一种甲基营养芽孢杆菌及其制备生物型肥料增效剂的方法
【专利摘要】本发明公开一种甲基营养芽孢杆菌及其制备生物型肥料增效剂的方法。来源于味精厂排口土壤中分离、选育的谷氨酸依赖型甲基营养芽孢杆菌(Bacillus?methylotrophicus)，已于2013年10月9日，经中国典型培养物保藏中心鉴定为甲基营养芽孢杆菌(Bacillus?methylotrophicus)菌株BT1301；已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC?M2013462。以此菌株为发酵菌株，通过斜面菌种活化、菌种液体摇瓶活化和液体深层发酵三级培养，发酵液经无机盐稳定处理，制成γ-聚谷氨酸生物型肥料增效剂剂，制成的生物复合肥对多种蔬菜病害具有较强的拮抗作用，降低病原菌发病率，对蔬菜生长具有促进作用。
【专利说明】一种甲基营养芽孢杆菌及其制备生物型肥料增效剂的方法【技术领域】
[0001]本发明涉及农业生物技术和肥料【技术领域】，具体涉及一种甲基营养芽孢杆菌及其制备生物型肥料增效剂的方法。
【背景技术】
[0002]y -PGA的全名是Y-Polyglutamic acid,是一种微生物发酵产生的细胞外阴离子型多聚氨基酸，由D-和L-谷氨酸通过α-氨基酸和Y-羧基酰胺键连接而高分子聚合物，Y -PGA通常由5000个左右的谷氨酸单体组成，相对分子质量一般在100KD~1000KD，呈直链纤维状，在Y-聚谷氨酸的分子链上具有大量的活性较高的游离羧基。除了其对人体无毒、生物可降解性和其降解产生对环境友好的终产物谷氨酸等优点外，还包括其具有高吸水性及保水性、良好的控制释放能力、螯合金属离子、与铁、钙、镁锌等形成同离子复合体以获得更佳的营养生物可用性，以及良好的抗植物病原活性，刺激作物及其种子生长以及保护其免受植物病原菌影响，整合植物营养、提供土壤中难溶养分有效性、调整土壤PH等独特功能，使Y-聚谷氨酸在农业上的应用具有较好前景。
[0003]专利CN102268389，公开了一种甲基营养芽孢杆菌及其发酵生产Y-聚谷氨酸的方法。该甲基营养芽孢杆菌培养时不需要谷氨酸，但产率过低，约17g/L。制得的发酵液经离心去除菌体，上清液加入2~4倍体积的无水乙醇、甲醇或丙酮沉淀聚谷氨酸，4°C静置过夜，用有机溶剂洗涤，去离子水透析除去盐，最后冷冻干燥，得到Y-聚谷氨酸。步骤复杂，其中还需使用大量化学溶剂洗涤沉淀，时间和成本都大大增加。专利申请号CN102703356A，公开了一种聚-Y-谷氨酸作为农用芽孢杆菌保护剂的应用，其中Y-聚谷氨酸也需要经过灭菌、纯化和真空干燥步骤，才能使用Y -聚谷氨酸，步骤复杂，使用操作繁琐，增加了处理的时间和成本，不利于工业 生产。
[0004]综上所述，节约Y -聚谷氨酸工业生产成本，大大提高发酵产率，以及对发酵液进行简单方便和稳定处理，对Y —聚谷氨酸在农业肥料方面应用具有重要意义。
【发明内容】
[0005]为了克服以上所述之技术问题，本发明提供了一种甲基营养芽孢杆菌及其制备生物型肥料增效剂的方法，使得Y —聚谷氨酸的生物发酵效率得以大大提高，以及解决传统发酵液处理步骤复杂，使用大量化学溶剂洗涤和沉淀的问题，大大节约工业应用的时间和成本，有利于工业化生产以及环境保护。
[0006]本发明的技术方案:为了实现上述目的，本发明一种来源于味精厂排口土壤中分离、选育的谷氨酸依赖型甲基营养芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus),已于2013年10月9日，经中国典型培养物保藏中心鉴定为甲基营养芽孢杆菌(Bacillusmethylotrophicus)菌株BT1301 ;该菌株已保藏于中国武汉武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M2013462。
[0007]本发明所述依赖谷氨酸发酵生产Y-聚谷氨酸的菌株甲基营养芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus) BT1301,最初来源于味精厂排口土壤样本,样本经液体培养基富集培养和稀释涂布后，进行摇瓶发酵培养，最后对发酵液的Y -聚谷氨酸进行定性定量分析，最终得到生产Y-聚谷氨酸的菌株，并进行菌株的分离与鉴定。图1是BT1301在蛋白胨葡萄糖琼脂培养基上菌落显微照片，显微镜下细长杆状，0.5~0.75 μ mX 1.5~
2.5 μ m，不规则形状，有的细胞呈V形排列；图2是BT1301在蛋白胨葡萄糖琼脂培养基上菌落呈白色或灰色、不透明，圆形边缘整齐。
[0008] 申请人:委托中国典型培养物保藏中心(CCTCC)经过序列测定，该甲基营养芽孢杆菌BT1301的16S rRNA核苷酸序列如SEQ ID No:1所示。菌株BT130116S rRNA基因测序BLAST结果说明:与甲基营养芽孢杆菌具有较高的同源性，相似度为99.86%，鉴定该菌株为甲基营养芽孢杆菌。
