一种共固定化双酶催化合成海藻糖的方法
【专利摘要】本发明涉及一种共固定化双酶催化合成海藻糖的方法。发酵培养能大量合成耐高温海藻糖合酶的重组大肠杆菌经透性化处理后加入β-淀粉酶，并利用壳聚糖和海藻酸钠共固定化形成微球。含量为25-30%重量的淀粉经α-淀粉酶催化后与微球接触反应生成海藻糖，微球重复利用8-16次后淀粉的转化率可达到60%-65%。利用本发明提供的方法可以实现大规模、低成本、高效率生产高质量的海藻糖。
【专利说明】一种共固定化双酶催化合成海藻糖的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种共固定化双酶催化合成海藻糖的方法，属于功能糖醇合成【技术领域】。具体涉及用淀粉作为原料催化合成海藻糖的方法。
【背景技术】
[0002]海藻糖(Trehalose)是两个葡萄糖分子以α，α _1，I糖苷键结合形成的非还原性二糖，海藻糖无半缩醒轻基，化学性质稳定。自1832年Wiggers首次从麦角菌中提取出海藻糖之后，海藻糖被发现广泛存在于自然界的动物、植物及微生物中，如细菌、古生菌、酵母、蘑菇及无脊椎动物。由于海藻糖在高温、高寒、高渗透压及干燥失水等恶劣环境条件下能在细胞表面形成独特的保护膜，有效地保护蛋白质分子不变性失活，因此在科学界素有“生命之糖”的美誉。这一独特的功能特性，使得海藻糖除了可以作为蛋白质药物、酶、疫苗和其他生物制品的活性保护剂以外，还是保持细胞活性、保湿类化妆品的重要成分，更可作为防止食品劣化、保持食品新鲜风味、提升食品品质的独特食品配料，具有广阔的市场前景和应用价值。
[0003]现代的海藻糖的商品化制备方法主要包括化学合成法、微生物发酵法、酶转化法。其中酶转化法是目前海藻糖生产的主要途径，许多生物体内都有合成海藻糖的酶系，可以利用基因工程手段高效表达出来，利用这些酶与底物进行催化反应，可以大规模的生产海藻糖。但是，海藻糖合酶属于胞内酶，酶法生产海藻糖过程中通常要破碎菌体，提取与纯化海藻糖合成酶系，而在破碎及纯化过程中容易造成酶的损失，这无疑加大了企业的生产成本。
[0004]南宁中诺生物工程有限责任公司通过细胞破碎以及双酶提取后以木薯淀粉为原料经α -淀粉酶和普鲁兰酶水解，再通过利用麦芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase)和麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)分步催化反应合成海藻糖，但由于破碎过程中容易造成酶的损失以及麦芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase)对麦芽糖并不产生转化，导致麦芽糖大量积累，最终使得海藻糖的得率不能达到较高水平，同时MTHase的酶活力也较低，也成为双酶反应的限制因素。
[0005]CN103146779A (一种利用全细胞催化合成海藻糖的方法)中介绍以生物表面活性剂为透性化试剂处理大肠杆菌细胞增加其细胞膜的通透性，从而可以利用全细胞催化麦芽糖底物生成海藻糖。利用全细胞催化合成海藻糖可以免去细胞破碎工序，海藻糖合成酶(Trehalose synthase,简称TreS)可以直接作用于麦芽糖底物,将α, α-1，4糖苷键连接的麦芽糖通过分子内转糖苷一步转化为α，α-1，I糖苷键连接的海藻糖。该途径只需一步反应，工艺简单，但其底物麦芽糖相比较与淀粉价格仍旧比较高昂。
【发明内容】
[0006]本发明以淀粉为最初的催化底物，利用双酶共固定化催化淀粉水解液合成海藻糖。
