一种发酵生产l-亮氨酸的方法
【专利摘要】本发明公开一种发酵生产L-亮氨酸的方法，包括以下步骤：在摇瓶中装入LB培养基，接入斜面菌种，然后将摇瓶置于摇床上培养28h，得到种子液，备用；然后将种子液接入有发酵培养基的发酵罐中进行发酵培养；发酵过程中，通过控制搅拌转速和风量，使发酵过程的前20h溶解氧为6-8mg/L，20h之后溶解氧为3-6mg/L；通过自动流加氨水控制发酵过程的pH，在菌体OD值达到25之前控制pH为6.4-6.7，菌体OD值增长到25后，pH每小时提高0.1，直至提高到7.2后保持不变；发酵结束后提取和精制L-亮氨酸。本发明的方法使发酵周期缩短，发酵产量提高，工艺简单易控制，成本较低，非常适合大规模工业应用。
【专利说明】一种发酵生产L-亮氨酸的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于氨基酸生产【技术领域】，主要涉及一种发酵生产L-亮氨酸的方法。
【背景技术】
[0002]L-亮氨酸，又称白氨酸，1819年Proust首先从奶酪中分离得到，后来Braconnot从肌肉与羊毛的酸水解物中得到结晶，并定名为亮氨酸。L-亮氨酸是常见十八种氨基酸中的一种，也是人体必需氨基酸之一，亮氨酸可作为营养增补剂、调味增香剂。可配制氨基酸输液及综合氨基酸制剂，降血糖剂，植物生长促进剂。L-亮氨酸的生产方法主要有提取法、化学合成法、酶催化法、微生物发酵法等。我国大部分厂家采用蛋白质水解法生产L-亮氨酸，但水解法生产L-亮氨酸费时、污染严重、收率低、产品质量得不到保证，大规模生产受到限制。化学合成法得到的亮氨酸是消旋的DL-亮氨酸，为了得到L-亮氨酸，必须进行光学异构体的拆分，因此化学合成法很少用于L-亮氨酸的生产。酶法生产L-亮氨酸中所用到的酶需通过微生物发酵生成并提取精制，工艺过程比较复杂，且成本较高，因此目前尚未得到广泛的应用。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是针对现有技术中存在的不足，提供一种发酵生产L-亮氨酸的方法，通过对发酵过程残糖浓度控制、温度控制、PH与溶解氧分段控制及培养基的基本组成进行调整，使发酵周期缩短，发酵产量提高，工艺简单易控制，成本较低，非常适合大规模工业应用。
[0004]本发明实现上述目的采用的技术方案是:一种发酵生产L-亮氨酸的方法，包括以下步骤:
在摇瓶中装入LB培养基，接入斜面菌种，然后将摇瓶置于摇床上在搅拌速度为IlOr/min，温度为31°C条件下，培养28h，得到种子液，备用；然后按照10%接种量将种子液接入有发酵培养基的发酵罐中，并在温度为31-32°C条件下进行发酵培养；
发酵过程中，通过控制搅拌转速和风量，使发酵过程的前20h溶解氧为6-8mg/L，20h之后溶解氧为3-6mg/L ;通过自动流加氨水控制发酵过程的pH，在菌体OD值达到25之前控制PH为6.4-6.7，菌体OD值增长到25后，pH每小时提高0.1，直至提高到7.2后保持不变；所述菌体OD值为测定样品稀释20倍后测定的0D’值与稀释倍数的乘积；发酵结束后提取和精制L-亮氨酸。
[0005]所述的发酵培养基中包括以下质量百分数的含碳化合物和含氮化合物:无水葡萄糖0_3%、玉米浆3-6%、硫酸铵1-1.5%、醋酸铵0.7-1.0%、磷酸二氢钾0.05-0.1%、硫酸镁0.2-0.3%、蛋氨酸0.04%、异亮氨酸0.006%和谷氨酸0.07% ；
所述的发酵培养基中微量元素和维生素的添加量为VBi 300ug/L、VH50 ug/L、FeSO40.02-0.05mg/L、MnSO4 0.01-0.03mg/L 和 ZnSO4 0.02-0.05mg/L.发酵过程中控制残糖的质量百分数为0.005-0.05%。
[0006]所述的发酵培养基中，外加其重量0.3%的消泡剂。
[0007]本发明的有益效果
本发明提供的发酵生产L-亮氨酸的方法，通过对发酵过程残糖浓度控制、温度控制、PH与溶解氧分段控制及培养基的基本组成进行调整，使发酵周期缩短，发酵产量提高，工艺简单易控制，成本较低，非常适合大规模工业应用。尤其重量的是，PH与溶解氧分段控制，目的是为了缩短菌种的发酵时间、增加产量。通过发酵过程控制优化，菌体生长健壮，在10吨发酵罐内试验,发酵周期由原来的50小时缩短至35小时，产酸单位由原来的30g/L增加到38g/L,效果十分显著。
