寄生曲霉及其在亚硝酸盐还原酶、亚硝酸盐还原酶基因和基因工程菌制备中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种寄生曲霉及其在亚硝酸盐还原酶、亚硝酸盐还原酶基因和含有亚硝酸盐还原酶的基因工程菌制备中的应用，寄生曲霉的保藏编号为CCTCC M2013662。本发明提供一种高效低能耗、对亚硝酸盐降解效果好、降解快速可靠的寄生曲霉。并且该寄生曲霉可在亚硝酸盐还原酶制备、亚硝酸盐还原酶基因制备及含有亚硝酸盐还原酶的基因工程菌制备中有良好应用。
CCTCC NO:M2013662
2013.12.11
【专利说明】寄生曲霉及其在亚硝酸盐还原酶、亚硝酸盐还原酶基因和 基因工程菌制备中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物【技术领域】，涉及一种曲霉及其应用，尤其涉及一种寄生曲霉，以 及该寄生曲霉在亚硝酸盐还原酶制备、亚硝酸盐还原酶基因制备及含有亚硝酸盐还原酶的 基因工程菌制备中的应用。
【背景技术】
[0002] 亚硝酸盐是自然界中最常见的含氮化合物之一，其来源也十分广泛，亚硝酸盐是 一种有害的化学物质，亚硝酸盐与人体血液作用，形成高铁血红蛋白，从而使血液失去携氧 功能，使人缺氧中毒，轻者头昏、心悸、呕吐、口唇青紫，重者神志不清、抽搐、呼吸急促，抢救 不及时可危及生命。不仅如此，亚硝酸盐在人体内还可与仲胺类作用形成亚硝胺类，后者在 人体内达到一定剂量时是致癌、致畸、致突变的物质，可严重危害人体健康。
[0003] 随着我国水产业的迅速发展,养殖密度和规模逐渐增大,养殖水的水质污染也随 之加重，其中亚硝酸盐含量过高是水质污染的主要因素之一，因为亚硝酸盐的含量超标会 严重危害鱼类等水产动物的正常生长。
[0004] 目前降低水质中以及食品中残留的亚硝酸盐含量的方法很多，比如离子交换法、 反渗透法、电渗析法、微生物降解法、化学法等。但是，这些方法存在很多问题，其中反渗透 法、电渗析法、离子交换法均是将亚硝酸盐集中于介质或废液中，易造成二次污染，且效率 低、投资较大，主要用于对工业用水的处理；化学还原法尽管可以将亚硝酸根还原为无害的 氮气，但其反应需要在较高温度下进行，效率也较低，不适宜于对养殖水和食品的处理；化 学氧化法虽具有设备简单、处理费用相对较低的优点，但仅适用于对亚硝酸盐含量较低、处 理量较少的地下深水的处理，不适宜于对养殖水和食品的处理。生物法具有高效低耗的优 点。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的技术问题在于，针对现有技术的上述缺陷，提供一种高效低能耗、 对亚硝酸盐降解效果好、降解快速可靠的寄生曲霉。
[0006] 本发明进一步要解决的技术问题在于，提供该寄生曲霉在亚硝酸盐还原酶制备、 亚硝酸盐还原酶基因制备和含有亚硝酸盐还原酶的基因工程菌制备中的应用。
[0007] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
[0008] 一种寄生曲霉（Aspergillus sp.JFS)，保藏编号为 CCTCC NO :M 2013662,保藏 时间：2013年12月11日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市 武昌珞珈山武汉大学保藏中心。该寄生曲霉的GenBank登录号为KJ847706、KJ847707和 KJ847708。
[0009] 本发明的寄生曲霉（Aspergillus parasiticus) JFS是从重庆市荣昌县金佛镇的 一个鱼池水样中分离得到。该寄生曲霉菌株是一株可以强烈降解亚硝酸盐的真菌。
[0010] 将该菌株JFS接种在察氏平板上，将平板置于30°C恒温培养，观察菌落的特征：该 菌株JFS在培养4天时，菌落直径为2. 6cm，此时，菌落正面呈现出4个同心圈形，菌落最中 间是乳白色菌丝状，由里向外第二层有很多金黄色孢子，由里向外第三层有很多白色孢子， 最外层是乳白色菌丝，菌落背面为浅棕色。9天时菌落直径5. 0cm，此时，平板上有很多白 色孢子和墨绿色孢子，同时平板上出现了很多棕黑色液滴，平板背面为深棕色。孢子的颜色 随着培养时间延长由浅到深，最初为淡黄色，然后变为绿色，最后变为棕黑色。
[0011] 载玻片温室培养显微观察和电子显微镜观察：营养菌丝有隔、分枝、透明，分生孢 子梗自菌丝生出，可单生或对生，直立，细长，大都简单，顶端渐粗，末端扩展成由1列小梗 排列成木栅状的顶囊，顶囊球形，小梗上有成串的2. 81-3. 6 μ m的球形分生孢子，分生孢子 头犹如花菜样、表面不光滑。
[0012] 将寄生曲霉菌株JFS在察氏平板上培养3-6天后，提取其基因组DNA，对该DNA进 行扩增，并分别用琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测，切割所需DNA目的条带测序。对菌 株JFS的ITS rDNA序列、β -Tubulin gene序列和Calmodulin gene序列的PCR产物测序 后发现其 ITS rDNA 序列共有 576bp，i3_Tubulin gene 序列共有 522bp，Calmodulin gene 序 列共有749bp。分别将其ITS rDNA序列、β-Tubul in gene序列和Calmodul in gene序列输 入NCBI GenBank中blast，用MEGA5. 2. I软件构建系统发育树，菌株JFS均与Aspergillus parasiticus 和 Aspergillus arachidicola(目前种 Aspergillus arachidicola 的概念还 不清楚）聚到了同一个分支，亲缘关系最近。