[0007]本发明所要解决的技术问题是克服现有双酶催化体系中(麦芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase)和麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase))酶的利用率低以及在单酶(海藻糖合成酶(TreS))催化原料底物价格较高的问题，利用价格低廉的淀粉为催化底物以及利用单酶催化体系，提供一种新的固定化催化底物合成海藻糖的方法，降低原料成本，从而进一步降低海藻糖的生产成本。
[0008]为了克服所述技术问题，本发明的技术方案为:
一种共固定化制备用于合成海藻糖双酶微球的方法，制备并透性化处理含海藻糖合成酶的工程菌，在透性化处理的体系中加入至少一种糖化酶，其特征在于:在加入糖化酶之前的透性化体系中加入了海藻酸钠，并将该体系滴加入含壳聚糖的体系中，制得用于催化淀粉水解液的共固定化双酶微球。
[0009]本发明所述的方法，其特征在于:所述透性化体系采用磷酸缓冲盐溶液，pH值为6-7 ;所述含壳聚糖的体系为酸性体系，含0.1 -0.2 mol/L的氯化钙与1-1.5重量％的醋酸。
[0010]一种共固定化双酶催化合成海藻糖的方法，所述方法的步骤为:
(1)制备并透性化处理含海藻糖合成酶的工程菌；
(2)在透性化处理的体系中加入糖化酶；
(3)共固定化制备双酶微球；
(4)将微球与经α-淀粉酶催化反应后的淀粉水解液接触反应获得反应液；
(5)分离纯化所述步骤(4)的反应液获得海藻糖；
其特征在于，回收步骤(3)所述微球，与含经α -淀粉酶催化反应后的淀粉水解液接触反应获得反应液。
[0011]本发明所述的方法，其特征在于，反应的具体步骤为:
(1)制备并透性化处理含海藻糖合成酶的工程菌；包括培养海藻糖合成酶的大肠杆菌，在OD6tltl值为0.6-0.8时加入诱导剂产酶6-8小时，获得发酵液；离心分离获得菌体；加入与发酵液体系相当的0.1-0.4 g/L的脂肽类生物表面活性剂溶液，于20-25°C，100-200 rpm下反应30-60 min ;离心分离获得菌体，并用与发酵液体系相当的磷酸盐缓冲液重悬；获得3份体积的菌体；
(2)在透性化处理的体系中加入糖化酶，包括加入I份体积含2-3重量％的海藻酸糖化酶溶液，混合均匀；
(3)共固定化制备双酶微球，包括将步骤(I)所述溶液滴加至含有0.1 -0.2 mol/L的氯化钙与1-1.5%重量的醋酸的1%_2%的壳聚糖溶液中，且保持搅拌状态直至滴加结束30min，制得双酶固定化微球；
(4)将微球与经α-淀粉酶催化反应后的淀粉水解液接触反应获得反应液，包括用α -淀粉酶水解含淀粉原料，控制反应的终点DE值为19-22，获得淀粉水解液，并在上述反应液中加入双酶固定化微球，反应24-30小时，反应条件为45-60 °C，pH 4.8-5.3，搅拌转速 100-200 rpm ；
(5)分离纯化所述步骤(4)的反应液获得海藻糖。
[0012](6)回收步骤(4)所述微球与含经α -淀粉酶催化反应后的淀粉水解液接触反应获得反应液。
[0013]本发明所述的方法，回收步骤(4)所述微球，进行水洗并用于与淀粉水解液接触反应，和/或分离回流步骤(4)所述反应液与微球进行接触反应。
[0014]本发明所述的方法，步骤(I)所述工程菌为含有盐碱地宏基因组(Saline-AlkaliSoil Metagenomes)的海藻糖合成酶基因，并能表达合成海藻糖合成酶。
[0015]本发明所述的方法，步骤(I)所述的制备并透性化处理步骤包含菌种活化、培养、诱导、产酶、离心分离、脂肽类生物表面活性剂处理、二次、重悬细胞的步骤，其重悬体系所用磷酸盐磷酸根浓度为0.01-0.04 mol/L。
[0016]本发明所述的方法，步骤(5)中所述方法为固液分离方法，优选压滤机，筛孔小于14目。
[0017]本发明所述的方法，淀粉水解液的DE值为19-22，制备水解液的淀粉的干物质浓度为25-30%，α -淀粉酶的用量为5-10 U/g淀粉，糖化酶的用量为30-35 U/g淀粉。
