩增自体NK细胞的培养方法，所述培养方法包括以下步骤:采集并分离患者40ml外周血的单个核细胞，用含10 %自身血浆的培养基重悬细胞，加入到用抗⑶3抗体包被的细胞培养瓶中，细胞因子组合IL-2、IL-7、IL-15、IL-12、TNFa刺激，置于37°C，5%C02的培养箱中孵育，4天后转瓶并补加含组合细胞因子的培养基，第6天转袋并补充含有IL-2的培养基继续培养6天，即可得到高活性的NK细胞。
[0015]本发明相比现有技术的有益效果是:
1、本发明所述培养基中添加`多种生物因子，可以高效扩增和活化NK细胞，从而获得大量高活性的以NK细胞为主的免疫细胞回输人体，在抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节相关疾病的治疗中具有显著疗效；
2、本发明所述NK细胞的培养方法安全、稳定，所需时间较短，大大提高了NK细胞的培养周期，有利于大规模生产；
3、使用本发明的方法扩增的NK细胞，抗肿瘤效果显著，实验表明得到的NK细胞对K562的杀伤率40:1效靶比时达到60%以上。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1为表示根据本发明的NK细胞的培养基及培养方法进行培养之后的免疫细胞数变化的示意图；
图2为表示根据本发明的NK细胞的培养基及培养方法进行培养之后的免疫细胞表型分析示意图；
图3为表示采用乳酸脱氢酶(LDH)释放法测定NK细胞对靶细胞K562的杀伤活性分析图。
【具体实施方式】
[0017]下面结合实施例来具体说明本发明的方法。但本发明并不受其限制。下面实施例中未注明具体条件的实验方法，均为遵照常规方法和厂家提供的操作说明执行。
[0018]实施例1
一种高效扩增自体NK细胞的培养基，包括细胞培养用培养基和添加于所述细胞培养用培养基的添加因子，用于高效扩增自体NK细胞，所述添加因子包含白细胞介素2(IL-2)、白细胞介15(IL-15)、白细胞介素7 (IL-7)、白细胞介素12(IL-12)、肿瘤坏死因子a(TNFa )和抗CD3抗体。
[0019]所述培养基可以是RPM1-1640培养基、X-VIVO无血清培养基或GT-T551培养基等常见细胞培养基。
[0020]进一步的，所述细胞培养用培养基含有175-1750 IU/ml白细胞介素2。
[0021]进一步的，所述细胞培养用培养基含有1(T100 ng/ml白细胞介素15。
[0022]进一步的，所述细胞培养用培养基含有1(T100 ng/ml白细胞介素7。
[0023]进一步的，所述细胞培养用培养基含有1(T100 ng/ml白细胞介素12。
[0024]进一步的，所述细胞培养用培养基含有1(T100 ng/ml肿瘤坏死因子α。
[0025]进一步的，所述细胞培养用培养基及培养方法采用10-100 μ g/ml抗⑶3抗体包被细胞培养瓶。
[0026]进一步的，所述细胞培养用培养基添加剂还包括5-20 ml来源于自体的血浆。
[0027]—种高效扩增自体NK细胞的培养方法，所述培养方法包括以下步骤:采集并分离患者40ml外周血的单个核细胞，用含10 %自身血浆的培养基重悬细胞，加入到用抗⑶3抗体包被的细胞培养瓶中，细胞因子组合IL-2、IL-7、IL-15、IL-12、TNFa刺激，置于37°C，5%C02的培养箱中孵育，4天后转瓶并补加含组合细胞因子的培养基，第6天转袋并补充含有IL-2的培养基继续培养6天，即可得到高活性的NK细胞。
[0028]本实施例所用的原料和试剂除特别说明外，均为市售可得。
[0029]实施例2:
本实施例是在实施例1的基础上的优选化方案，提供了一种高效扩增自体NK细胞的培养基及培养方法。本实施例中与实施例1相同的部分，请参照实施例1中公开的内容进行理解，实施例1公开的内容也应当作为本实施例的内容，此处不作重复描述。
[0030]本实施例的扩增自体NK细胞的培养方法为:
I)细胞刺激因子包被
⑶3mAb(10 ug/ml)用无菌PBS稀释，取5 mL加入到75 cm2细胞培养瓶内，轻磕，使液体铺满瓶底，然后将细胞培养瓶放平，置于室温条件下过夜，然后转入4 °C冰箱内保存待用。
[0031]2)外周血单个核细胞(PBMC)的制备
采集患者肝素抗凝外周血40 ml，将全血细胞混悬液小心注入事先加入的淋巴细胞分离液的淋巴细胞分离管内，2500 rpm/min离心15 min ;吸出最上层的血浆，置于56 °C的恒温水浴内灭活30 min, 3000 rpm/min离心5 min待用；吸取白膜层细胞到15 ml离心管内，无菌PBS加满离心管，2000 rpm/min离心10 min，弃上清；用PBS洗涤细胞两次后得到外周血单个核细胞。
[0032]3) NK细胞的诱导活化扩增
将75 cm2细胞培养瓶内包被液倒掉，上述得到的PBMC细胞重悬到50 ml加有组合细胞因子IL-2 (终浓度为1750 IU/ml)、IL-7 (终浓度为10 ng/ml)、IL-15 (终浓度为10 ng/ml)、IL-12 (终浓度为10 ng/ml),TNF α (终浓度为10 ng/ml)的培养基中，并加入5 ml自体血浆(10%),至温度37 V、CO2含量5%的细胞培养箱内培养；
培养4天，倒置显微镜下观察细胞生长状态，拍照；当细胞铺满培养瓶壁后，将75 cm2细胞培养瓶中的细胞轻轻震荡让其悬浮后，吹打混匀，细胞计数，直接倒入225 cm2细胞培养瓶中，然后再加入150 ml加有组合细胞因子IL-2 (终浓度为1750 IU/ml), IL-7 (终浓度为 10 ng/ml)、IL-15 (终浓度为 10 ng/ml)、IL_12 (终浓度为 10 ng/ml)、TNFa (终浓度为10 ng/ml)的培养基中，并加入5 ml自体血浆，至温度37 °C、CO2含量5%的细胞培养箱内培养；
培养2天后，倒置显微镜下观察细胞生长状态，拍照；当细胞铺满培养瓶壁后，将225cm2细胞培养瓶中的细胞悬液转移至含有IL-2 (175 U/mL) 1000 mL培养基的CO2透气培养袋中，同时再加入10 ml自体血浆，在37°C CO2细胞培养箱内继续培养；
培养6天后收获细胞，细胞计数，培养前后免疫细胞增殖变化数目如图1所示，由培养前的1-3X107增殖到3-5X109。至此，就可以获得活化扩增的自体NK细胞，满足临床免疫细胞治疗的需要。
[0033]4)活化扩增培养后免疫细胞表型分析
采用微量直接标记免疫荧光染色及流式细胞仪检测法进行分析。即培养收获的细胞悬液中加入CD3、CD4、CD8、CD56荧光标记单抗20 μ 1，室温孵育20 min, 1500 rpm/min离心
5min，弃上清液，用PBS洗涤2次，加1%甲醛0.5 ml, FACS流式细胞仪(BD公司)进行分析，每次样品收集IO6个细胞。对照组标本以同样方法制备。用Cell Quest软件解析数据。
[0034]如图2所示，培养后的细胞中⑶56+细胞占62.50%,其中⑶56+⑶3_的NK细胞占 34.45%, CD56+ CD3+的 NKT 细胞占 28.05%, CD3+ CD8+细胞和 CD4/CD8 结果用于参考。
[0035]5)活化扩增培养后NK免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤实验` 取传代细胞株K562细胞进行计数，制成I X IO5 cells/ml细胞悬液，加入96孔板，每孔50 μ I ;培养12天的NK细胞分别按照效:革巴=10:1、20:1、40:1加入96孔板中，同时设效应细胞和靶细胞自然释放孔，培养基自然释放孔，靶细胞最大释放孔，体积校正对照孔，每孔体积100 μ I，均设3个复孔，250g离心4 min，置于37 V、浓度为5%的CO2中孵育