【具体实施方式】
[0008]一种发酵生产L-亮氨酸的方法，包括以下步骤:
在摇瓶中装入LB培养基，接入斜面菌种，然后将摇瓶置于摇床上在搅拌速度为IlOr/min，温度为31°C条件下，培养28h，得到种子液，备用；然后按照10%接种量将种子液接入有发酵培养基的发酵罐中，10%接种量指种子液的体积为接种后发酵培养液总体积的10%，并在温度为31-32°C条件下进行发酵培养；
发酵过程中，通过控制搅拌转速和风量，使发酵过程的前20h溶解氧为6-8mg/L，20h之后溶解氧为3-6mg/L ;通过自动流加氨水控制发酵过程的pH，在菌体OD值达到25之前控制pH为6.4-6.7，菌体OD值增长到25后，pH每小时提高0.1，直至提高到7.2后保持不变；发酵结束后提取和精制L-亮氨酸。
[0009]所述的发酵培养基中包括以下质量百分数的含碳化合物和含氮化合物:无水葡萄糖0_3%、玉米浆3-6%、硫酸铵1-1.5%、醋酸铵0.7-1.0%、磷酸二氢钾0.05-0.1%、硫酸镁0.2-0.3%、蛋氨酸0.04%、异亮氨酸0.006%和谷氨酸0.07% ；
所述的发酵培养基中微量元素和维生素的添加量为VBi 300ug/L、VH50 ug/L、FeSO40.02-0.05mg/L、MnSO4 0.01-0.03mg/L和 ZnSO4 0.02-0.05mg/L。
[0010]所述发酵培养基中除上述成分外，余量为水，并在配置完成后外加0.3%的消泡剂。
[0011]发酵过程中控制残糖的质量百分数为0.005-0.05%。
[0012]以下结合具体实施例对本发明做进一步说明:
实施例1:
一种发酵生产L-亮氨酸的方法，包括以下步骤:
在2L摇瓶中装入LB培养基600ml，接入斜面菌种(菌种选用黄色短杆菌TL0412 (Met—+2-TAr+- a -ABr+ β -HLr+SGr+Rifr,天津科技大学代谢控制发酵实验室保藏菌株)，然后将摇瓶置于摇床上在搅拌速度为llOr/min，温度为31°C条件下，培养28h，得到种子液，备用；然后按照10%接种量将种子液接入有发酵培养基的1L发酵罐中，并在温度为31°C条件下进行发酵培养；所述的发酵培养基中包括以下质量百分数的含碳化合物和含氮化合物:无水葡萄糖2%、玉米浆6%、硫酸铵1.5%、醋酸铵1.0%、磷酸二氢钾0.1%、硫酸镁0.2%、蛋氨酸0.04%、异亮氨酸0.006%和谷氨酸0.07% ;发酵培养基中微量元素和维生素的添加量为VBi300ug/L、VH50 ug/L,FeSO4 0.02mg/L,MnSO4 0.0lmg/L和 ZnSO4 0.05mg/L，外加的消泡剂的质量百分数为0.3%。
[0013]发酵过程中，初始通风量为72m3/h，然后通过控制搅拌转速和风量，使发酵过程的前20h溶解氧为6-8mg/L，20h之后溶解氧为3_6mg/L ;通过自动流加氨水控制发酵过程的pH,在菌体OD值达到25之前控制pH为6.5，菌体OD值增长到25后，pH每小时提高0.1，直至提高到7.2后保持不变；且发酵过程中控制残糖的质量百分数为0.005-0.05%,发酵12小时后，每4个小时取一次样进行测定，发酵结束后提取和精制L-亮氨酸。
[0014]按照本实施例的方法进行L-亮氨酸的生产，发酵时间33小时，L-亮氨酸产量为41g/L。
[0015]实施例2:
一种发酵生产L-亮氨酸的方法，包括以下步骤:
在2L摇瓶中装入LB培养基600ml，接入斜面菌种，然后将摇瓶置于摇床上在搅拌速度为llOr/min，温度为31°C条件下，培养28h，得到种子液，备用；然后按照10%接种量将种子液接入有发酵培养基的1L发酵罐中，并在温度为32°C条件下进行发酵培养；所述的发酵培养基中包括以下质量百分数的含碳化合物和含氮化合物:无水葡萄糖2%、玉米浆6%、硫酸铵1.5%、醋酸铵1.0%、磷酸二氢钾-0.1%、硫酸镁0.2%、蛋氨酸0.04%、异亮氨酸0.006%和谷氨酸0.07%;发酵培养基中微量元素和维生素的添加量为VBi 300ug/L、VH50 ug/L、FeSO4 0.05mg/L, MnSO4 0.03mg/L 和 ZnSO4 0.05mg/L，外加的消泡剂的质量百分数为 0.3%。