[0018]本发明所述的方法，包括葛根淀粉、玉米淀粉、土豆淀粉及红薯淀粉。
[0019]本发明所带来的有益效果为:
(I)本发明通过对双酶共固定化形成了机械强度高的双酶固定化微球，从而提高了酶的使用效率进而提高了海藻糖的生产效率，降低了生产成本，缩短了生产周期。
[0020]( 2 )本发明通过采用淀粉作为生产海藻糖的最初底物，经液化后，通过一步双酶共催化淀粉水解液生成海藻糖，降低了原料成本。
[0021](3)由于本发明制得的固定化酶机械强度高，因此可以直接采用过滤法分离海藻糖，方法简单，大大降低了分离成本，并且固定化酶可以重复使用8-16次，具有显著的经济效益和广阔的应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0022]图1为电镜下放大40倍后的微球。
[0023]图2为电镜下放大10000倍后的微球表面。
【具体实施方式】
[0024]实施例1
本实施例说明菌种的来源。
[0025]本专利所用的菌种为来源于Thermus thermophilus ATCC 33923 (Gene Bank:AQOSO1000003)盐喊地宏基因组(Saline-Alkali Soil Metagenomes)的海藻糖合成酶基因的大肠杆菌，其中出发菌株来源、菌种构建方式等均采用本申请的发明人在先公开的文献“Ling Jiang, Ming Lin, Yang Zhang et al.1dentificat1n and Characterizat1n ofa Novel Trehalose Synthase Gene Derived from Saline-Alkali Soil Metagenomes.Pols One 8(10): e77437.do1: 10.1371/journal, pone.0077437.” 中所述的方法，构件得到的菌株编号为BL21-treS。
[0026]同时， 申请人:在此声明，从专利申请之日起20年内，免费向社会公众无偿提供本发明所述的出发菌株。
[0027]实施例2
本实施例说明催化合成海藻糖的具体合成步骤以及合成效果。
[0028]取实施例1中所获得BL21_treS菌株用于海藻糖合成催化。
[0029]本实施例所用耐高温α-淀粉酶、淀粉酶以及均购自于阿拉丁公司，纯度为93%-96%。
[0030]首先采用划线法于加氨苄的固体LB培养基上培养大肠杆菌基因工程菌获得大肠杆菌单菌落。其中加氨苄的固体培养基的配方为:蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，氯化钠10g/L，氨苄抗生素0.1 g/L，琼脂20 g/L。具体的操作过程为，按要求配制培养基，将配置好的培养基于121°C下灭菌30min，待冷却后倒平板，采用划线法接种，于恒温培养箱中培养获取大肠杆菌单菌落。
[0031]第二，挑取上述单菌落接种于加氨苄的LB液体培养基活化菌种，活化培养条件为37 °C, 200 rpm，培养时间12 h。其中加氨苄的LB液体培养配方为:蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，氯化钠10 g/L，氨苄抗生素0.1 g/L。按照上述要求配制好培养基后，分装于250ml摇瓶中，装液量为50ml，将配置好的培养基于121°C下灭菌30min，冷却至室温，于无菌条件挑取单菌落接种于摇瓶中活化菌种。
[0032]第三，按照实际生产的需求量配制加氨苄的LB液体培养基，具体方法参照第二步中所述的方法。本实施例中，采取3LNBS发酵罐来培养菌体。
