一种林麝复合微生态冻干制剂的制备方法及应用与流程

本发明属于微生态饲料添加剂，涉及一种林麝复合微生态冻干制剂的制备方法及其应用。
背景技术：
：林麝(moschusberezovskii)别名香獐、林獐、麝鹿等。它不仅是国家一级保护珍稀野生动物，而且也是珍贵药用麝属动物之一。然而在利益的驱使下，大肆滥捕，致使野生林麝数量急剧下降。人工养殖是麝类资源保护的主要对策之一，虽然我国从1953年以来就开展了人工养麝保护及利用麝资源的研究，但由于疾病对人工规模化、产业化养麝的困扰，仍然没有形成规模化养殖，其中仔麝肠炎是引起仔麝死亡的严重疾病之一，幼麝在产下一周后逐渐发生，轻者含奶瓣、糊状，加重后逐渐变黄、变稀、带粘液、带血丝，粪便具有恶臭味，幼麝精神萎靡、食欲减退、脱水、受蚊虫追逐、体质衰弱，发病率从20%-30%不等，病死率为30%，日龄越小死亡率越高。因此，从根本上解决长期困扰人工规模化养麝快速发展的麝肠炎疾病已迫在眉睫。虽然药物在治疗仔麝肠炎上大量应用，但是仍然不能根本解决问题，而且抗生素的滥用导致诸多的不良反应，如：诱发细菌耐药、导致二重感染、损害动物机体组织器官、破坏肠道正常菌群以及动物源食品的安全隐患及环境污染等问题。目前，滥用抗生素已成为一个世界性的问题，我们迫切需要解决这一问题。随着动物微生态学的不断发展，以有益微生物菌群研制开发的饲用微生态制剂，作为一类新型绿色无公害饲料添加剂已被广泛应用于畜牧业等各个领域。研究表明，与抗生素相比，微生态制剂具有提高畜禽生产能力、无毒、无耐药性、无药物残留等诸多优点，是抗生素的有益替代品，在未来畜牧业发展中有着广泛的应用前景。但是在生产实践中乳酸菌菌种保藏成活率较低，乳酸菌活菌数的降低，达不到预期效果。冷冻干燥法具有其他方法无法比拟的优点，其保存期长，是制备和保存菌种的最有效的方法之一，得到越来越广泛的应用。冷冻干燥法(简称“冻干法”)，其基本原理是菌体与保护介质混溶，在共溶点以下预冻，然后在低于三相点压力的高度真空下，使菌品中的冰品升华，除去菌品中的多余水分，获得一定含水量的干燥发酵剂，使菌种的新陈代谢活动处于高度静止状态，菌体细胞结构成分保持原来状态。本发明通过对林麝复合微生态制剂的冻干保存方法的探索，使菌株的活力更好的得以延续，有助于保持它们原有的生物学特性，利用临床实践中的应用。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种林麝复合微生态制剂的冻干保存方法，理想的微生态制剂标准的其中一条指出活菌含量至少应达108cfu/ml，经复合微生态制剂冻干保存的活菌数监测试验表明，随着储存时间的推移，微生态制剂活菌数呈现出明显下降的趋势，在-20℃冰箱中冻干保存135d后下降到1.08×108cfu/ml，该林麝复合微生态制剂的冻干保存方法解除了在运输过程中和实际生产中保存条件的限制。此外，通过复合微生态制剂在小鼠和腹泻林麝上的应用试验表明，冻干保存后的林麝复合微生态制剂，在小鼠肠内能快速增值，对腹泻林麝达到了缓解、治疗的效果。通过以上试验为该复合微生态制剂在林麝上的应用提供了依据，因此该复合微生态制剂具有较大的应用价值。具体实施步骤：1.林麝复合微生态冻干制剂的制备方法。1）15%冻干保护剂的配制：分别称取10g脱脂乳，5g蔗糖，定容至100ml，121℃，15min灭菌备用。2）复合微生态制剂的制备：分别将s2（植物乳酸菌）、s3（嗜酸乳杆菌）、mrs2-2（明串球菌）3株乳酸菌在mrs固体培养基经37℃，厌氧培养48h后，每个平板分别加入2ml的冻干保护剂，用无菌棉签洗下三种乳酸菌培养物，各自分别装入无菌锥形瓶中，混匀。之后三种乳酸菌分别进行平板计数，计数完毕，三种不同的乳酸菌按照1:1:2的比例混匀，吸取1ml（3.78×1010cfu/ml）入安瓿瓶中，制得复合微生态制剂。3）复合微生态制剂的真空抽干：把装有复合微生态制剂的安瓿瓶置于-20℃冰箱冷冻12h，取出置于抽干机中进行真空抽干24-48h，之后取出复合微生态制剂立刻进行封口，封口完毕后置于-20℃冰箱保存备用。具体实施方式实施例一：林麝复合微生态冻干制剂的制备方法及其应用的检测。1.性状检测对按上述方法制得的林麝复合微生态冻干制剂进行性状检测，冻干制剂为淡黄色粉末。2.卫生指标的检测对制备得到的林麝复合微生态冻干制剂进行卫生指标的检测，包括有害化学物质指标的检测，比如铅（pb）、汞（hg）、镉（cd）、砷（总砷）、黄曲霉素b1的允许量，和有害或致病微生物的检测，比如杂菌和致病性大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌等。以上各项指标分别根据国标《微生物饲料添加剂技术通则(ny/t1444—2007)》提出的卫生指标要求和检测方法进行的检测，检测结果表明，林麝复合微生态制剂冻干制剂符合卫生指标的标准。