一种纳豆枯草芽孢杆菌以及由该菌株提纯维生素甲萘醌-7的方法
【专利摘要】本发明提供了一种纳豆枯草芽孢杆菌（Bacillus?subtilis?natto）ST188，CGMCC?No.8400以及一种用该菌株提纯高纯度的维生素甲萘醌-7的高收率方法。该方法包括以下步骤：1）将所述纳豆菌发酵液喷雾干燥，用溶剂提取或浸溶纳豆菌发酵液喷干粉，获得浸溶液；2）将步骤1）获得的浸溶液浓缩得到浸膏；3）将步骤2）获得的浸膏通过柱层析，并进行梯度或等度洗脱，收集液浓缩，得到甲萘醌-7粗品；4）将步骤3）得到的甲萘醌-7粗品结晶提纯，即得所述维生素甲萘醌-7纯品。
【专利说明】一种纳豆枯草芽孢杆菌以及由该菌株提纯维生素甲萘醌-7的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种纳豆枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis natto) ST188, CGMCCN0.8400，以及由该菌株提纯维生素甲萘醌-7的方法。
【背景技术】
[0002]由于维生素K具有促进凝血的作用，又被称为凝血维生素。近半个世纪以来，人们对维生素K的认识仅限于其对凝血系统的影响，直到1960年Bouckaert发现维生素K可以促进兔子的骨折愈合。1975年，Pettifor等首次提出维生素K参与人体骨代谢的假说之后，人们对维生素K在骨骼新陈代谢的作用才有了深入的认识。
[0003]维生素K族包括数个脂溶性的2-甲基-1，4-萘醌衍生物。天然的维生素K包括维生素Kl (即叶绿醌)和维生素K2 (即甲萘醌类)，其以在2-甲基-1，4-萘醌环状结构的3号位置上的亲脂性侧链为特征。叶绿醌的侧链是确定长度的不饱和烃链，甲萘醌的侧链则是不确定长度的不饱和烃链。(维生素Kl即叶绿醌为一种化合物，维生素K2为一系列化合物)
[0004]维生素K2不单有促进凝血、改善动脉硬化的作用，国外也有作者在研究其对肝癌和白血病的作用。现在我国已进入老龄化社会，骨质疏松患者发病率较高。大量资料研究表明，维生素K2缺乏可导致老年人髋骨骨折和骨密度降低。维生素K2缺乏，血清未羧化骨钙蛋白水平降低，血清羧化骨钙蛋白水平也可能降低，从而可能导致老年人骨密度降低发生髋骨骨折危险。
[0005]维生素K2作为一种营养物质，并可以作为骨代谢调整物质，覆盖全身的作用；副作用较少，呈脂溶性，可以饭后服用，不论什么年龄都适宜使用。(邹志强，维生素K2的研究进展，中国骨质疏松杂志，2005，11 (3) =389-392)
[0006]1995年日本开始将维生素K2制剂作为改善骨量减少、疼痛的骨质疏松症的药物销售。(王理明，维生素K2与骨质疏松，2007，26 (4):293-295)
[0007]维生素K2 (2-甲基-3-全反式-聚戊烯-1，4-萘醌)或甲萘醌类是一族异戊烯基衍生物。由5个碳原子组成的异戊二烯残基的数量可用于区分甲萘醌系化合物。其命名规则是基于异戊二烯基的数量，例如“甲萘醌”或“MK”之后加上基团的数量。尽管甲萘醌侧链上已经被发现最多达到15个异戊二烯基，但在人类和动物组织中出现的只有含有2到13个异戊二烯基的甲萘醌。脱甲基化的甲萘醌，即在2号碳原子位点上未结合的甲萘醌也已经被发现。
[0008]维生素K2的一般性名称或常用名为甲萘醌，其基本成分为甲萘醌-4 (MK-4)和甲萘醌-7 (MK-7)。已知MK-7是活性最强的维生素K2中的一种。
[0009]叶绿醌及2种常见的甲萘醌结构图如下所示。
[0010]维生素Kl
[0011]分子量:450[0012]
【权利要求】