[0033]待灭菌结束冷却至室温后，取活化的BL21_treS菌种按接种量1.5% (V/V)接种到新的加氨苄的LB液体培养基发酵罐中。保持培养条件为37 0C，搅拌转速200 rpm,通气量为lvvm。在发酵过程中定时测定细胞密度，在细胞密度达到OD6tltl为0.6-0.8时加入IPTG，保持IPTG终浓度为0.5-1.5mmol/l，诱导产酶7_9h。
[0034]第四，采用无菌手段转移第三步所得到的部分发酵液，离心分离获得湿菌体，离心条件为4 °C ,离心转速为6000 rpm,离心时间为lOmin。
[0035]第五，获取第四步离心所得到的菌体，将其悬浮于与第四步发酵液等体积的
0.1-0.4 g/L的生物表面活性剂溶液中。在于20°C，150 rpm下反应45 min，将细胞进行透性化处理。
[0036]磷酸缓冲液配制的具体步骤为，首先配制0.2mol/L Na2HPO4和0.2mol/L NaH2PO4的母液；按照体积比为0.2mol/L Na2HPO4和0.2mol/L NaH2PO4为4:1混合制得0.2mol/l的缓冲液。将0.2mol/l的缓冲液稀释得到0.04 mol/L的待用PBS缓冲液。
[0037]第六，经透性化处理的细胞在6000 rpm,离心10 min，用磷酸盐缓冲液洗涤2次后，用1/3体积2%-3%的海藻酸钠重悬并加入30-35 (U/g淀粉)的β -淀粉酶，充分混合；
第七，用针管抽取一定量混合液，滴加到以持续搅拌的含有0.1MCaCl2以及1%_1.5%醋酸的1%壳聚糖溶液中，搅拌30min，制得双酶固定化微球；(附图)
第八、配制质量浓度为30%玉米淀粉溶液，调制pH6.9，水浴加热至90-95 1:后，并加入5-10 (U/g淀粉)的耐高温α -淀粉酶并持续搅拌一定时间使得DE值为19-22 ；
第九、将步骤(8)中玉米淀粉水解液冷却至60°C，调至ΡΗ4.8-5.3，加入步骤(7)中双酶固定化微球催化淀粉水解液经转化分离得海藻糖，反应条件为45-60 °C，搅拌转速为100-200 rpm，24-30 h ；
第十，将步骤(9)中的催化液用14目滤网过滤分离，滤液为海藻糖混合液，滤渣为双酶固定化微球，经清水浸泡3h后，重复利用。
[0038]用高效液相色谱法测定体系中的海藻糖浓度，并计算海藻糖的转化率，以此来评价细胞的催化活性。其中，色谱柱为Alltima Amino 10A 5u柱(4.6mmX250mm);流动相为 75% 乙腈 /25% H2O。
[0039]经检测，初次转化率为65%，双酶固定化微球重复利用8次后转化率为63.8%，双酶固定化微球重复利用16次后转化率为61%，平均每次转化时间为24h，且重复生产16次过程中未染杂菌。
[0040]实施例3
本实施例说明用普鲁兰酶替换β-淀粉酶用于双酶固定化后催化淀粉水解液合成海藻糖的效果。
[0041]本实施例所用的普鲁兰酶购于阿拉丁，纯度为93%_96%。
[0042]按照实施例2所述的种利用双酶共固定化催化淀粉水解液合成海藻糖的方法，其不同之处在于:
其步骤(6)用普鲁兰酶替换β -淀粉酶用于双酶固定化后催化淀粉水解液合成海藻糖经检测，初次转化率为64.9%，双酶固定化微球重复利用8次后转化率为63.2%，双酶固定化微球重复利用16次后转化率为60%，平均每次转化时间为23h，且重复生产16次过程中未染杂菌。
[0043]实施例4
如实施例2所述的种利用双酶共固定化催化淀粉水解液合成海藻糖的方法，其不同之处在于:
步骤(8)配制质量浓度为30%葛根淀粉溶液，调制pH6.9，水浴加热至90-95 1:后，并加入5-10 (U/g淀粉)的耐高温α -淀粉酶并持续搅拌一定时间使得DE值为19-22 ；
经检测，初次转化率为64.2%，双酶固定化微球重复利用8次后转化率为62.8%，双酶固定化微球重复利用16次后转化率为60%，平均每次转化时间为25h，且重复生产16次过程中未染杂菌。
[0044]实施例5
本实施例说明不经过固定化处理直接催化淀粉水解液合成海藻糖的效果。