4h ,在反应结束前45 min靶细胞最大释放孔每孔加入10 μ I裂解液。反应结束后,每孔吸取50 μ I上清与50 μ I LDH酶反应液置于另一新的96孔板，室温避光反应30 min，加入反应终止液50 μ 1，酶标仪检测其OD值。自然杀伤活性％ =(测定管OD值-靶细胞自然释放管OD值-效应细胞自然释放管OD值)/ (靶细胞最大释放管OD值-靶细胞自然释放管OD值)X 100 %。
[0036]结果如图3所示显示，图中的纵坐标为杀伤率，横坐标为不同效靶比，可见使用本发明的方法扩增的NK细胞对Κ562的杀伤率40:1效靶比时达到60%以上。
[0037]实施例3
本实施例是在实施例1的基础上的优选化方案，提供了一种高效扩增自体NK细胞的培养基。本实施例中与实施例1相同的部分，请参照实施例1中公开的内容进行理解，实施例1公开的内容也应当作为本实施例的内容，此处不作重复描述。所述培养方法请参照实施例2。
[0038]本实施例所用细胞培养用培养基为RPM1-1640培养基，所述培养基的组成为: RPM1-1640 培养基10 ml
白细胞介素2 (IL-2)20000 IU
白细胞介 I5GL-15)500 ng
白细胞介素7 (IL-7)500 ng白细胞介素12 (IL-12)500 ng
肿瘤坏死因子a (TNF α ) 500 ng。
【权利要求】
1.一种高效扩增自体NK细胞的培养基，包括细胞培养用培养基和添加于所述细胞培养用培养基的添加因子，其特征在于，所述添加因子包含白细胞介素2(IL-2)、白细胞介15(IL-15)、白细胞介素7 (IL-7)、白细胞介素12(IL-12)、肿瘤坏死因子a (TNFa)和抗CD3抗体。
2.如权利要求1所述的高效扩增自体NK细胞的培养基，其特征在于，所述细胞培养用培养基含有175-1750 IU/ml白细胞介素2。
3.如权利要求1所述的高效扩增自体NK细胞的培养基，其特征在于，所述细胞培养用培养基含有10-100 ng/ml白细胞介素15。
4.如权利要求1所述的高效扩增自体NK细胞的培养基，其特征在于，所述细胞培养用培养基含有10 "100 ng/ml白细胞介素7。
5.如权利要求1所述的高效扩增自体NK细胞的培养基，其特征在于，所述细胞培养用培养基含有10-100 ng/ml白细胞介素12。
6.如权利要求1所述的高效扩增自体NK细胞的培养基，其特征在于，所述细胞培养用培养基含有10-100 ng/ml肿瘤坏死因子a。
7.如权利要求1所述的高效扩增自体NK细胞的培养基，其特征在于，所述细胞培养用培养基及培养方法采用10-100 μ g/ml抗CD3抗体包被细胞培养瓶。
8.如权利要求1所述的高效扩增自体NK细胞的培养基，其特征在于，所述细胞培养用培养基添加剂还包括5-20 ml来源于自体的血浆。
9.一种如权利·要求1-8所述的高效扩增自体NK细胞的培养基，其特征在于，所述培养基为: 细胞培养用培养基IOml 白细胞介素2(IL-2)17500IU 白细胞介 I5GL-15)IOOng 白细胞介素7 (IL-7)100 ng 白细胞介素12(IL-12)IOOng 肿瘤坏死因子a (TNF a ) 100 ng。
10.一种高效扩增自体NK细胞的培养方法，所述培养方法包括以下步骤:采集并分离患者40 ml外周血的单个核细胞，用含10 %自身血浆的培养基重悬细胞，加入到用抗⑶3抗体包被的细胞培养瓶中，细胞因子组合11-2、11^-7、11^-15、11^-12、了即(1刺激，置于37°C、5%C02的培养箱中孵育，4天后转瓶并补加含所述细胞因子组合的培养基，第6天转袋并补充含有IL-2的培养基继续培养6天，即可得到高活性的NK细胞。
【文档编号】C12N5/0783GK103849599SQ201410099607
【公开日】2014年6月11日 申请日期:2014年3月18日 优先权日:2014年3月18日
【发明者】吴海涛, 周丽丽 申请人:加思葆（北京）医药科技有限公司