[0016]发酵过程中，初始通风量为72m3/h，然后通过控制搅拌转速和风量，使发酵过程的前20h溶解氧为6-8mg/L，20h之后溶解氧为3_6mg/L ;通过自动流加氨水控制发酵过程的pH,在菌体OD值达到25之前控制pH为6.7，菌体OD值增长到25后，pH每小时提高0.1，直至提高到7.2后保持不变；且发酵过程中控制残糖的质量百分数为0.005-0.05%，发酵12小时后，每4个小时取一次样进行测定，发酵结束后提取和精制L-亮氨酸。
[0017]按照本实施例的方法进行L-亮氨酸的生产，发酵时间35小时，L-亮氨酸产量为38g/L。
[0018]对比试验例
按照10%接种量将种子液600ml接入有5.4L发酵培养基的1L发酵罐中；通风量为
1.2L/min ;搅拌转速500_700r/min ;通过自动流加氨水控制PH在7.0 ;培养温度28°C ;美国进口陶氏103消泡剂按照0.3%的比例加入；发酵12小时后，每4个小时取一次样进行测定。发酵培养基中包括以下质量百分数的含碳化合物和含氮化合物:无水葡萄糖13%，玉米浆3.7%，硫酸铵2%，醋酸铵1.5%，磷酸二氢钾0.1%，硫酸镁0.04%,蛋氨酸0.07%,异亮氨酸0.006%，谷氨酸0.042% ;发酵培养基中微量元素和维生素的添加量为VB1 300ug/L、VH50ug/L。
[0019]该实验例进行L-亮氨酸生产的发酵时间为55小时，L-亮氨酸产量为29.7g/L。
[0020]将对比实验例的发酵时间和产量与实施例1和2对比可知，本发明提供的发酵生产L-亮氨酸的方法能够使发酵周期由原来的50小时缩短至35小时，产酸单位由原来的30g/L增加到38g/L，效果十分显著。
【权利要求】
1.一种发酵生产L-亮氨酸的方法，其特征在于:包括以下步骤: 在摇瓶中装入LB培养基，接入斜面菌种，然后将摇瓶置于摇床上在搅拌速度为110r/min，温度为31°C条件下，培养28h，得到种子液，备用；然后按照10%接种量将种子液接入有发酵培养基的发酵罐中，并在温度为31-32°C条件下进行发酵培养； 发酵过程中，通过控制搅拌转速和风量，使发酵过程的前20h溶解氧为6-8mg/L，20h之后溶解氧为3-6mg/L ;通过自动流加氨水控制发酵过程的pH，在菌体0D值达到25之前控制pH为6.4-6.7，菌体0D值增长到25后，pH每小时提高0.1，直至提高到7.2后保持不变；发酵结束后提取和精制L-亮氨酸，即完成L-亮氨酸的发酵生产。
2.如权利要求1所述的一种发酵生产L-亮氨酸的方法，其特征在于:所述的发酵培养基中包括以下质量百分数的含碳化合物和含氮化合物:无水葡萄糖0-3%、玉米浆3-6%、硫酸铵1-1.5%、醋酸铵0.7-1.0%、磷酸二氢钾0.05-0.1%、硫酸镁0.2-0.3%、蛋氨酸0.04%、异亮氨酸0.006%和谷氨酸0.07%ο
3.如权利要求1或2所述的一种发酵生产L-亮氨酸的方法，其特征在于:所述的发酵培养基中微量元素和维生素的添加量为VBi 300ug/L、VH50 ug/L、FeS04 0.02-0.05mg/L、MnS04 0.01-0.03mg/L 和 ZnS04 0.02-0.05mg/L。
4.如权利要求1所述的一种发酵生产L-亮氨酸的方法，其特征在于:发酵过程中控制残糖的质量百分数为0.005-0.05%。
5.如权利要求1所述的一种发酵生产L-亮氨酸的方法，其特征在于:所述的发酵培养基中，外加其重量0.3%的消泡剂。
【文档编号】C12R1/13GK104404095SQ201410666558
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2014年11月20日 优先权日:2014年11月20日
【发明者】刘帅, 李静, 宋朋睿 申请人:河南巨龙生物工程股份有限公司