[0045]取实施例1中所获得BL21_treS菌株用于海藻糖合成催化。
[0046]本实施例所用耐高温α-淀粉酶、β_淀粉酶以及均购自于阿拉丁公司，纯度为93%-96%。
[0047]首先采用划线法于加氨苄的固体LB培养基上培养大肠杆菌基因工程菌获得大肠杆菌单菌落。其中加氨苄的固体培养基的配方为:蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，氯化钠10g/L，氨苄抗生素0.1 g/L，琼脂20 g/L。具体的操作过程为，按要求配制培养基，将配置好的培养基于121°C下灭菌30min，待冷却后倒平板，采用划线法接种，于恒温培养箱中培养获取大肠杆菌单菌落。
[0048]第二，挑取上述单菌落接种于加氨苄的LB液体培养基活化菌种，活化培养条件为37 °C, 200 rpm，培养时间12 h。其中加氨苄的LB液体培养配方为:蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，氯化钠10 g/L，氨苄抗生素0.1 g/L。按照上述要求配制好培养基后，分装于250ml摇瓶中，装液量为50ml，将配置好的培养基于121°C下灭菌30min，冷却至室温，于无菌条件挑取单菌落接种于摇瓶中活化菌种。
[0049]第三，按照实际生产的需求量配制加氨苄的LB液体培养基，具体方法参照第二步中所述的方法。本实施例中，采取3LNBS发酵罐来培养菌体。
[0050]待灭菌结束冷却至室温后，取活化的BL21_treS菌种按接种量1.5% (V/V)接种到新的加氨苄的LB液体培养基发酵罐中。保持培养条件为37 0C，搅拌转速200 rpm,通气量为lvvm。在发酵过程中定时测定细胞密度，在细胞密度达到OD6tltl为0.6-0.8时加入IPTG，保持IPTG终浓度为0.5-1.5mmol/l，诱导产酶7_9h。
[0051]第四，采用无菌手段转移第三步所得到的部分发酵液，离心分离获得湿菌体，离心条件为4 °C ,离心转速为6000 rpm,离心时间为lOmin。
[0052]第五，获取第四步离心所得到的菌体，将其悬浮于与第四步发酵液等体积的
0.1-0.4 g/L的生物表面活性剂溶液中。在于20°C，150 rpm下反应45 min，将细胞进行透性化处理。
[0053]磷酸缓冲液配制的具体步骤为，首先配制0.2mol/L Na2HPO4和0.2mol/L NaH2PO4的母液；按照体积比为0.2mol/L Na2HPO4和0.2mol/L NaH2PO4为4:1混合制得0.2mol/l的缓冲液。将0.2mol/l的缓冲液稀释得到0.04 mol/L的待用PBS缓冲液。
[0054]第六、配制质量浓度为30%玉米淀粉溶液，调制pH6.9，水浴加热至90-95 1:后，并加入5-10 (U/g淀粉)的耐高温α -淀粉酶并持续搅拌一定时间使得DE值为19-22 ；
第七、将步骤(6)中玉米淀粉水解液冷却至60°C，调至ΡΗ4.8-5.3，加入步骤(5)中透性化细胞催化淀粉水解液经转化分离得海藻糖，反应条件为45-60 V，搅拌转速为100-200rpm,24-30 h ；
用高效液相色谱法测定体系中的海藻糖浓度，并计算海藻糖的转化率，以此来评价细胞的催化活性。其中，色谱柱为Alltima Amino 100A 5u柱(4.6mmX250mm);流动相为75%乙腈 /25% H2O。
[0055]经检测，初次转化率为10%，平均每次转化时间为24h。
【权利要求】