3.芽孢杆菌的检测对芽孢杆菌的检测参照国标《食品卫生微生物学检验菌落总数测定(gb/t4789.2—2003)》，检测结果表明，林麝复合微生态制剂冻干制剂符合卫生指标的标准。4.林麝复合微生态冻干制剂活菌数检测将制备完成的林麝复合微生态冻干制剂和林麝复合微生态液态制剂分为a、b两个组（两组的活菌数均为3.78×1010cfu/ml），两组微生态制剂均存放于-20℃条件下，每隔15d进行活菌数检测，林麝复合微生态制剂不同剂型活菌数随时间变化结果图1。由图1所示，林麝复合微生态冻干制剂在-20℃条件下保存，随着储存时间的推移，微生态制剂活菌数呈现明显的下降趋势。当存放时间至45d时，a组的活菌数下降到1.13×109cfu/ml，而b组的活菌数下降到6.35×107cfu/ml。理想的微生态制剂标准的其中一条指出活菌含量至少应达108cfu/ml；由此，我们选择对林麝复合微生态制剂进行剂型改进，把林麝复合微生态制剂制备成冻干制剂，并置于-20℃条件下进行保存。当存放时间至135d后a组活菌数下降到1.08×108cfu/ml，所以，此复合微生态制剂的保存期为135d。5.安全性检验取5周龄的spf级balb/c小鼠16只，体重22-24g，雌雄各半，购自成都达硕实验动物有限公司，24只小鼠被随机分成a、b两组，每组8只；其中a组为安全检验试验组，b组为空白对照组。小鼠正常饲养观察5d无异常后进行安全检验试验，a组小鼠每天每只使用0.2ml复合微生态制剂灌胃1次，连续7d。b组小鼠每天每只以相同剂量的生理盐水灌胃1次，连续7d，仔细观察小鼠的精神饮食和粪便情况。试验结果表明，a组小鼠与b组一样，精神状况、饮食情况及粪便状况均正常，无异常临床反应。在试验结束的前1d，禁食，自由饮水，将小鼠全部处死，解剖，肉眼观察发现a组与b组相比各个器官没有异常变化，无菌操作取胃、十二指肠、空肠、回肠、结肠、直肠以及盲肠，生理盐水冲洗后，置于4%中性甲醛溶液中进行固定，包埋，切片，常规he染色，镜下观察各组织器官的切片。a组小鼠组织器官切片（胃、十二指肠、空肠、回肠、结肠、直肠以及盲肠）均未见病理变化（见图2-图8）。6.小鼠复合微生态制剂的应用取5周龄的spf级balb/c小鼠24只，体重22-24g，雌雄各半，购自成都达硕实验动物有限公司。24只小鼠被随机分成2大组，4小组，每组6只；2大组分别为a组、生理盐水对照组，小鼠在正常饲养观察5d无异常后进行试验，a组饲喂林麝复合微生态制剂，对照组则饲喂灭菌生理盐水，复合微生态制剂的活菌数为5.64×109cfu/ml，每天每只小鼠0.2ml灌胃，生理盐水组以相同剂量灌胃，相同制剂的两组小鼠，一组在连续饲喂7d后处死，另外一种在连续饲喂14d后处死。剖解，无菌操作采集小鼠盲肠内新鲜内容物，称重。按每0.1g粪便加1ml无菌生理盐水的比例混匀粪便，置于无菌ep管中，充分振荡混匀，用无菌生理盐水做10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7梯度稀释，取各稀释度菌液10μl点种在mrs平板，每个稀释度做3个平行平板，置于37℃培养箱中厌氧培养48h，然后选取菌落数在10-100范围内的平板，进行活菌计数，计算出每克粪样的活菌数。最后数据用spss软件进行单因素方差分析。如表1所示，小鼠在饲喂林麝复合微生态冻干制剂后，盲肠乳酸菌数显著高于空白组。表1小鼠盲肠内容物乳酸菌总数的检测结果时间空白组复合微生态制剂组7d（4.53±1.43）×109（3.18±1.56）×10914d（5.96±3.01）×108（5.56±1.37）×1097.林麝复合微生态制剂效力的检测林麝是国家一级野生保护动物，本研究无法统一对林麝进行攻毒来判断复合微生态制剂的治疗效果。该试验给临床上出现腹泻的11只林麝饲喂复合微生态制剂，每天一次，每次1支（3.78×1010cfu/ml），连续饲喂7d，其中有9只林麝在使用复合微生态制剂在3d或4d后，食欲增加，精神状况开始恢复正常，粪便由不成形变为颗粒状。林麝临床使用剂量：成年林麝饲喂复合微生态冻干制剂为1ml/d，连用7d。附图说明图1是复合微生态制剂活菌数的变化曲线图2是胃的石蜡切片观察图，未见组织病理学变化，(h&e,400×)图3是十二指肠的石蜡切片观察图，未见组织病理学变化，(h&e,400×)图4是空肠的石蜡切片观察图，未见组织病理学变化，(h&e,400×)图5是回肠的石蜡切片观察图，未见组织病理学变化，(h&e,400×)图6是结肠的石蜡切片观察图，未见组织病理学变化，(h&e,400×)图7是直肠的石蜡切片观察图，未见组织病理学变化，(h&e,400×)图8是盲肠的石蜡切片观察图，未见组织病理学变化，(h&e,400×)当前第1页12