1.一种提纯维生素甲萘醌-7的方法，该方法包括以下步骤: 1)将纳豆菌发酵液喷雾干燥，用溶剂提取或浸溶纳豆菌发酵液喷干粉，获得浸溶液，所述纳豆菌为纳豆枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis natto) ST188,保藏号为:CGMCCN0.8400 ； 2)将步骤I)获得的浸溶液浓缩得到浸膏； 3)将步骤2)获得的浸膏通过柱层析，并进行梯度或等度洗脱，将收集液浓缩，得到甲萘醌-7粗品； 4)将步骤3)得到的甲萘醌-7粗品结晶提纯，即得所述维生素甲萘醌-7纯品。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤I)中，将纳豆菌发酵液喷雾干燥前，向所述纳豆菌发酵液中添加0.1-1重量％的大豆油。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤3)中，所述柱层析的方法包括:首先将步骤2)获得的所述浸膏以湿法上柱脱色，并以第一淋洗剂洗脱；然后将脱色后的产物以湿法干法混合上柱方式进行纯化，即先以湿法装柱，再将脱色后的产物以干法装柱的方式装填于湿法装柱的上层，并以第二淋洗剂洗脱，其中湿法干法混合上柱的柱中，所述湿法装柱与所述干法装柱的体积比为1: 0.2-2。
4.根据权利要求1所述 的方法，其中，在步骤I)中，所述提取或浸溶条件包括:将纳豆菌发酵液喷干粉与溶剂按1: 3-8的质量比混合，在15-40°C的温度下，以20-60rpm搅拌速率搅拌20-40min，固液分离，所得清液即为浸溶液。
5.根据权利要求1-4中任意一项所述的方法，其中，在步骤I)中，所述溶剂选自甲醇、石油醚、丙酮、二氯甲烷、三氯甲烷、异丙醇、乙酸乙酯、乙酸丁酯和75-100体积％乙醇中的一种或多种。
6.根据权利要求1-4中任意一项所述的方法，其中，在步骤2)以及步骤3)中，所述浓缩为减压浓缩，所述减压浓缩的条件包括:温度为40-95°C，真空度小于3000Pa。
7.根据权利要求3所述的方法，其中，将步骤2)获得的所述浸膏以湿法上柱脱色包括:将硅胶和石油醚按1: 1.5-2质量比混匀后装柱，再将步骤2)获得的浸膏和石油醚按I: 0.5-1质量比混匀后上柱。
8.根据权利要求3或7所述的方法，其中，所述第一淋洗剂为非极性溶剂，优选为石油醚、正己烷和环己烷中的一种或多种；所述第一淋洗剂的用量为层析柱体积的2-3倍。
9.根据权利要求3所述的方法，其中，将脱色后的产物以湿法干法混合上柱方式进行纯化包括:先将硅胶和石油醚以1: 1.5-2的质量比混匀后装柱；再将所述脱色后的产物与硅胶和石油醚以1: 3-4:4-5的质量比混合、阴干后装填在先以湿法装填的柱中。
10.根据权利要求3或9所述的方法，其中，所述第二淋洗剂选自石油醚、体积比为I: 9的二氯甲烷和石油醚的混合物或者体积比为1: 9的三氯甲烷和石油醚的混合物，其中，所述石油醚的用量为层析柱体积的10-15倍，所述体积比为1: 9的二氯甲烷和石油醚的混合物的用量为层析柱体积的4-5倍，所述体积比为1: 9的三氯甲烷和石油醚的混合物的用量为层析柱体积的4-5倍。
11.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述纳豆菌发酵液为将所述纳豆枯草芽孢杆菌ST188接种在含有10-50g/1000mL黄豆粉和5_45g/1000mL蔗糖的培养基中，在30-40°C，经过20-48小时发酵获得纳豆菌发酵液，其中所述纳豆枯草芽孢杆菌ST188的接种浓度为5-20%。
12.一种纳豆枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis natto) ST188,保藏号为:CGMCCN0.8400。
【文档编号】C12N1/20GK103898175SQ201410129217
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2014年3月31日 优先权日:2014年3月31日
【发明者】陈杰鹏, 段丽丽, 陈煜藩, 陈鸿锐, 邱雪莲, 蔡桂珠, 洪琳, 胡留松, 黄晓莹, 张岳霖, 许志锴 申请人:广东双骏生物科技有限公司