1.一种共固定化制备用于合成海藻糖双酶微球的方法，制备并透性化处理含海藻糖合成酶的工程菌，在透性化处理的体系中加入至少一种糖化酶，其特征在于:在加入糖化酶之前的透性化体系中加入了海藻酸钠，并将该体系滴加入含壳聚糖的体系中，制得用于催化淀粉水解液的共固定化双酶微球。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述透性化体系采用磷酸缓冲盐溶液，PH值为6-7 ;所述含壳聚糖的体系为酸性体系，含0.1 -0.2 mo I/L的氯化钙与1-1.5%重量的醋酸。
3.一种共固定化双酶催化合成海藻糖的方法，所述方法的步骤为: (1)制备并透性化处理含海藻糖合成酶的工程菌； (2)在透性化处理的体系中加入糖化酶； (3)共固定化制备双酶微球； (4)将微球与经α-淀粉酶催化反应后的淀粉水解液接触反应获得反应液； (5)分离纯化所述步骤(4)的反应液获得海藻糖； 其特征在于，回收步骤(3)所述微球，与含经α -淀粉酶催化反应后的淀粉水解液接触反应获得反应液。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，反应的具体步骤为: (1)制备并透性化处理含海藻糖合成酶的工程菌；包括培养海藻糖合成酶的大肠杆菌，在OD6tltl值为0.6-0.8时加入诱导剂产酶6-8小时，获得发酵液；离心分离获得菌体；加入与发酵液体系相当的0.1-0.4 g/L的脂肽类生物表面活性剂溶液，于20-25°C，100-200 rpm下反应30-60 min ;离心分离获得菌体，并用与发酵液体系相当的磷酸盐缓冲液重悬；获得3份体积的菌体； (2)在透性化处理的体系中加入糖化酶，包括加入I份体积含2-3重量％的海藻酸糖化酶溶液，混合均匀； (3)共固定化制备双酶微球，包括将步骤(I)所述溶液滴加至含有0.1 -0.2 mol/L的氯化钙与1-1.5%重量的醋酸的1%_2%的壳聚糖溶液中，且保持搅拌状态直至滴加结束30min，制得双酶固定化微球； (4)将微球与经α-淀粉酶催化反应后的淀粉水解液接触反应获得反应液，包括用α -淀粉酶水解含淀粉原料，控制反应的终点DE值为19-22，获得淀粉水解液，并在上述反应液中加入双酶固定化微球，反应24-30小时，反应条件为45-60 °C，pH 4.8-5.3，搅拌转速 100-200 rpm ； (5)分离纯化所述步骤(4)的反应液获得海藻糖； (6)回收步骤(4)所述微球与含经α-淀粉酶催化反应后的淀粉水解液接触反应获得反应液。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(I)所述工程菌为含有盐碱地宏基因组(Saline-Alkali Soil Metagenomes)的海藻糖合成酶基因，并能表达合成海藻糖合成酶。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(I)所述的制备并透性化处理步骤包含菌种活化、培养、诱导、产酶、离心分离、脂肽类生物表面活性剂处理、二次、重悬细胞的步骤，其重悬体系所用磷酸盐磷酸根浓度为0.01-0.04 mol/L。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(5)中所述方法为固液分离方法，优选压滤机，筛孔小于14目。
8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，淀粉水解液的DE值为19-22，制备水解液的淀粉的干物质浓度为25-30%，α -淀粉酶的用量为5-10 U/g淀粉，糖化酶的用量为30-35U/g淀粉。
9.上述任一权利要求所述的淀粉，包括葛根淀粉、玉米淀粉、土豆淀粉及红薯淀粉。
【文档编号】C12N11/04GK104328107SQ201410638714
【公开日】2015年2月4日 申请日期:2014年11月13日 优先权日:2014年11月13日
【发明者】黄和, 江凌, 崔怀言, 晏晓琴, 李霜 申请人:南京海和生物科技有限公司