[0013] 综上，通过综合菌落形态、菌丝形态、分生孢子形态、培养条件及分子生物学 鉴定结果，该菌株属于真子囊菌亚纲散囊菌目发霉科曲霉属的寄生曲霉（Aspergillus parasiticus)〇
[0014] 由于本发明的寄生曲霉菌株JFS能在亚硝酸盐为唯一氮源的培养基中较好的生 长，有很强、很快的降解亚硝酸盐的能力，在初始浓度为4mg/L的亚硝酸钠培养液中120h的 亚硝酸钠降解率为99. 8%，在亚硝酸钠的浓度高达20. Og/L时仍能较好的生长，并且发现 亚硝酸钠的浓度越高该菌株生长得越好，在有氧和无氧条件下该菌株均能较好的生长。本 发明的寄生曲霉菌株JFS除了利用亚硝酸盐合成自身的结构蛋白及功能蛋白以外，还将有 毒的亚硝酸盐降解为无毒的硝酸盐和NH4+，同时该菌株还可以继续利用产物硝酸盐。
[0015] 本发明的寄生曲霉菌株JFS的发现，填补了真菌在降解亚硝酸盐方面的空白。相 对现有技术，本发明的寄生曲霉在亚硝酸盐降解过程中实现高效低能耗，且对亚硝酸盐降 解效果好、降解快速可靠。
[0016] 由于该菌株对亚硝酸盐有很强的降解能力，可应用于蛋白酶工程及基因工程：
[0017] 本发明寄生曲霉应用的第一种实施方案为：寄生曲霉在亚硝酸盐还原酶的制备中 应用。采用本发明寄生曲霉来制备亚硝酸盐还原酶，能降低培养成本，并且能为亚硝酸盐还 原酶的制备提供充足来源，使其可直接用于去除食品原料和养殖水中的亚硝酸盐。
[0018] 本发明寄生曲霉应用的第二种实施方案为：寄生曲霉在亚硝酸盐还原酶基因的制 备中应用。寄生曲霉的应用提供了更方便的途径，来研究自然界中亚硝酸盐还原酶基因的 多样性。
[0019] 本发明寄生曲霉应用的第三种实施方案为：寄生曲霉在含有亚硝酸盐还原酶的基 因工程菌制备中的应用。采用本发明的寄生曲霉能更方便制备更多种类的基因工程菌，扩 展其应用范围。
【专利附图】
【附图说明】
[0020] 下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：
[0021] 图1是本发明实施例1的菌株生长四天时的照片；
[0022] 图2是本发明实施例1的菌株生长九天时的照片；
[0023] 图3是本发明实施例1的在光学显微镜下的分生孢子梗和分生孢子头；
[0024] 图4-6都是本发明实施例1的在电子显微镜下的分生孢子头；
[0025] 图7是本发明实施例1的菌株JFS基于ITS rDNA序列的基因同源性的系统发育 树；
[0026] 图8是本发明实施例1的菌株JFS基于β -Tubulin基因序列的基因同源性的系 统发育树；
[0027] 图9是本发明实施例1的菌株JFS基于Calmodulin基因序列的基因同源性的系 统发育树；
[0028] 图10是本发明实施例1的亚硝酸钠浓度标准曲线；
[0029] 图11是本发明实施例1的培养液中亚硝酸钠浓度随培养时间变化趋势图。
【具体实施方式】
[0030] 为了对本发明的技术特征、目的和效果有更加清楚的理解，现对照附图详细说明 本发明的【具体实施方式】。
[0031] 实施例1、寄生曲霉菌株JFS的筛选、培养、鉴定和性能检测
[0032] 1.寄生曲霉菌株JFS的筛选：
[0033] ⑴材料
[0034] a.样品：采自四川成都、四川宜宾及重庆荣昌等地的水样、土样、朽木、兔粪和羊 粪共20个样品。
[0035] 样品处理及保存：其中采集的土样、朽木、兔粪和羊粪全部于采回后立即在阴凉 干燥处晾干，晾干后置于干净的牛皮纸信封内保存。水样在采集后直接使用（用的是新鲜 水）。
【权利要求】
1. 一种寄生曲霉，其特征在于，其保藏编号为CCTCC M2013662。
2. 如权利要求1所述的寄生曲霉，其特征在于，所述的寄生曲霉的菌落、菌丝、分生 孢子特征分别为：菌落正面呈现出同心圈形，菌落中心是乳白色菌丝状，由里向外的第二 层有金黄色孢子，由里向外的第三层有白色孢子，最外层是乳白色菌丝，菌落背面为浅棕 色；营养菌丝有隔、分枝、透明；分生孢子梗自菌丝生出，可单生或对生，直立，细长，大都 简单，顶端渐粗，末端扩展成由1列小梗排列成木栅状的顶囊，顶囊球形，小梗上有成串的 2. 81-3. 6 y m的球形分生孢子，分生孢子头犹如花菜样、表面不光滑，产生棕色分泌液。
3. 权利要求1所述的寄生曲霉在亚硝酸盐还原酶的制备中应用。
4. 权利要求1所述的寄生曲霉在亚硝酸盐还原酶基因的制备中应用。
5. 权利要求1所述的寄生曲霉在含有亚硝酸盐还原酶的基因工程菌制备中应用。
【文档编号】C12N15/81GK104312925SQ201410370569
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2014年7月30日 优先权日:2014年7月30日
【发明者】刘冰花, 杨林, 蒲小龙, 罗亚雄, 袁管明 申请人:成都大学