[0009]甲基营养芽抱杆菌(Bacillus methylotrophicus)BT1301具有以下性质:
[0010]1.形态特征
[0011]在蛋白胨葡萄糖琼脂培养基上营养细胞为0.5~0.75 μ mX 1.5~2.5 μ m大小的杆菌，当培养基中添加谷氨酸时，见图3，BT1301形成无色半透明隆起菌落，像半粒玻璃珠在平板上；菌落表面光滑边缘整齐、湿润粘稠。
[0012]2.生理生化特征见表1和表2
[0013]表1生理生化特性一碳源利用
[0014]
【权利要求】
1.甲基营养芽抱杆菌(Bacillusmethylotrophicus)菌株 BT1301,于 2013 年 10 月 9日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M2013462。
2.用权利要求1所述甲基营养芽孢杆菌BT1301发酵生产Y-聚谷氨酸及其制备生物型肥料增效剂的方法，其特征在于，用甲基营养芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)BT1301CCTCC M2013462做出发菌株，进行斜面菌种活化、菌种液体摇瓶活化和液体深层发酵三级培养: 斜面菌种活化:将培养好的保藏斜面种(Bacillus methylotrophicus BT1301 CCTCCM2013462)划线于新配制的LB斜面上，LB斜面组成如下:蛋白胨8~12g、酵母膏3~8g、氯化钠9~llg、琼脂15~22g、水11^，？!1值6.5~8.0，1211:灭菌20min，培养条件为:培养温度33°C~37°C，培养I~4d ; 菌种液体摇瓶活化:将上述斜面菌种接种于液体LB活化培养液中，液体LB活化培养液组成如下:蛋白胨8~12g、酵母膏3~8g、氯化钠9~llg、水lL，pH值6.5~8.0，500~1000mL三角瓶装液1/3，121°C灭菌20min ;培养条件为:摇床转速180~250r/min，培养温度33°C~ 37°C，培养12~36h ； 液体深层发酵:液体深层发酵培养液组成如下:淀粉糖化液(淀粉水解糖的质量浓度10~200g/L) 100~400mL/L、氯化钙0.3~0.8g/L、蛋白胨3~8g/L、谷氨酸钠30~60g/L、氯化钠9~15g、硫酸镁I~1.5g/L、磷酸二氢钾2~6g/L、硫酸锰0.005~0.08g/L ;液体深层发酵罐为0.5~50立方米自动控制高密度发酵罐，装液量60%~85%，121°C灭菌20~30min ;培养条件为:接种量0.5~5%、搅拌转速250~1000r/min、培养温度33°C~37°C，培养I~4d ;得到深层发酵发酵液； 所述生物型肥料增效剂是由深层发酵发酵液与二价离子无机盐组成。
3.根据权利要求2所述的一种甲基营养芽孢杆菌发酵生产Y-聚谷氨酸及其制备生物型肥料增效剂的方法，其特征在于，所述淀粉水解糖为利用木薯淀粉、甘薯淀粉、玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉的一种或一种以上。
4.根据权利要求2所述的一种甲基营养芽孢杆菌发酵生产Y-聚谷氨酸及其制备生物型肥料增效剂的方法，其特征在于，所述二价离子无机盐是镁、铁或锌的无机盐中的一种以上。
5.根据权利要求4所述的甲基营养芽孢杆菌发酵生产Y-聚谷氨酸及其制备生物型肥料增效剂的方法，其特征在于，所述镁的无机盐包括硫酸镁、氯化镁、草酸镁的一种或一种以上；所述锌的无机盐包括硫酸锌、氯化锌、硝酸锌、磷酸锌的一种或一种以上；铁的无机盐包括硫酸亚铁、氯化亚铁、硝酸亚铁的一种或一种以上。
6.根据权利要求2所述的一种甲基营养芽孢杆菌发酵生产Y-聚谷氨酸及其制备生物型肥料增效剂的方法，其特征在于，所述生物型肥料增效剂由液体深层发酵发酵液:镁盐按质量百分比85~95:5~15组成；或由液体深层发酵发酵液:锌盐按质量百分比85~95:5~15组成；或由液体深层发酵发酵液:锌盐:镁盐:二价铁盐按质量百分比85~95:2~15:1~15:2~15组成。
7.利用权利要求2-6之一所述的方法制得的生物型肥料增效剂粉剂，其特征在于，将权利要求2-6之一所述生物型肥料增效剂与硅藻土按1:1~2质量比混合、干燥制成粉剂。
8.利用权利要求7所述的生物型肥料增效剂粉剂制得的生物型肥料增效剂复合肥，其特征在于，将将权利要求7所述生物型肥料增效剂粉剂、尿素、磷肥、钾肥和粘土按质量比1~5:20~87:5~60:5~60:2~20混合得到复合肥。
【文档编号】C12N1/20GK103992966SQ201410148228
【公开日】2014年8月20日 申请日期:2014年4月14日 优先权日:2014年4月14日
【发明者】邵海锋 申请人:深圳市芭田生态工程股份有限公司